СПОСОБ КОРРЕКЦИИ ПОСТИШЕМИЧЕСКОЙ КОГНИТИВНОЙ ДИСФУНКЦИИ Российский патент 2008 года по МПК A61K38/21 

Изобретение относится к медицине, а именно к патофизиологии, и может быть использовано для предотвращения развития неврологического, в том числе когнитивного, дефицита, индуцированного ишемией головного мозга.

Известны различные способы профилактики и лечения ишемического повреждения головного мозга, например путем использования ингибиторов поли(АДФ-рибозил)полимеразы (J-H.Li, 2001, US patent 6291425; Р.И.Ижбульдин, 2004, патент РФ 2279878, МПК А61К 31/455, А61Р 9/10, 20.07.2006), препаратов стероидных гормонов (эстроген) (J.W.Simpkins, 2002, US patent 6339078), лигандов периферических бензодиазепиновых рецепторов (K.W.Gee, 1996, US patent 5550124), лигандов аденозиновых рецепторов (V.Lubitz, 2001, US patent 6316423), интрацеребальной трансплантации гемопоэтических клеток (Д.Прайс, 2000, патент РФ 2216336, МПК А61К 35/48, А61Р 25/00, 20.11.2003).

Развитие моторной, сенсорной и когнитивной недостаточности - основные проявления постишемической нейрональной дисфункции. В механизмах развития когнитивного дефицита значительная роль отводится нарушениям процессов синаптической пластичности, индукции запрограммированной гибели нейронов и глиальных клеток, механизмов синтеза, секреции и рецепции нейротрансмиттеров, что является следствием нарушения рецепторных и пострецепторных механизмов внутриклеточной сигнализации и межклеточной коммуникации, изменения активности и экспрессии ионных каналов плазматической мембраны, митохондриальных мембран, приводящее к быстрым или долгосрочным нарушениям электровозбудимости нейронов, развития митохондриальной дисфункции, сопряженной с нарушением энергопродуцирующей и кальций-депонирующей функции митохондрий, прогрессией апоптоза вследствие дисрегуляции клеточных сигнальных систем или активации специфических механизмов, приводящих к реализации программы клеточной гибели, а также нарушения нейрон-глиальных взаимодействий. Нарушения памяти и других когнитивных функций оказывают клинически значимое влияние на поведение и повседневную активность людей, перенесших острое ишемическое повреждение головного мозга. Вместе с тем, до сих пор не существует удовлетворительного лечения и профилактики когнитивного дефицита, индуцированного ишемией.

В числе факторов, определяющих чувствительность клеток к действию индукторов апоптоза (в том числе ишемии), - метаболизм никотинамидадениндинуклеотида (НАД) и состояние внутриклеточного гомеостаза кальция. НАД функционирует не только в качестве кофермента, но и субстрата для ряда НАД-конвертирующих ферментов. Метаболизм НАД в клетках нейрональной природы является объектом контроля и регуляции, коль скоро состояние пула внутриклеточного НАД влияет на метаболическую активность, репликацию и репарацию ДНК, устойчивость к окислительному стрессу, электровозбудимость нейронов. Уровень НАД в нейронах определяется активностью НАД-синтезирующих ферментов, НАД-регенерирующих метаболических путей, а также НАД-конвертирующих ферментов: 1) АДФ-рибозилтрансфераз, продуцирующих аденозиндифосфат (АДФ)-рибозу, необходимую для посттрансляционной модификации интегринов, белков цитоскелета, нейрогранина, основного белка миелина, шаперонов, кальциевых аденозинтрифосфатаз, гуанозинтрифосфатсвязывающих белков и других молекул; 2) поли(АДФ)-рибозилполимеразы, функционирующей в качестве сенсора повреждения дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и регулирующей активность гистонов, ферментов репарации ДНК, топоизомераз, некоторых транскрипционных факторов, ДНК-зависимых киназ, ламина В и других белков; 3) АДФ-рибозилциклазы/НАД-гликогидролазы/CD38, представляющей собой компонент клеточных сигнальных систем, сопряженных с рецепторами ряда нейротрансмиттеров (брадикининовые, адренергические, пуринергические, гистаминовые, мускариновые ацетилхолиновые и другие), катализирующей образование циклической АДФ-рибозы (цАДФР) и адениндинуклеотидфосфата никотиновой кислоты, выполняющих функцию мобилизаторов кальция из внутриклеточных депо, а также модуляторов активности калиевых ионных каналов М-типа (European J. Biochemistry, 2000, V.267, Р.1550-1564; Cellular and Molecular Life Science, 2004, V.61, P.19-34).

