ПРИМЕНЕНИЕ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩЕЙ ХОЛИНА АЛЬФОСЦЕРАТ И 2-ЭТИЛ-6-МЕТИЛ-3-ГИДРОКСИПИРИДИНА СУКЦИНАТ, В КАЧЕСТВА НЕЙРОПРОТЕКТОРНОГО СРЕДСТВА ПРИ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА Российский патент 2024 года по МПК A61K31/14 A61K31/4412 A61P9/10 A61P25/00 

Область техники

Изобретение относится к медицине и фармакологии, в частности, к применению фармацевтической композиции, содержащей в качестве активных компонентов холина альфосцерат и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат, в качестве нейропротекторного средства при нарушении функций головного мозга, вызванных ишемическими поражениями, а именно острыми и хроническими нарушениями мозгового кровообращения.

Уровень техники

Ишемия головного мозга, возникающая в результате нарушения его кровоснабжения, является одной из наиболее частых причин временной потери трудоспособности, инвалидности и смертности. Головной мозг крайне уязвим перед снижением притока крови, поскольку его клетки проявляют высокую метаболическую активность, но не содержат значительных запасов кислорода и энергетических субстратов [Patel P.M. “Essentials of Neuroanesthesia and Neurointensive Care”, chapter 6, “Cerebral Ischemia”, pp. 36-42, Saunders, 2008].

Выделяют острые и хронические нарушения мозгового кровообращения. Острые нарушения мозгового кровообращения включают в себя преходящие нарушения и инсульты. Хронические нарушения мозгового кровообращения также называют дисциркуляторной энцефалопатией [Гусев Е.И., Коновалов А.Н., Скворцова В. И. «Неврология и нейрохирургия», том 1, глава 10, «Сосудистые заболевания нервной системы», стр. 329-379, «ГЭОТАР-Медиа», 2015].

Церебральная ишемия характеризуется набором патофизиологических механизмов.

Нарушение поступления кислорода и энергетических субстратов к нейронам приводит к снижению выработки АТФ (аденозинтрифосфата), необходимого для поддержания нормального ионного градиента на клеточной мембране. Деполяризация пресинаптической мембраны, происходящая вследствие нарушения градиента натрия и калия, приводит к мощному выбросу возбуждающего нейротрансмиттера глутамата. Активация глутаматных рецепторов ведет к повышению концентрации ионов кальция в клетке, в результате чего происходит патологическая активация протеаз, липаз, эндонуклеаз и повреждение различных клеточных структур. Данный механизм называют глутаматной эксайтотоксичностью [Patel P.M. “Essentials of Neuroanesthesia and Neurointensive Care”, chapter 6, “Cerebral Ischemia”, pp. 36-42, Saunders, 2008].

Окислительный стресс является важным патологическим фактором при церебральной ишемии.

Нарушение процесса окислительного фосфорилирования и ацидоз вследствие ишемии приводят к накоплению активных форм кислорода (АФК). Примерами АФК являются супероксид-анион (О₂^–), пероксильный (HО₂^–), гидроксильный (OH^–) радикалы, пероксид водорода (Н₂О₂) и гипохлорит (OCI^–) [Лянг О.В., Кочетов А.Г. «Применение мексидола при ишемии головного мозга», Журнал неврологии и психиатрии, 12, стр. 126-129, 2013; Saeed S.A., Shad K.F., Saleem T. et al. “Some new prospects in the understanding of the molecular basis of the pathogenesis of stroke”, Exp Brain Res, 182, pp. 1–10, 2007]. Активные формы кислорода способны повреждать ДНК, белки и липиды в клетках [Shields H.J., Traa A. and Van Raamsdonk J.M. “Beneficial and Detrimental Effects of Reactive Oxygen Species on Lifespan: A Comprehensive Review of Comparative and Experimental Studies”, Front. Cell Dev. Biol. 9:628157, pp. 1-27, 2021]. Головной мозг крайне чувствителен к окислительному стрессу, поскольку обладает высокой концентрацией полиненасыщенных жирных кислот, подверженных окислению, низким уровнем антиоксидантной защиты, высоким уровнем потребления кислорода и высоким уровнем ионов железа, которые могут играть роль прооксидантов [Elsayed W.M., Abdel-Gawad E-H.A., Mesallam D.I.A. et al. “The relationship between oxidative stress and acute ischemic stroke severity and functional outcome”, The Egyptian Journal of Neurology, Psychiatry and Neurosurgery, 56:74, pp. 1-6, 2020; Shichiri M. “The role of lipid peroxidation in neurological disorders”, J. Clin. Biochem. Nutr., vol. 54, no. 3, pp. 151–160, 2014].

Перекисное окисление липидов в результате воздействия АФК приводит к повреждению клеточных мембран и накоплению токсичных продуктов, таких как малоновый диальдегид и 4-гидроксиноненал [Nam T-g. “Lipid Peroxidation and Its Toxicological Implications”, Toxicol. Res., vol. 27, no. 1, pp. 1-6, 2011].

