ДИНАТРИЕВАЯ СОЛЬ САЛИЦИЛУРОВОЙ КИСЛОТЫ, ОБЛАДАЮЩАЯ ЦЕРЕБРОПРОТЕКТИВНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2015 года по МПК C07C235/52 C07C235/60 A61P25/28 

Изобретение относится к новым производным салицилуровой кислоты и его применению как церебропротективного средства.

Сосудистые заболевания головного мозга в последние десятилетия превратились в важнейшую медицинскую и социальную проблему. В связи с этим поиск и изучение нейропротективных средств, применяемых для профилактики и лечения цереброваскулярной патологии, является одним из актуальных и приоритетных направлений не только современной фармакологии, но и кардиологии и неврологии [И.В. Полевик, В.И. Мамчур. Церебропротективные эффекты ницерголина при моделировании преходящих расстройств мозгового кровообращения. Мистецтво лiкування. №3 (79), 2011, c. 53-56].

В медицинской практике среди используемых салициламидов известны отдаленные аналоги заявляемого соединения, такие как салициламид (CAS 65-45-2), который назначают внутрь в качестве болеутоляющего и жаропонижающего средства, оксафенамид (CAS 526-18-1) - усиливает образование и выделение желчи, оказывает спазмолитическое действие и снимает или уменьшает спазмы желчевыводящих путей, тиаприд и султоприд оказывают антидофаминергическое действие, которые применяют наружно в качестве обезболивающих и противовоспалительных средств, натриевая соль салициловой кислоты (энтерсалил, диуретин, натрия салицилат, CAS 54-21-7) оказывает аналгезирующее, жаропонижающее и противовоспалительное действие [Машковский М.Д. Лекарственные средства: Пособие для врачей. - T.1. - М.: Новая волна. - 2002. - с. 74, 167, 318, 504]. Наряду с перечисленными терапевтическими эффектами, которые проявляются практически во всех физиологических системах организма, салициловая кислота и ее производные оказывают также нейротропное воздействие [Коренюк И.И. Влияние салициловой кислоты и ее солей на электрическую активность нейронов виноградной улитки / И.И. Коренюк, Д.Р. Хусаинов, В.Ф. Шульгин // Нейрофизиология. - 2005. - Т. 37, №2. - С. 142-150]. Однако в медицинской практике отсутствуют препараты СК, которые обладали бы ноотропным действием. Салицилуровая кислота (CAS 487-54-7) в медицинской практике не используется, однако имеются сообщения, что некоторые ее бионеорганические производные проявляют инсулино-подобное действие [Salicylamide and salicylglycine oxidovanadium complexes with insulin-mimetic properties / Nils son J., et. al. //J. Inorg. Biochem. 2011; 105(12), pp. 179 5-800], [US 7429564].

Важная физиологическая роль гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) в регуляции функциональной активности ЦНС определяет перспективность создания на ее основе нейропсихотропных лекарственных средств. Однако в силу ряда физико-химических свойств препараты, в частности ГАМК (CAS 56-12-2, аминалон, гаммалон), обладают низкой биодоступностью, что является причиной их невысокой эффективности. Низкая биодоступность незамещенных аминокислот, в том числе, линейной ГАМК, объясняется их высокой полярностью - при физиологических значениях рН такие вещества существуют в виде биполярных ионов, вследствие чего плохо проникают через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). На сегодняшний день в медицинской практике успешно применяются линейные аналоги ГАМК: γ-амино-β-фенилмасляная кислота (CAS 1078-21-3, фенибут) как ноотропный препарат и транквилизатор, γ-амино-β-(п-хлорфенил)масляная кислота (баклофен) как центральный миорелаксант, N-никотиноил-γ-аминомасляная кислота (пикамилон) как ноотроп и средство, улучшающее мозговое кровообращение и др. Широко используются и циклические аналоги ГАМК: 2-оксо-1-пирролидинацетамид (пирацетам) - родоначальник группы ноотропов, N-карбамоил-метил-4-фенил-2-пирролидон (фенотропил) - ноотроп с нейропротекторным и нейромодулирующим действием [Сравнительное экспериментальное изучение ноотропных свойств аналога ГАМК фенибута и его метилового эфира / Багметова В.В., Бородкина Л.Е., Тюренков И.Н., Берестовицкая В.М., Васильева О.С.// Фундаментальные исследования. 2011. №10 (3). c. 467-471] и др. Глицин (аминоуксусная кислота, CAS 56-40-6) применяется как средство, повышающее умственную работоспособность и уменьшающее психоэмоциональное напряжение [Машковский М. Д. Лекарственные средства: Пособие для врачей. - T.1. - М.: Новая волна. - 2002. - с. 167, 318].