Ферментативная активность АДФ-рибозилциклазы/СD38 контролируется многими факторами, в частности структурой каталитического центра и сохранностью сульфгидрильных остатков цистеина в его пределах, уровнем внутриклеточных АТФ и НАДН, внутриклеточной локализацией фермента (плазматическая мембрана, митохондриальная мембрана, ядерная мембрана, цитозоль), конформационной пластичностью и способность формировать димеры в мембране для эффективного транспорта продукта реакции действием лигандов (НАД, CD31) (Pharmacoogy & Therapeutics, 2001, V.90, P.283-296).

Экспрессия АДФ-рибозилциклазы/CD38 изменяется в процессе дифференцировки клеток и под действием физиологических и патологических стимулов. В непосредственной близости от промотора гена CD38 находятся участки связывания ряда транскрипционных факторов, в частности PEA-3, CH-2, PuF. В клетках различной природы экспрессия CD38 регулируется ретиноевой кислотой, трийодтиронином, эстрогенами, глутаматом, интерлейкинами, а продукция циклической АДФ-рибозы - гормонами/нейротрансмиттерами, оксидом азота, цинком, НАДН (Central Nervous System Agents in Medicinal Chemistry, 2006, V.6, P.193-210).

Стимуляция экспрессии CD38 обнаруживается при нейрон-глиальных взаимоотношениях, она обусловлена действием глутамата. Гиперэкспрессия CD38 в астроцитах может быть ответственна за развитие деменции, например, при ВИЧ-инфекции, в то же время известно, что квантовое высвобождение глутамата необходимо для формирования эффективных синаптических сетей (но не для дифференцировки нейронов), при этом прегненолон стимулирует когнитивные функции за счет стимуляции такого высвобождения глутамата из нейронов.

Другой, не менее значимой, группой модуляторов экспрессии CD38 являются цитокины, в частности интерферон. Он обладает, по данным ряда авторов, модулирующей активностью в отношении клеток нейрональной и глиальной природы, в частности было показано, что гамма-интерферон индуцирует нейритогенез и вовлечен в нейрональную дифференцировку и апоптоз, регулирует электровозбудимость нейронов, участвует в регуляции межклеточной коммуникации в центральной нервной системе, регулирует процессы дезорганизации синапсов (J.Biological Chemistry, 2005, V.280, P.12896-12901; J. Neurophysiology, 2005, V.93, P.843-852).

В настоящее время в литературе отсутствуют данные о модулирующем действии интерферона в отношении экспрессии АДФ-рибозилциклазы в клетках центральной нервной системы, однако ряд косвенных данных позволяют предположить наличие такого эффекта. В частности, известно, что интерферон-гамма регулирует микроглиально-астроцитарные взаимодействия за счет модуляции кальциевого обмена и высвобождения АТФ. В различных регионах мозга экспрессируются рецепторы к интерферону-гамма (кора, таламус, гипоталамус, ноцицептивные зоны). Однако избыточная хроническая продукция интерферона-гамма (вместе с фактором некроза опоухолей) клетками периферической крови (в частности, при болезни Альцгеймера) коррелирует с выраженностью когнитивного дефицита, постулируется негативный характер влияния гамма-интерферона при ишемическом поражении головного мозга (Circulation, 2006, V.113, P.2105-2112; Pediatric Research, 2005, V.57, P.282-286).

Направленная модуляция активности НАД-конвертирующих ферментов является перспективным направлением развития фармакотерапии при ишемическом повреждении тканей. Так, нейропротекторное действие никотинамида ассоциируют с торможением активности поли(АДФ)-рибозилполимеразы, что предупреждает истощение внутриклеточного НАД и развитие гибели клеток. Вместе с тем, остаются не изученными вопросы, касающиеся возможности направленной модуляции АДФ-рибозилциклазы/СD38 для достижения нейропротекторного и корригирующего действия при повреждении клеток центральной нервной системы. Кроме того, существуют данные о проявлении никотианмидом нейротоксического эффекта, что заставляет критически оценивать возможности применения этого препарата в высоких дозах, как это обычно используется в протоколах нейропротекции.

