ОСНОВНАЯ МАГНИЕВАЯ СОЛЬ N-(4-АЦЕТОКСИБЕНЗОИЛ)ГЛИЦИНА, ОБЛАДАЮЩАЯ ЦЕРЕБРОПРОТЕКТИВНЫМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 2015 года по МПК C07C235/52 A61P25/28 

Изобретение относится к новым водорастворимым производным N-(4-ацетоксибензоил)глицина (4-ацетоксигиппуровой кислоты) - основная магниевая соль N-(4-ацетоксибензоил)глицина - и его применению как церебропротективного средства.

Сосудистые заболевания головного мозга остаются одной из острейших медико-социальных проблем, наносящих огромный экономический ущерб обществу. Особое место среди них занимает церебральный инсульт, в связи с высоким уровнем летальности, значительной инвалидизацией и социальной дезадаптацией пациентов. По данным ВОЗ, в России каждые 1,5 мин констатируется инсульт, ежегодно регистрируется около 450 тыс. случаев этого заболевания [М.В. Путилина, Е.Н. Донгак, М.А. Солдатов. Концепция патогенетического воздействия на процессы нейропластичности и нейротрофичности у пациентов пожилого возраста с нарушениями мозгового кровообращения: возможности нейропротекторных препаратов // Consilium Medicum. - 2009. - Т. 11, №9. - с. 6-12]. На каждые 100 млн жителей нашей планеты ежегодно приходится около 500 тыс. инсультов и церебральных кризов. В мире от инсультов ежегодно погибает около 14 млн человек. Инсульт вдвое повышает риск заболеваемости деменцией у больных пожилого возраста. В настоящее время примерно 12-15% населения составляют лица в возрасте старше 65 лет, причем к 2020 г. их численность возрастет, по меньшей мере в 2 раза [Дамулин И.В., Снеткова Е.П. Псевдоинсультные состояния у больных пожилого возраста // Журн. неврол. и психиат. им. С.С. Корсакова. - 1995; 95 (2). - с. 19-22].

Для лечения нарушения мозгового кровообращения широко используют глицин и пирацетам с дозировкой 2400 в сутки. Глицин (аминоуксусная кислота, CAS 56-40-6) как средство, повышающее умственную работоспособность и уменьшающее психоэмоциональное напряжение [Машковский, М.Д. Лекарственные средства: пособие для врачей. - Т. 2. - М.: Новая волна. - 2002. - С. 124]. Важная физиологическая роль гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) в регуляции функциональной активности ЦНС определяет перспективность создания на ее основе нейропсихотропных лекарственных средств. Однако в силу ряда физико-химических свойств препараты, в частности ГАМК (CAS 56-12-2, аминалон, гаммалон), обладают низкой биодоступностью, что является причиной их невысокой эффективности. Эталонным ноотропом, который используется для восстановления нарушений интеллектуальных функций у больных при нарушении мозгового кровообращения, является пирацетам (2-оксо-1-пирролидинацетамид, CAS 932-17-2). Недостатком пирацетама как эталонного препарата является его низкая активность: уровень эффективных доз действия составляет 200-800 мг/кг, эффект пирацетама часто плохо воспроизводим (RU 2050851).

N-(4-ацетоксибензоил)глицин (CID 840150) в медицине не используется.

Цель изобретения заключается в получении высокоэффективного водорастворимого производного 4-гидроксибензойной кислоты, сочетающего основные эффекты, присущие церебропротективным средствам и превосходящие таковые у глицина и пирацетама.

Сущность изобретения заключается в синтезе основной магниевой соли N-(4-ацетоксибензоил)глицина формулы

и использования его в качестве церебропротективного средства.