Из уровня техники известен препарат холина альфосцерат, который представляет собой холиномиметик центрального действия. В организме препарат метаболизируется до холина, который является предшественником медиатора ацетилхолина, и глицерофосфат, который является предшественником фосфолипидов. Холина альфосцерат улучшает передачу нервного импульса в холинергических нейронах, а также способствует восстановлению фосфолипидного состава мембран клеток и их пластичности [Парфенов В.А. «Сосудистые когнитивные расстройства. Применение холина альфосцерата», Нервные болезни, 2, стр. 3-8, 2013; Инструкция по медицинскому применению лекарственного препарата «Холина альфосцерат», номер регистрационного удостоверения ЛП-008044 от 14.04.2022]. Холина альфосцерат способствует улучшению состояния больных при острой [Виноградов О.И., Даминов В.Д., Рыбалко Н.В. «Применение холина альфосцерата (глиатилин) у пациентов с ишемическим инсультом», Журнал неврологии и психиатрии, 1, стр. 43‑45, 2013] и хронической ишемии головного мозга [Костенко Е.В., Петрова Л.В., Артемова И.Ю. и др. «Опыт применения препарата церепро (холина альфосцерат) при лечении амбулаторных больных с хроническими прогрессирующими сосудистыми заболеваниями головного мозга», Журнал неврологии и психиатрии, 3, стр. 24-30, 2012].

Из уровня техники известен препарат «Мексидол» (действующее вещество – 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат, или этилметилгидроксипиридина сукцинат, или ЭМГПС), который оказывает антигипоксическое, антиоксидантное, мембранопротекторное, ноотропное, противосудорожное, анксиолитическое действие и повышает устойчивость организма к стрессу.

2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат улучшает мозговой метаболизм и кровоснабжение головного мозга, улучшает микроциркуляцию и реологические свойства крови, уменьшает агрегацию тромбоцитов. Стабилизирует мембранные структуры клеток крови (эритроциты и тромбоциты) при гемолизе. Оказывает гиполипидемическое действие, уменьшает уровень общего холестерина и липопротеинов низкой плотности (ЛПНП). 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат ингибирует процессы перекисного окисления липидов, повышает активность супероксиддисмутазы, повышает соотношение липид-белок, уменьшает вязкость мембраны, увеличивает ее текучесть. Модулирует активность мембраносвязанных ферментов (кальцийнезависимая фосфодиэстераза, аденилатциклаза, ацетилхолинэстераза), рецепторных комплексов (бензодиазепиновый, ГАМК, ацетилхолиновый), что усиливает их способность связывания с лигандами, помогает сохранению структурно-функциональной организации биомембран, транспорта нейромедиаторов и улучшению синаптической передачи. 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат повышает содержание дофамина в головном мозге. Вызывает усиление компенсаторной активности аэробного гликолиза и снижение степени угнетения окислительных процессов в цикле Кребса в условиях гипоксии, с увеличением содержания АТФ, креатинфосфата и активацией энергосинтезирующих функций митохондрий, стабилизацию клеточных мембран [Инструкция по медицинскому применению препарата «Мексидол», номер регистрационного удостоверения ЛП-№(000107)-(РГ-RU) от 15.12.2022].

2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат проявляет клиническую эффективность у пациентов при острой [Новикова Л.Б., Шарафутдинова Л.Р., Шарапова К.М. «Применение мексидола в остром периоде ишемического инсульта», Журнал неврологии и психиатрии, 9, стр. 83-85, 2013] и хронической ишемии головного мозга [Лянг О.В., Кочетов А.Г. «Применение мексидола при ишемии головного мозга», Журнал неврологии и психиатрии, 12, стр. 126-129, 2013].

Нейропротекция - стратегия лечения, предотвращающая, останавливающая или замедляющая патологические молекулярные процессы, развивающиеся в результате ишемии, и защищающая клетки головного мозга от гибели [Пирадов М.А., Танашян М.М., Домашенко М.А., Максимова М.Ю. «Нейропротекция при цереброваскулярных заболеваниях: поиск жизни на Марсе или перспективное направление лечения? Часть 2. Хронические формы нарушений мозгового кровообращения», Анналы клинической и экспериментальной неврологии. Т. 9. № 3, стр. 10-19, 2015]. Нейропротекторное действие реализуется в способности терапевтических препаратов предотвращать гибель нервных клеток путем ингибирования или модификации патогенетических каскадов, приводящих к нарушению функционирования и гибели клеток [Sсhapira A.H.V. Chapter 18 “Neuroprotection in Parkinson’s Disease”, Blue Books of Neurology, vol. 34, pp. 301-320, 2010].