Известен способ защиты головного мозга в реконструктивной хирургии сонных артерий (Р.И.Ижбыльдин, патент РФ 2279878, МПК А61К 31/455, А61Р 9/10, 20.07.2006), при котором за 10 минут до окклюзии сонных артерий в общую сонную артерию осуществляют введение раствора никотинамида. Это обеспечивает защиту головного мозга от ишемического повреждения и повышает эффективность интраоперационной защиты головного мозга. Недостатком указанного способа является вероятность проявления нейротоксической активности никотинамида, характерной для его высоких доз, и отсутствие направленного действия в отношении когнитивных функций в постоперационном периоде после окклюзии сонных артерий.

Наиболее близким к предлагаемому является способ улучшения когнитивной функции, при котором животным с моделью ишемической когнитивной дисфункции (перевязка сонных артерий) осуществляют введение в течение 7 дней янтарнокислого бис[(2-гидроксиэтил)-N,N,N-триметиламиния, позволившее сохранить когнитивные функции у экспериментальных животных на уровне, близком к исходному (без ишемии головного мозга) (И.А.Помыткин, патент РФ 2281766, А61К 31/205, А61Р 25/28, 20.08.2006). Недостатком указанного способа является использование препарата, улучшающего когнитивную функцию, в постишемическом периоде, что не позволяет осуществлять профилактику нейрональной дисфункции в ситуациях, где острая ишемия головного мозга является прогнозируемым событием (например, при кардиохирургических и цереброваскулярных вмешательствах). Кроме того, представленный способ не достигает цели коррекции моторной и сенсорной дисфункции у млекопитающих, перенесших ишемию головного мозга.

Задача изобретения - эффективность профилактики и коррекции когнитивной дисфункции при ишемическом повреждении головного мозга.

Поставленную задачу решают за счет того, что в течение 3 дней до кклюзии общей сонной артерии млекопитающему вводят внутрибрюшинно препарат гамма-интерферона в дозе 5000 МЕ/кг массы, 1 раз в сутки.

Способ коррекции постишемической когнитивной дисфункции осуществляют следующим образом: в течение 3 дней до проведения экстравазальной унилатеральной окклюзии общей сонной артерии экспериментальным животным внутрибрюшинно вводят раствор гамма-интерферона из расчета 5000 МЕ/кг массы, 1 раз в сутки как модулятор экспрессии АДФ-рибозилциклазы СD38 в ткани головного мозга.

Предлагаемый способ иллюстрируется следующим примером.

Эффект предотвращения и коррекции когнитивной дисфункции при введении гамма-интерферона оценивали на модели крыс с острой ишемией головного мозга, вызванной экстравазальной унилатеральной окклюзией общей сонной артерии. Эта модель соответствует нарушению когнитивных функций при цереброваскулярной патологии, кардиохирургических и сосудистых вмешательствах. Моделирование острой ишемии головного мозга in vivo осуществлялось на белых беспородных крысах-самцах массой 220-240 г (n=250), содержащихся в стандартных условиях вивария, с соблюдением правил гуманного обращения с животными. Критерием включения в группы наблюдения было нормальное исходное состояние неврологического статуса и когнитивных функций (до проведения эксперимента): 0 баллов - по шкале Neurological Severity Scores (NSS), менее 15 сек - по тесту «Водный лабиринт Морриса» (British J. Radiology, 1999, V.72, P.1196-1201; J. Neuroscience, 2002, V.22, P.1436-1442).