Пример 1. Оснóвная магниевая соль N-(4-гидроксибензоил)глицина. В реактор, снабженный мешалкой, помещают глицин и 50 мл ДМФА. По каплям приливают хлорангидрид 4-ацетоксибензойной кислоты в течение 1,5 часа. Реакцию проводят при охлаждении 1,5 часа. Затем полученную реакционную смесь перемешивают еще 2,5 часа (при охлаждении), контролируя pH среды (pH>7). Для поддержания среды добавляют 6 н раствор гидроксида натрия. Полученную смесь выливают в лед и подкисляют хлороводородной кислотой до pH=5, выпавшие кристаллы N-(4-ацетоксибензоил)глицина отфильтровывают и сушат. Выход 73%. T_пл=194-197°C, Rf 0,569 (бутанол-1). M+ 237 (хроматомасс-спектрометр «Saturn-2100», Varian).

Суспензию MgO 0,56 г (0,014 моль) в 16 мл воды нагревают до 50°C. Затем в получившуюся суспензию в течение 30 мин при перемешивании добавляют 3 г (0,014 моль) N-(4-ацетоксибензоил)глицина, добавляют еще небольшое количество MgO до pH=7÷8 и нагревают до 70°C. По истечении 30 минут к реакционной смеси приливают изопропанол (16 мл) и охлаждают до 5-10°C. В результате выпадают кристаллы белого цвета. Полученные кристаллы отфильтровывают, промывают изопропанолом и сушат при 60°C. Выход оснóвной магниевой соли N-(4-ацетоксибензоил)глицина 60%, Т.пл. 286°C (с разл.). Найдено: C 47.61; H 4.00; Mg 8.76; N 5.05. Вычислено, %: C 47.62; H 3.99; Mg 8.72; N5.13.

Пример 2. Церебропротективное действие основной магниевой соли N-(4-ацетоксибензоил)глицина в условиях ишемического повреждения мозга при необратимой одномоментной двухсторонней окклюзии общих сонных артерий.

Экспериментальное исследование было выполнено на белых беспородных крысах-самцах массой 180-200 г, возрастом 3,5-4 месяца (питомник ФГУП "НИИ ГТП" ФМБА России (г. Волгоград)). После доставки из питомника животные содержались на 7-дневном карантине. Животные находились в стандартных условиях вивария с 12-часовым свето-темновым режимом при свободном доступе к воде и пище. Ишемическое повреждение мозга моделировалось путем необратимой одномоментной билатеральной окклюзии общих сонных артерий [Мирзоян Р.С. Методические рекомендации по доклиническому изучению лекарственных средств для лечения нарушений мозгового кровообращения и мигрени //Руководство по доклиническому изучению лекарственных средств /Под. ред. А.Н. Миронова Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.]. Болезненные манипуляции выполнялись под наркозом (хлоралгидрат, 400 мг/кг внутрибрюшинно). Перед операцией с передней поверхности шеи выбривалась шерсть, операционной поле обрабатывалось антисептическим раствором. Оперативный доступ осуществлялся через разрез по срединой линии шеи, отодвигалась грудино-ключично-сосцевидная мышца и сонная артерия отпрепарировалась тупым методом от блуждающего и симпатического нерва. В опытных группах обе сонные артерии перевязывались лигатурой, в группе ложнооперированных животных лигатуры подводились под артерию, но не затягивались. После чего рану обрабатывали антисептическим раствором и ушивали. Длительность процедуры перевязки составляла 7-10 минут. До выхода из наркоза животные помещались в отдельную клетку. Нами были сформированы следующие группы по 20 животных в каждой (в контрольной группе 30 животных): 1) ЛО (ложнооперированные) животные - животные данной группы подвергались всем хирургическим манипуляциям, за исключением непосредственно перевязки сонных артерий; 2) контроль-ишемия - животные, которым выполнялась двусторонняя окклюзия общих сонных артерий (ОСА) и которые получали в качестве лечения физиологический раствор; 3) ишемия + патентуемое соединение - животные с двусторонней ОСА, получавшие патентуемую магниевую соль в дозе 10 мг/кг; 4) ишемия + пирацетам - животные с двусторонней ОСА, получавшие пирацетам в дозе 800 мг/кг; 5) ишемия + глицин - животные с двусторонней ОСА, получавшие соединение глицин в дозе 10 мг/кг. Патентуемое соединение - основная магниевая соль N-(4-ацетоксибензоил)глицина - и препараты сравнения (пирацетам, глицин) вводились животным внутрибрюшинно за 30 минут до окклюзии общих сонных артерий и через 2 часа после проведения операции. Церебропротективное действие основной магниевой соли N-(4-ацетоксибензоил)глицина при ишемическом повреждении головного мозга оценивалось при помощи нескольких критериев: выживаемость животных в течение 72 часов после окклюзии общих сонных артерий; суммированный балл неврологического дефицита; уровень когнитивного дефицита, уровень двигательной и ориентировочно-исследовательской активности. Выживаемость и неврологический дефицит у животных оценивались на 6, 12, 24, 48 и 72 час после операции. Неврологический статус животных определялся по шкале McGrow в модификации И.В. Ганнушкиной. Неврологический дефицит выражался как сумма баллов, соответствующих определенным симптомам дефицита. Дополнительно, спустя 72 часа после окклюзии ОСА, были использованы поведенческие тесты для оценки поведения и когнитивных функций: «Открытое поле» (ОП), «условная реакция пассивного избегания» (УРПИ) и «тест экстраполяционного избавления» (ТЭИ).