Холина альфосцерат оказывает нейропротективное действие за счет того, что является предшественником ацетилхолина и фосфолипидов [Парфенов В.А. «Сосудистые когнитивные расстройства. Применение холина альфосцерата», Нервные болезни, 2, стр. 3-8, 2013]. 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат обладает нейропротекторными свойствами, в частности, за счет ингибирования глутаматной эксайтотокстичности [Воронина Т.А. «Пионер антиоксидантной нейропротекции. 20 лет в клинической практике», Русский медицинский журнал, 7, стр. 434-438, 2016], ингибирования перекисного окисления липидов, снижения угнетения процессов окислительного фосфорилирования [Путилина М.В. «Комбинированное применение нейропротекторов в терапии цереброваскулярных заболеваний», Журнал неврологии и психиатрии, 11, стр. 58-63, 2016].

Недостатками известных препаратов, используемых для нейропротекции, является воздействие только на отдельные механизмы предотвращения нарушения функционирования и гибели нервных клеток. Возникает потребность в создании препарата с комплексным механизмом нейропротекции.

Кроме того, к недостаткам ближайших аналогов настоящего изобретения можно отнести то, что в случае назначения пациенту, страдающему острой или хронической ишемией головного мозга, обоих препаратов, он должен получать от 2 до 5 инъекций в сутки. Препарат «Холина альсфосцерат» назначается минимум 1 раз в сутки внутривенно или внутримышечно [Инструкция по медицинскому применению препарата «Холина альфосцерат», номер регистрационного удостоверения ЛП-008044 от 14.04.2022]. Препарат «Мексидол» назначается внутривенно 2-4 раза в сутки, затем внутримышечно 2-3 раза в сутки при остром нарушении мозгового кровообращения и 1-2 раза в сутки внутривенно про хроническом нарушении мозгового кровообращения [Инструкция по медицинскому применению препарата «Мексидол», номер регистрационного удостоверения ЛП-№(000107)-(РГ-RU) от 15.12.2022]. Такой режим введения представляет сложности в приверженности лечению.

Для оптимизации режима приема лекарственных препаратов удобно совместить их в одной лекарственной форме.

Раскрытие сущности изобретения

Задачей данного изобретения является разработка новой фармацевтической композиции, активные ингредиенты которой участвовали бы в наибольшем количестве механизмов нейропротекции и которая обладала бы улучшенными нейропротекторными свойствами по сравнению с известными препаратами.

Технические результаты изобретения:

- упрощение схемы приема холина альфосцерата и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината;

- повышение выраженности терапевтического нейропротекторного эффекта;

- сверхсуммарное (синергическое) повышение нейропротекторного действия композиции холина альфосцерата и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината за счет их совместного использования;

- расширение арсенала нейропротекторных лекарственных средств, применяемых при ишемии головного мозга.

Поставленная задача решается, а технический результат изобретения достигается путем применения фармацевтической композиции, содержащей эффективные количества холина альфосцерата и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината и по меньше мере один фармацевтически приемлемый эксципиент, в качестве нейропротективного средства при ишемии головного мозга у субъекта.

Согласно предпочтительным вариантам осуществления изобретения указанный технический результат достигается тем, что:

- упомянутая фармацевтическая композиция применяется при ишемии головного мозга у субъекта, которым является человек;

- упомянутая фармацевтическая композиция применяется при острой ишемии головного мозга;

- упомянутая фармацевтическая композиция применяется при хронической ишемии головного мозга;

- действующие вещества в составе упомянутой композиции находятся в следующем количестве: холина альфосцерат – от 600 до 1000 мг; 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат – от 350 до 1000 мг;

- упомянутая фармацевтическая композиция вводится два раза в день;

- упомянутая фармацевтическая композиция вводится внутривенно, внутримышечно или перорально.

Изобретение проиллюстрировано следующей фигурой.

На фиг. 1 показано влияние тестируемых веществ на объем некроза в пораженной гемисфере после окраски 2,3,5-трифенилтетразолием хлоридом, причем ряд 1 – контроль, ряд 2 - 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат, ряд 3 – холина альфосцерат, ряд 4 – композиция холина альфосцерата и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината.

Авторами настоящего изобретения неожиданно установлено, что заявленная композиция, содержащая холина альфосцерат и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат, обладает более выраженным нейропротекторным эффектом по сравнению с известными монопрепаратами, содержащими те же дозировки указанных активных ингредиентов.

Это связано с тем, что совместное применение активных компонентов вызывает сверхсуммарный эффект (синергизм). Входящие в состав фармацевтической композиции активные ингредиенты (холина альфосцерат и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат) обладают разными механизмами нейропротекторного действия, что обеспечивает комплексное и синергичное воздействие на организм, благодаря которому достигается более быстрое и выраженное терапевтическое действие.

Состав композиции теоретически обоснован; практически показана высокая фармакологическая эффективность.