Животные были разделены на группы: 1) контрольная: введение ингаляционного анестетика для исключения влияния общей анестезии на характеристики оцениваемых параметров; 2) экспериментальная 1: моделирование острой ишемии осуществляли после проведения общей анестезии путем экстравазальной окклюзии правой сонной артерии с последующей оценкой всех тестируемых параметров через 24 часа после операции; 3) экспериментальная 2: моделирование острой ишемии осуществляли после проведения общей анестезии путем экстравазальной окклюзии правой сонной артерии с последующей оценкой всех тестируемых параметров через 48 часов после операции; 4) экспериментальная 3: моделирование острой ишемии осуществляли после проведения общей анестезии путем экстравазальной окклюзии правой сонной артерии с последующей оценкой всех тестируемых параметров через 7 суток после операции; 5) экспериментальная 4: моделирование острой ишемии осуществляли после проведения общей анестезии путем экстравазальной окклюзии правой сонной артерии с предшествующим интраперитонеальным введением гамма-интерферона (5000 ME/кг, 1 раз в сутки, 3 дня) и оценкой всех тестируемых параметров через 24 часа после операции; 6) экспериментальная 5: моделирование острой ишемии осуществляли после проведения общей анестезии путем экстравазальной окклюзии правой сонной артерии артерии с предшествующим интраперитонеальным введением гамма-интерферона (5000 ME/кг, 1 раз в сутки, 3 дня) и оценкой всех тестируемых параметров через 48 часов после операции; 7) экспериментальная 6: моделирование острой ишемии осуществляли после проведения общей анестезии путем экстравазальной окклюзии правой сонной артерии с артерии с предшествующим интраперитонеальным введением гамма-интерферона (5000 ME/кг, 1 раз в сутки, 3 дня) и оценкой всех тестируемых параметров через 7 суток после операции.

У животных всех тестируемых групп оценивали неврологический статус по стандартной шкале международной NSS для лабораторных животных (крыс) для уточнения степени выраженности неврологического дефицита функций в раннем (остром и подостром) постишемическом периоде. Шкалу градуировали от 0 (нормальный неврологический статус) до 18 баллов (максимальный неврологический дефицит).

Регистрацию когнитивной дисфункции у лабораторных животных осуществляли с использованием стандартного теста - водного лабиринта Морриса. Этот тест оценивает пластичность обучения (пространственную память, эквивалентную эпизодической памяти человека), регулируемую преимущественно гиппокампом.

Детекцию CD38 в клетках головного мозга осуществляли в замороженных фиксированных срезах головного мозга по стандартному протоколу иммуногистохимического исследования с использованием антител к CD38 («Сорбент», Москва). В силу наличия высокой гомологии CD38 человека, крысы, мыши вследствие высокой консервативности последовательности этого белка (Gene, 1997, V.186, Р.285-292), использовали антитела к антигену человеческого происхождения.

Статистический анализ полученных результатов включал методы статистического описания и проверки статистических гипотез. В пределах каждой выборки определяли среднее арифметическое, среднее квадратичное отклонение, ошибку среднего. При условии соответствия нормальному закону распределения оценку достоверности различий осуществляли с использованием t-критерия Стьюдента и Т-теста. Статистическая обработка результатов произведена с помощью пакетов прикладных программ STATISTICA v.6.0 [StatSoft-Russia, 1999] и BIOSTATISTICA.

Анализ данных о выраженности неврологического дефицита и его динамики в течение первых 48 часов после односторонней экстравазальной окклюзии общей сонной артерии и введения с нейропротективной целью интерферона, у наблюдаемых животных отмечена стабилизация неврологического статуса и тенденция с уменьшению неврологического дефицита через 48 часов после проведения эксперимента, что статистически значимо опережало скорость стабилизации неврологического статуса у животных, которым при сходных условиях эксперимента не вводился препарат с нейропротективной целью (р<0,05).

На чертеже 1 отображено состояние неврологического статуса экспериментальных животных в остром и подостром постишемическом периоде после унилатеральной экстравазальной окклюзии общей сонной артерии без применения протектора (А) и при использовании интерферона (Б). По вертикали - сумма баллов по шкале NSS, по горизонтали - время наблюдения (0 часов, 24 часа, 48 часов, 7 суток). Данные представлены как генеральная средняя с учетом стандартного отклонения).