Цель изобретения заключается в получении высокоэффективного производного салицилуровой кислоты, сочетающего основные эффекты, присущие церебропротективным средствам и характеризующегося низкой токсичностью и действующего в малых дозах.

Сущность изобретения заключается в синтезе водорастворимой динатриевой соли салицилуровой кислоты (салицилурат динатрия) формулы

и использования ее в качестве церебропротективного средства.

Пример 1. Салицилуровая кислота (N-салицилоилглицин) может быть получена по известной методике [RU 2495867]. Затем в реакторе смешивают 200 ммоль этилата натрия, 70 г толуола или бензола и 100 ммоль салицилуровой кислоты и перемешивают 30 мин при температуре бани 100°С с защитой от влаги и углекислого газа. После охлаждения продукт отделяют фильтрованием, промывают 10%-ным спиртовым раствором NaOH и сушат в сушильном шкафу до постоянной массы. Получают динатриевую соль салицилуровой кислоты (динатрия салицилурат) в виде белого кристаллического вещества. Выход - 23.42 г (98%). Т. пл. = 325°С (разл.). C₉H₇NNa₂O₄: вычислено, %: С 45.20, Н 2.95, N 5.86, Na 19.23, найдено, %: С 45.19, Н 2,94, N5.85.Na 19.21

Пример 2. Церебропротективное действие салицилурат динатрия в условиях ишемического повреждения мозга при необратимой одномоментной двухсторонней окклюзии общих сонных артерий.