Заявленную композицию рекомендуется применять в качестве нейропротекторного средства при нарушении функций головного мозга, вызванных острыми и хроническими ишемическими поражениями.

В частном случае осуществления изобретения на одну дозированную единицу фармацевтической композиции, выполненной в форме раствора, приходится:

- Действующие вещества: холина альфосцерат – 1000 мг; 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат – 1000 мг.

- Вспомогательные вещества: 0,9% раствор натрия хлорида – 50 мл.

В еще одном частном случае осуществления изобретения на одну дозированную единицу фармацевтической композиции, выполненной в форме раствора, приходится:

- Действующие вещества: холина альфосцерат – 600 мг; 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат – 350 мг.

- Вспомогательные вещества: 0,9% раствор натрия хлорида – 50 мл.

Далее приведены примеры осуществления изобретения, которые, однако, не охватывают все возможные варианты его осуществления и не ограничивают заявленное изобретение.

Пример 1. Получение фармацевтических композиций, содержащих холина альфосцерат и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат.

Холина альфосцерат, раствор в воде для инъекций, концентрация: 250 мг/мл (производство – ООО ХФК «МИР»).

2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат, раствор в воде для инъекций, концентрация: 50 мг/мл (производство – ООО «НПК «ФАРМАСОФТ»).

Вспомогательные вещества:

0,9% раствор натрия хлорида (физраствор) (производство – ООО «Фармасинтез-Тюмень»).

А) 4 мл раствора холина альфосцерата и 20 мл раствора 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината разводили физраствором до 50 мл. В результате получили раствор объемом 50 мл, содержащий 1000 мг холина альфосцерата и 1000 мг 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината.

Б) 2,4 мл раствора холина альфосцерата и 7 мл раствора 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината разводили физраствором до 50 мл. В результате получили раствор, содержащий 600 мг холина альфосцерата и 350 мг 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината.

Пример 2. Получение фармацевтических композиций, содержащих холина альфосцерат и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат, для проведения исследования на крысах Wistar.

A) 85 мг холина альфосцерата разводили в 5 мл физиологического раствора. В результате образовывался раствор с концентрацией 17 мг/мл. 85 мг 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината разводили в 5 мл физраствора. В результате образовывался раствор с концентрацией 17 мг/мл. Оба раствора смешивали для получения 10 мл композиции, содержащей холина альфосцерат и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат.

Б) 50 мг холина альфосцерата разводили в 2,5 мл физраствора. В результате образовывался раствор с концентрацией 20 мг/мл. 30 мг 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината разводили в 2,5 мл физиологического раствора. В результате образовывался раствор с концентрацией 12 мг/мл. Оба раствора смешивали для получения 5 мл композиции, содержащей холина альфосцерат и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат.

Пример 3. Влияние композиции холина альфосцерата и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината на летальность животных, объем некроза в пораженной гемисфере и неврологический дефицит по шкале Garcia при остром нарушении мозгового кровообращения.

3.1. Моделирование острого нарушения мозгового кровообращения

Острое нарушение мозгового кровообращения в виде фокальной церебральной ишемии воспроизводилось путем эндоваскулярной окклюзии-реперфузии средней мозговой артерии по методу Koizumi [Koizumi J., Yoshida Y., Nakazawa T. et al. “Experimental studies of ischemic brain edema. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area“, Jpn. J. of Stroke, v. 8, pp. 1-8, 1986].

Животные содержались в условиях конвенционального вивария, с системой «чистого» и «грязного» коридоров и автоматической сменой дневного и ночного периода (08:00-20:00 – «день», 20:00-08:00 – «ночь»). В комнате, где содержались животные, поддерживалась температура 21-24° C и влажность 55-65%, при как минимум 12-кратной смене воздушного объема в час.

Животные содержались по 4 особи в клетках Тип-4 (1815 кв. см) на подстиле. Поликарбонатные клетки были оборудованы стальными решетчатыми крышками с кормовым углублением, стальными разделителями для корма и стальными держателями этикеток.

Все животные имели ветеринарные свидетельства, при поступлении осматривались ветеринарным врачом и проходили карантин 14 дней. В эксперимент отбирались животные без признаков отклонений в состоянии здоровья.

Стандартный гранулированный корм давался ad libitum в кормовое углубление крышки клетки. Специально подготовленная вода давалась ad libitum в стандартных автоклавированных питьевых бутылочках со стальными крышками-носиками.