Таблица 1.Состояние когнитивных функций у крыс в остром и подостром постишемическом периоде Экспериментальная группа 1Экспериментальная группа 4рМ±SD32,6±29,118,2±13,6р<0,05Медиана101295% ДИ9-1710-29Примечание:р - различия между состоянием когнитивных функций у лабораторных животных после проведения односторонней экстравазальной окклюзии общей сонной артерии.ДИ - доверительный интервалТаблица 2.Состояние когнитивных функций у крыс в остром и подостром постишемическом периоде Экспериментальная группа 2Экспериментальная группа 5рM±SD76,4±59,843,6±26,7р<0,05Медиана1203795% ДИ16-1207-49Примечание:р - различия между состоянием когнитивных функций у лабораторных животных после проведения односторонней экстравазальной окклюзии общей сонной артерии.
ДИ - доверительный интервал.

Из таблиц 1 и 2 видно, что статистически значимой когнитивной дисфункции через 24 часа и через 48 часов после односторонней экстравазальной окклюзии общей сонной артерии, но на фоне введения интерферона у наблюдаемых крыс не отмечено (р<0,05), что подтверждает эффективность гамма-интерферона как нейропротективного агента при постишемической когнитивной дисфункции.

Таблица 3.Экспрессия АДФ-рибозилциклазы в ткани головного мозга в раннем постишемическом периоде№СерияCD38+клетки1.Контроль (лобная обл.)17,40±3,312.Ишемия, 24 ч (лобная обл.)50,00+5,40****3.Ишемия, 48 ч (лобная обл.)37,75±2,08**4.Контроль (затылочная обл.)16,80±2,905.Ишемия, 24 ч (затылочная обл.)39,80±7,55***6.Ишемия, 48 ч (затылочная обл.)50,80±8,71****7.Ишемия, 24 ч + Интерферон (лобная обл.)57,5±1,398.Ишемия, 48 ч + Интерферон (лобная обл.)48,75±4,00** (по сравнению с серией 3)9.Ишемия, 24 ч + Интерферон (затылочная обл.)58,50±4,54** (по сравнению с серией 5)10.Ишемия, 48 ч + Интерферон (затылочная обл.)44,00±3,71

Таблица 3 позволяет сделать вывод о том, что при использовании гамма-интерферона в дозе 5000 МЕ/кг массы и при режиме внутрибрюшинного введения в течение 3 дней, предшествующих операции, 1 раз в сутки, мы обнаружили, что в течение первых 24 часов он достоверно увеличивал экспрессию CD38 в клетках головного мозга животных, перенесших экстравазальную окклюзию общей сонной артерии. В таблице 3 результаты представлены как М±m, где М - генеральная средняя, m - ошибка разности средних, Р - уровень значимости. Достоверность отличий по сравнению с контролем: * Р<0,05; ** Р<0,02; *** Р<0,01; **** Р<0,001.

Использование гамма-интерферона в протоколе, предусматривающем введение цитокина в период, предшествующий экспериментальной окклюзии общей сонной артерии, позволяет объяснить обнаруженный нами нейропротективный эффект за счет направленной регуляции экспрессии CD38 в клетках головного мозга.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о реализации нейропротективного эффекта гамма-интерферона, в том числе за счет модуляции экспрессии АДФ-рибозилциклазы/СВ38 в клетках нейрональной либо глиальной природы.

К достоинствам предлагаемого способа относятся возможность достижения профилактического эффекта в отношении моторной, сенсорной и когнитивной недостаточности при планируемой ишемии головного мозга, использование препарата гамма-интерферона коротким курсом, что исключает проявление им нейротоксической активности.

Изобретение относится к медицине, а именно к терапии и к патофизиологии. Моделируют острую ишемию головного мозга у животного путем унилатеральной экстравазальной окклюзии общей сонной артерии. При этом в течение 3 дней до окклюзии общей сонной артерии млекопитающему вводят внутрибрюшинно препарат гамма-интерферона в дозе 5000 МЕ/кг массы, 1 раз в сутки. Способ позволяет проводить профилактику когнитивной дисфункции, где острая ишемия является прогнозируемым событием. 1 ил., 3 табл.

Способ коррекции постишемической когнитивной дисфункции, включающий моделирование острой ишемии головного мозга у животного путем унилатеральной экстравазальной окклюзии общей сонной артерии, отличающийся тем, что в течение 3 дней до окклюзии общей сонной артерии млекопитающему вводят внутрибрюшинно препарат гамма-интерферона в дозе 5000 МЕ/кг массы 1 раз в сутки.