Исследование выполнено на беспородных крысах-самцах 180-200 г, 3,5-4-месячного возраста, доставленных из питомника ФГУП "НИИ ГТП" ФМБА России (г. Волгоград). Полученных из питомника лабораторных животных подвергали карантину в течение 7 дней. Животные содержались в стандартных условиях вивария с соблюдением правил надлежащей лабораторной практики. Для моделирования ишемического повреждения головного мозга у крыс была выбрана модель необратимой одномоментной двухсторонней окклюзии общих сонных артерий [Мирзоян Р.С. Методические рекомендации по доклиническому изучению лекарственных средств для лечения нарушений мозгового кровообращения и мигрени //Руководство по доклиническому изучению лекарственных средств / Под. ред. А.Н. Миронова Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.]. У крыс, наркотизированных хлоралгидратом (400 мг/кг внутрибрюшинно), на передней поверхности шеи обрабатывалось операционное поле, после чего депилировался шерстяной покров и производился разрез кожных покровов по средней линии шеи. Далее отделяя блуждающий и симпатический нервы, проходящие вместе с артериями, тупым способом выделялись обе общие сонные артерии. Под каждую подводились лигатуры и производилась одномоментная перевязка обеих сонных артерий (группе ложнооперированных животных лигатуры подводились, но их перевязка не производилась). Далее рана ушивалась и обрабатывалась раствором антисептика. Продолжительность хирургических манипуляций с одной крысой не превышала 7-10 минут. До выхода животных из наркоза каждая крыса, для исключения травмирования другим животным, помещалась в отдельную клетку. В ходе исследования были сформированы следующие группы по 20 животных в каждой (за исключением контрольной, которая включала 30 крыс): 1) ЛО (ложнооперированные) крысы - с данной группой животных выполнялись все манипуляции как и с группой контоль-ишемия, однако после подведения лигатур под общие сонные артерии они не затягивались; 2) контроль-ишемия - крысы, которым выполняли одномоментную двустороннюю окклюзию общих сонных артерий (ОСА) и получавшие физиологический раствор; 3) ишемия + салицилурат динатрия - животные с двусторонней ОСА, получавшие салицилурат динатрия в дозе 8 мг/кг; 4) ишемия+фенибут - животные с двусторонней ОСА, получавшие фенибут в дозе 25 мг/кг; 5) ишемия + глицин - животные с двусторонней ОСА, получавшие соединение глицин в дозе 10 мг/кг. Салицилурат динатрия и препараты сравнения (фенибут, глицин) вводились внутрибрюшинно за 30 минут до наложения лигатур на общие сонные артерии и через 2 часа после проведения операции. Для оценки церебропротективного действия салицилурата динатрия при ишемическом повреждении головного мозга были использованы следующие критерии: выживаемость животных в течение 72 часов после моделирования патологии; суммарный балл неврологического дефицита; наличие или отсутствие когнитивного дефицита, снижение двигательной и ориентировочно-исследовательской активности. Регистрацию выживаемости и выраженности неврологического дефицита у животных осуществлялась на 6, 12, 24, 48 и 72 час после операции. Неврологический статус животных определялся по шкале McGrow в модификации И.В. Ганнушкиной. При наличии у животных нескольких симптомов неврологического дефицита тяжесть состояния определялась как сумма соответствующих балов. Дополнительно для оценки поведения животных, а также когнитивных функций использовались стандартные психофармакологические тесты: «Открытое поле» (ОП), «условная реакция пассивного избегания» (УРПИ) и «тест экстраполяционного избавления» (ТЭИ), исследование животных в которых проводилось через 72 часа после окклюзии ОСА.

Тест «открытое поле» (ОП) [Хаунина Р.А., Лапин И.П. 1976 г., Воронина Т.А. 1982] предназначен для изучения поведения грызунов в новых условиях и позволяет оценить: выраженность и динамику отдельных поведенческих элементов; уровень эмоционально-поведенческой реактивности животного; стратегию исследовательского/оборонительного поведения; симптомы неврологического дефицита. Тестируемое животное помещается в центр круглой белой арены хвостом к экспериментатору. Визуальный контроль за поведением животного проводили в течение 3-х минут, фиксировались следующие показатели: число пересеченных секторов, количество стоек (учитывали и закрытые и открытые стойки), количество обследованных отверстий-норок [Воронина Т.А., Островская Р.У., 2000]. Об ориентировочно-исследовательской активности судили по сумме стоек и заглядываний в отверстия, а по количеству пересеченных секторов - о спонтанной двигательной активности.

Методика оценки условного рефлекса пассивного избегания» (УРПИ) является базисной моделью для выявления специфической ноотропной активности веществ. [Воронина Т.А., Островская Р.У., 2000]. Она используется для оценки влияния веществ на формирование, сохранение и воспроизведение памятного следа в норме и в условиях его нарушения. Данная методика выполнялась следующим образом:

1) формирование рефлекса пассивного избегания - крысу помещали в освещенный отсек (лампа мощность 100 Вт) в центральную зону, хвостом к отверстию в темный отсек, обследовав светлый отсек крыса переходила в темный, через электрический пол которого подавался ток 40 В, 3 импульса по 1 с, с интервалом 0,5 с, тем сам животные получало электроболевое раздражение. За животным наблюдали в течение 3-х минут, если оно вновь заходило в темный отсек электроболевое раздражение наносили повторно, крысы которые не заходили - из эксперимента исключались. Фиксировались следующие показатели: латентный период (ЛП) первого захода в темный отсек (время от момента помещения животного в середину площадки до первого захода в темный отсек) и количество заходов в него;

2) контроль выработки рефлекса - все животные повторно не должны заходить в темный отсек установки, зашедшие животные исключались из эксперимента;

3) воспроизведение навыка пассивного избегания - на данном этапе в отличие от этапа обучения, если животное заходило в темный отсек, то электроболевое раздражение не наносили. Регистрировались аналогичные показатели, что и при обучении плюс общее время, проведенное в темном отсеке.