Наркотизированное животное фиксировалось в положении на спине. Шерстяной покров удалялся при помощи депиляционного крема. После обработки операционного поля производился разрез кожи по срединной линии шеи, рассекалась подкожная фасция, выделялся левый сонный треугольник, образованный сверху двубрюшной мышцей, латерально – грудино-ключично-сосцевидной мышцей и медиально – грудино-подъязычной мышцей. Далее выделялся сосудисто-нервный пучок, который орошался 2% раствором лидокаина. Левую сонную артерию аккуратно отделяли от нервного пучка. Затем перевязывали общую сонную артерию (ближе к грудине) и левую наружную сонную артерию. Отступив 3-4 мм от бифуркации, в общей сонной артерии делалось пункционное отверстие, в которое вставляли окклюдер (MCAO Sutures Rat/200-250 g/ 6-6mm/0.33-0.35 mm/0.20 mm/ 5cm, Chine) таким образом, чтобы он, пройдя через бифуркацию, оказался во внутренней сонной артерии. Затем, ориентируясь по метке на окклюдере, его вводили далее во внутреннюю сонную артерию на глубину 20-23 мм (но не более), затем общую сонную артерию обратимо затягивали, для избегания кровопотери, операционная рана смачивалась физиологическим раствором и накрывалась марлевым тампоном. По истечении времени окклюзии, окклюдер извлекался, общая сонная артерия перевязывалась, рана промывалась раствором хлоргексидина 0,05%, после чего рану ушивали кисетным швом.

Длительность окклюзии составляла 1 ч. Во время реперфузии (возобновления тока крови), то есть через 60 минут после начала окклюзии вводились тестируемые вещества.

3.2. Оценка размера инфаркта мозга при остром нарушении мозгового кровообращения

Через 24 ч после моделирования острого нарушения мозгового кровообращения (окклюзии-реперфузии средней мозговой артерии) выполняли количественную оценку размера некроза по анализу цифровых фотографий окрашенных срезов мозга [Brait V.H., Jackman K.A., Walduck A.K. et al. “Mechanisms contributing to cerebral infarct size after stroke: gender, reperfusion, T lymphocytes, and Nox2-derived superoxide”, J Cereb Blood Flow Metab., vol. 30, no. 7, pp. 1306-1317, 2010].

Для этого животных выводили из эксперимента, извлекали головной мозг и изготавливали срезы больших полушарий толщиной 2 мм (6 срезов), которые инкубировали в 1% растворе 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида при 37⁰С в течение 15 минут, через 7-10 минут раствор со срезами осторожно встряхивали. После окрашивания срезы фотографировали на цифровую камеру в одной плоскости с миллиметровой линейкой. Измерение площади окрашенной и неокрашенной ткани осуществляли при помощи программного обеспечения ImageJ 1.37.

Для избегания возможного завышения площади некротической ткани вследствие отека, анализировали скорректированный объем зоны инфаркта (ЗИ), который рассчитывался в процентах относительно объема интактной гемисферы по упрощенной формуле [Brait V.H., 2010]: ЗИ = (В-(А-С))/В*100%, где A – суммарная площадь пораженных гемисфер на срезах (мм²) (А1+А2...+А6), B – суммарная площадь интактных гемисфер на срезах (мм²) (В1+В2...+В6), С – суммарная площадь зон инфаркта на срезах (мм²) (С1+С2...+С6).

3.3. Оценка неврологического дефицита по шкале Garcia

Через 24 ч после моделирования острого нарушения мозгового кровообращения, перед выведением животных из эксперимента у них оценивали неврологический дефицит по шкале Garcia [Дайнеко А.С., Шмонин А.А., Шумеева А.В. и др. «Методы оценки неврологического дефицита у крыс после 30-минутной фокальной ишемии мозга на ранних и поздних сроках постишемического периода», Регионарное кровообращение и микроциркуляция. Т.13, No.1, стр. 68-78, 2014; Garcia J.H, Wagner S., Liu K.F. et al. “Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats: statistical validation”, Stroke, Vol.26, No 4, pp. 627-634, 1995].

Таблица 1. Оценка неврологического дефицита по шкале Garcia

Показатель Начисляемые баллы 0 1 2 3 Спонтанная активность (в пустой клетке, в течение 5 мин) Движения отсутствуют Едва двигается Двигается, но не приближается к трем сторонам клетки Двигается и приближается к трем сторонам клетки Симметричность движений (4 конечности) Одна сторона: отсутствует движение Одна сторона: небольшое движение Одна сторона: двигается медленно Обе стороны: двигаются симметрично Симметричность вытягивания предплечий (крысу держат за хвост) Одна сторона: отсутствует вытягивание конечности Одна сторона: слабая попытка вытянуть конечность С одной стороны пытается вытянуть конечность меньше, чем с другой стороны Симметричные вытягивания Забирается по сетке - Не удается забраться Одна сторона слабая Забирается нормально Реакция на прикосновение к стороне тела - Отсутствует ответ с одной стороны Слабый ответ с одной стороны Симметричный ответ Ответ на прикосновение к вибриссам - Отсутствует ответ с одной стороны Слабый ответ с одной стороны Симметричный ответ

Итоговый балл является суммой баллов в 6-и тестах. 18 баллов соответствует животному без нарушений.