«Тест экстраполяционного избавления» (ТЭИ) предназначен для изучения когнитивных функций грызунов в условиях аверсивной среды и позволяет оценить: индивидуальные различия когнитивного стиля решения задачи (поиска пути активного избавления из аверсивной среды). Фиксировался ЛП подныривания (время от момента погружения животного в воду до подныривания под края цилиндра). Также как и тест УРПИ методика включает в себя этап обучения навыка (выработка рефлекса избавления) и этапа его воспроизведения через 24 часа. Животные, не решающие задачу за время наблюдения на этапе обучения, исключаются из опыта.

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета прикладных программ Microsoft Excel и BioStat 2008 5.2.5.0. с использованием критерия Краскела-Уоллеса с последующим тестом по Данну, точного критерия Фишера.

Результаты

Ишемическое повреждение головного мозга крыс путем необратимой окклюзии общих сонных артерий приводило к гибели животных. Так в группе контроль-ишемия через 72 часа после моделируемой патологии выживаемость составила 33%. Салицилурат динатрия в дозе 8 мг/кг уменьшал гибель крыс после перевязки сонных артерий по сравнению с группой негативного контроля (контроль-ишемия) (таблица 1). Оказываемое им защитное действие было сопоставимо с таковым у фенибута, и превосходило у глицина.

Динамика неврологического дефицита в течение 72 часов после моделирования патологии представлена в таблице 2. Как видно из представленных данных, выраженность неврологического дефицита по шкале McGrow (в баллах) животных после необратимой окклюзии сонных артерий (ОСА) на фоне введения салицилурата динатрия и препаратов сравнения был меньше, чем в группе контроль-ишемия.

При оценке неврологического дефицита у животных в тестах ОП, УРПИ и ТЭИ было установлено, что превентивное введение салицилурата динатрия достоверно препятствовало возникновению выраженных нарушений локомоторной и ориентировочно-исследовательской активности животных, в большей степени устраняло нарушения памяти, вызванные необратимой окклюзией общих сонных артерий (таблица 3).

Таким образом, салицилурат динатрия оказывает церебропротективное действие, увеличивая выживаемость животных и снижая выраженность у них неврологических нарушений по сравнению с группой контроль-ишемия в условиях ишемического повреждения головного мозга, вызываемого одномоментной перевязки обеих сонных артерий.

Пример 3. Определение острой токсичности. Острую суточную токсичность при однократном введении изучали на мышах-самцах массой 20-24 г. Соединение в дистиллированной воде вводили животным внутрибрюшинно в различных возрастающих дозах однократно. Наблюдение за животными проводили в течение суток, отмечая количество погибших животных. Расчет ЛД₅₀ проводили методом пробит-анализа.

Исследования острой токсичности показали, что по классификации токсичности веществ при их введении под кожу и в брюшную полость животных [К.К. Сидорова, 1973] заявляемое вещество относится к классу малотоксичных (таблица 4).

Из сравнения доз, в которых динатриевая соль салицилуровой кислоты проявляет церебропротективное действие (8,0 мг/кг) с ЛД₅₀ (1236 мг/кг), можно заключить, что препарат обладает широким диапазоном терапевтического действия и низкой токсичностью (таблица 4).

Изобретение относится к производному салицилуровой кислоты указанной ниже формулы, которое обладает церебропротективным действием. Предлагаемое соединение может найти применение в химико-фармацевтической отрасли для получения эффективных церебропротективных препаратов. 4 табл., 3 пр.

Производное салицилуровой кислоты формулы

обладающее церебропротективным действием.