3.4. Оценка эффективности композиции холина альфосцерата и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината при окклюзии средней мозговой артерии

Физраствор, холина альфосцерат (85 мг/кг), 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат (85 мг/кг) и композицию холина альфосцерата (85 мг/кг) и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината (85 мг/кг) вводили однократно внутривенно крысам в хвостовую вену во время реперфузии, то есть через 60 мин после моделирования окклюзии средней мозговой артерии.

Таблица 2. Дозы и группы веществ при моделировании острого нарушения мозгового кровообращения.

№ группы Препарат Доза и
режим введения Способ введения Объем введения Концентрация Кол-во животных 1 Физраствор Однократно Внутривенно 10 мл/кг - 10 2 Холина альфосцерат Однократно в дозе 85 мг/кг Внутривенно 10 мл/кг 8,5 мг/мл 10 3 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат Однократно в дозе 85 мг/кг Внутривенно 10 мл/кг 8,5 мг/мл 10 4 Композиция холина альфосцерата и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината Однократно холина альфосцерата в дозе 85 мг/кг, 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината в дозе 85 мг/кг Внутривенно 10 мл/кг холина альфосцерат – 8,5 мг/мл;
2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат –
8,5 мг/мл 10

Оценку эффективности тестируемых веществ при окклюзии средней мозговой артерии проводили через 24 ч после моделирования острого нарушения мозгового кровообращения (окклюзии-реперфузии средней мозговой артерии) по анализу выживаемости, неврологического дефицита по шкале Garcia и размера инфаркта мозга.

В ходе исследования были получены следующие результаты.

В контрольной серии при моделировании окклюзии средней мозговой артерии летальность животных составила 50%. Изолированное введение холина альфосцерата и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината достоверно не повлияло на данный показатель. В то же время, введение композиции холина альфосцерата и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината приводило к снижению летальности до 10% (см. таблицу 3).

Таблица 3. Влияние тестируемых веществ на летальность животных при окклюзии средней мозговой артерии

Серии Количество выживших животных Количество умерших животных % умерших животных Контроль 5 5 50% холина альфосцерат 8 2 20% 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат 7 3 30% Композиция холина альфосцерата и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината 9 1 10%

Полученные результаты свидетельствует о нейропротекторном действии композиции препаратов при острой ишемии головного мозга, что проявляется увеличением процента выживаемости.

Данные дозы, использованные в исследовании, могут быть пересчитаны в эквивалентные дозы для человека с учетом коэффициентов пересчета [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Под редакцией Миронова А.Н. Часть первая. — М.: Гриф и К, с. 861, 2012].

Для пересчёта дозы для животных (мг/кг) в эквивалентную дозу человека (ЭДЧ) (мг/кг) нужно разделить дозу для животного на коэффициент пересчета доз.

Итого, мы получим: 85 мг/кг / 5,9 (коэффициент для крыс) = 14,4 мг/кг (для человека), или 14,4 * 70 (средний вес человека) ≈ 1000 мг/сут (холина альфосцерата и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината).

3.5. Влияние композиции холина альфосцерата и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината на объем некроза в пораженной гемисфере и неврологический дефицит по шкале Garcia при остром нарушении мозгового кровообращения.

Объем некроза в пораженной гемисфере контрольных животных при моделировании окклюзии средней мозговой артерии составил 43,0%.

Введение холина альфосцерата в дозе 85 мг/кг приводило к снижению объема некроза в пораженной гемисфере до 29,9%, применение 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината в дозе 85 мг/кг приводило к снижению объема некроза в пораженной гемисфере до 16,7%, использование композиции данных веществ приводило к снижению объема некроза в пораженной гемисфере до 15,4% (см. фиг. 1, таблицу 4).

При оценке влияния тестируемых веществ на выраженность неврологического дефицита, было показано, что введение 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината увеличивало суммарный бал по шкале Garcia на 57,1%, а введение композиции 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината и холина альфосцерата – на 85,7% по сравнению с контролем. Изолированное применение холина альфосцерат достоверного эффекта не оказало (см. таблицу 4).

Таблица 4. Влияние тестируемых веществ на объем некроза в пораженной гемисфере и неврологического дефицита по шкале Garcia при окклюзии средней мозговой артерии.

Серии Объем некроза в пораженной гемисфере, % Неврологический дефицит по шкале Garcia, суммарный балл Контроль 43,0 7,0 холина альфосцерат 29,9 9,0 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат 16,7 11,0 Композиция холина альфосцерата и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината 15,4 13,0

Полученные результаты свидетельствует о нейропротекторном действии композиции холина альфосцерата и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината при острой ишемии головного мозга, что проявляется снижением объема некроза в пораженной гемисфере головного мозга и снижением неврологического дефицита.

Пример 4. Влияние композиции холина альфосцерата и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината на летальность животных и выраженность неврологического дефицита при хроническом нарушении мозгового кровообращения.

4.1. Моделирование хронического нарушения мозгового кровообращения.

Хроническая ишемия головного мозга моделировалась с помощью двухсторонней окклюзии общих сонных артерий.

Животное фиксировалось за лапы на спине на хирургическом столе. Волосяной покров с передней части шеи удалялся депиляционным кремом от нижней челюсти до грудины. Поверхность кожи обрабатывалась спиртом (70%). Отступив 0,5 см от грудины, выполнялся продольный разрез по срединной линии шеи длиной 2 см. Подкожно жировой слой разрезался сосудистыми ножницами, края раны разводились в стороны с использованием зажимов. Под грудино-ключично-сосцевидной мышцей ближе к грудине сосудисто-нервный пучок орошался раствором лидокаина (2%). Выделение общей сонной артерии производили без прикосновения к блуждающему нерву. В качестве лигатуры использовался нерассасывающийся шовный материал. Завязывался узел и затягивался, не захватывая окружающие ткани.

После проверки правильного положения узла затягивался второй узел, шовный материал на 2 мм выше узла обрезался. Аналогичная процедура выполнялась на другой общей сонной артерии. Операционное поле обрабатывалось раствором хлоргексидина 0,05%. Операционная рана зашивалась кисетным швом. Шов обрабатывался раствором йода.

После операции животные помещались в клетки с чистыми опилками по 4 особи. В течение 28 суток животные находились под наблюдением, фиксировалась летальность и неврологический дефицит.

4.2. Оценка неврологического дефицита по шкале McGraw в модификации И.В. Ганнушкиной.

Неврологический статус крыс после окклюзии общих сонный артерий оценивался по шкале stroke-index McGraw в модификации И.В. Ганнушкиной [Ганнушкина И.В «Патофизиологические механизмы нарушений мозгового кровообращения и новые направления в их профилактике и лечении», Журн. невролог. и психиатр., Т.96, № 1., стр. 14-18, 1996] через 4, 24, 72 ч, 7, 14, 21 и 28 дней после моделирования патологии.

Таблица 5. Оценка неврологического дефицита по шкале McGraw в модификации И.В. Ганнушкиной.

Симптомы Index (баллы) Вялость 0,5 Тремор 1,0 Односторонний полуптоз 1,0 Двусторонний полуптоз 1,5 Слабость конечности 1,5 Односторонний птоз 1,5 Двусторонний птоз 1,5 Манежные движения 2,0 Парез 1–4 конечности 2,0–5,0 Паралич 1–4 конечности 3,0–6,0 Кома 7,0 Летальный исход 10,0

При наличии у животного нескольких признаков неврологического дефицита баллы суммировались.

4.3. Оценка эффективности композиции холина альфосцерата и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината при двусторонней окклюзии общих сонных артерий.

Первое введение проводилось внутривенно в хвостовую вену через 60 мин (1 ч) после перевязки общих сонных артерий: физраствор, композиция холина альфосцерата (85 мг/кг) и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина (85 мг/кг). Последующее введение через 12 часов и далее два раза в день осуществлялось внутрижелудочно (зондом в желудок): вода для инъекций и композиция холина альфосцерата (50 мг/кг) и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината (30 мг/кг).

Таблица 6. Дозы и группы веществ при моделировании хронического нарушения мозгового кровообращения

№ группы Препарат Доза и
режим введения Способ введения Объем введения Концентра-ция Кол-во
живот- ных 1 Физраствор Однократно Внутривенно 10 мл/кг - 10 Вода для инъекций Два раза в день 28 дней Перорально зондом в желудок 5 мл/кг - 2 Композиция холина альфосцерата и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината Однократно холина альфосцерата в дозе 85 мг/кг,
2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат в дозе 85 мг/кг Внутривенно 10 мл/кг холина альфосцерат – 8,5 мг/мл;
2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат – 8,5 мг/мл. 10 холина альфосцерата
50 мг/кг,
2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат 30 мг/кг два раза в день Перорально зондом в желудок 5 мл/кг холина альфосцерат -
10 мг/мл; 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат – 6 мг/мл.

Для оценки эффективности тестируемых веществ при двусторонней окклюзии общих сонных артерий через 4 часа, 24 часа, 72 часа, 7 дней, 14 дней, 21 день и 28 дней после моделирования патологии оценивали летальность животных и неврологический дефицит по шкале stroke-index McGraw в модификации И.В. Ганнушкиной [Ганнушкина И.В «Патофизиологические механизмы нарушений мозгового кровообращения и новые направления в их профилактике и лечении», Журн. невролог. и психиатр., Т.96, № 1., стр.14, 1996].

В ходе исследования были получены следующие результаты.

В контрольной серии при моделировании двусторонней окклюзии общих сонных артерий летальность животных на 28 день составила 100% (см. таблицу 7).

Таблица 7. Влияние тестируемых веществ на летальность животных на 28 день при двусторонней окклюзии общих сонных артерий.

Серии Количество выживших животных Количество умерших животных % умерших животных Контроль 0 100 100 Композиция холина альфосцерата и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината 3 7 70

Введение композиции холина альфосцерата и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината снижало процент умерших животных до 70%.

Полученные результаты свидетельствует о нейропротекторном действии композиции холина альфосцерата и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината при хронической ишемии головного мозга, что проявляется увеличением процента выживаемости.

Данные дозы, использованные в исследовании, могут быть пересчитаны в эквивалентные дозы для человека с учетом коэффициентов пересчета [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Под редакцией Миронова А.Н. Часть первая. — М.: Гриф и К, с. 861, 2012].

Для пересчёта дозы для животных (мг/кг) в эквивалентную дозу человека (ЭДЧ) (мг/кг) нужно разделить дозу для животного на коэффициент пересчета доз.

Итого, мы получим:

85 мг/кг / 5,9 (коэффициент для крыс) = 14,4 мг/кг (для человека), или 14,4 * 70 (средний вес человека) ≈ 1000 мг/сут (холина альфосцерата, 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината);

50 мг/кг / 5,9 (коэффициент для крыс) = 8,47 мг/кг (для человека), или 8,47 * 70 (средний вес человека) ≈ 600 мг/сут (холина альфосцерата);

30 мг/кг / 5,9 (коэффициент для крыс) = 5,085 мг/кг (для человека), или 5,085 * 70 (средний вес человека) ≈ 350 мг/сут (2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината).

При оценке влияния тестируемых веществ на выраженность неврологического дефицита по шкале McGraw в модификации И.В. Ганнушкиной было показано, что введение композиции холина альфосцерата и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината снижало выраженность неврологического дефицита на 30% по сравнению с контрольной серией (см. таблицу 8).

Таблица 8. Влияние тестируемых веществ на выраженность неврологического дефицита по шкале McGraw в модификации И.В. Ганнушкиной при двусторонней окклюзии общих сонных артерий.

Серии Время после моделирования окклюзии 4 ч 24 ч 72 ч 7 дней 14 дней 21 день 28 дней Контроль 3,7 6,3 6,9 7,45 9,1 9,3 10 Композиция холина альфосцерата и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината 2,2 2,75 5,15 5,55 7,0 7,0 7,0

Следовательно, композиция холина альфосцерата и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината обладает выраженным нейропротекторным действием при хронической ишемии головного мозга, что проявляется в увеличении процента выживаемости и снижении выраженности неврологического дефицита.

Полученные результаты свидетельствует о большей выраженности и широте нейропротекторного действия предлагаемой композиции по сравнению с терапией отдельными препаратами, что является неожиданным эффектом для данной композиции.

Изобретение относится к области медицины и фармакологии, а именно к применению фармацевтической композиции, содержащей холина альфосцерат и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент, в качестве нейропротективного средства при ишемии головного мозга. Применение фармацевтической композиции, содержащей холина альфосцерат и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент, в качестве нейропротективного средства при ишемии головного мозга у субъекта, причем действующие вещества в составе упомянутой композиции находятся в следующем количестве: холина альфосцерат – от 600 до 1000 мг, 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат – от 350 до 1000 мг. Указанное изобретение позволяет упростить схему приема холина альфосцерата и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината, повысить выраженность терапевтического нейропротекторного эффекта, синергически повысить нейропротекторное действие композиции за счет совместного использования холина альфосцерата и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината и расширить арсенал нейропротекторных лекарственных средств, применяемых при ишемии головного мозга. 7 з.п. ф-лы, 1 ил., 8 табл., 4 пр.

1. Применение фармацевтической композиции, содержащей холина альфосцерат и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент, в качестве нейропротективного средства при ишемии головного мозга у субъекта, причем действующие вещества в составе упомянутой композиции находятся в следующем количестве:

холина альфосцерат – от 600 до 1000 мг;

2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат – от 350 до 1000 мг.

2. Применение фармацевтической композиции по п. 1, отличающееся тем, что субъектом является человек.

3. Применение фармацевтической композиции по п. 1, отличающееся тем, что ишемия головного мозга у субъекта представляет собой острую ишемию.

4. Применение фармацевтической композиции по п. 1, отличающееся тем, что ишемия головного мозга у субъекта представляет собой хроническую ишемию.

5. Применение фармацевтической композиции по п. 1, отличающееся тем, что фармацевтическую композицию вводят два раза в день.

6. Применение фармацевтической композиции по п. 1, отличающееся тем, что фармацевтическую композицию вводят внутривенно.

7. Применение фармацевтической композиции по п. 1, отличающееся тем, что фармацевтическую композицию вводят внутримышечно.

8. Применение фармацевтической композиции по п. 1, отличающееся тем, что фармацевтическую композицию вводят перорально.