Тест «открытое поле» (ОП) [Хаунина Р.А., Лапин И.П. 1976 г., Воронина Т.А. 1982] позволяет оценить: выраженность и динамику отдельных поведенческих показателей; уровень эмоционально-поведенческой реактивности животного; стратегию исследовательского/оборонительного поведения; симптомы неврологического дефицита. Животное помещается в центр круглой белой арены. За животным наблюдали в течение 3-х минут, фиксировали следующие показатели: число пересеченных секторов, количество стоек (закрытых и открытых), количество обследованных отверстий-норок [Воронина Т.А., Островская Р.У., 2000]. Показатель ориентировочно-исследовательской активности складывался из суммы стоек и заглядываний в отверстия, а показатель спонтанной двигательной активности соответствовал количеству пересеченных секторов.

Методика оценки условного рефлекса пассивного избегания» (УРПИ) является базисной моделью для выявления специфической ноотропной активности веществ. [Воронина Т.А., Островская Р.У., 2000]. Она применяется для оценки влияния веществ на формирование, сохранение и воспроизведение памятного следа в норме и в условиях его нарушения. Данная методика выполнялась следующим образом:

1) при формировании рефлекса пассивного избегания крысу помещали в центральную зону освещенного отсека (лампа мощность 100 Вт), хвостом ко входу в темный отсек, после, как правило, короткого обследования светлого отсека крыса переходила в темный, где через электрический пол получало электроболевое раздражение (ток 40 B, 3 импульса по 1 с, с интервалом 0,5 с). Наблюдение продолжалось в течение 3-х минут, при повторном заходе в темный отсек, животное получало электроболевое раздражение повторно. Животные, которые не заходили в темный отсек, - исключались из эксперимента. Фиксировались такие показатели, как латентный период (ЛП) первого захода в темный отсек (время от момента помещения животного в середину площадки до первого захода в темный отсек) и количество заходов в него.

2) контроль выработки рефлекса - при втором воспроизведении все животные повторно не должны заходить в темный отсек, зашедшие животные исключались из эксперимента.

3) второе воспроизведение навыка пассивного избегания - производилось после нарушения мозгового кровообращения. На данном этапе электроболевое раздражение при заходе в темный отсек не наносилось. Регистрировался ЛП первого захода в темный отсек, количество заходов в темный отсек и общее время, проведенное в темном отсеке.

«Тест экстраполяционного избавления» (ТЭИ) предназначен для изучения когнитивных функций грызунов в условиях аверсивной среды и позволяет оценить: индивидуальные различия когнитивного стиля решения задачи (поиска пути активного избавления из аверсивной среды). Фиксировался ЛП подныривания (время от момента помещения животного в воду до подныривания под края цилиндра). Так же как и тест УРПИ методика включает в себя этап обучения навыка (выработка рефлекса избавления), этапа его первого воспроизведения через 24 часа и этапа второго воспроизведения после операции. Животные, не решающие задачу на этапе обучения, исключались из опыта.

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ Microsoft Excel 2007 и BioStat 2008 5.2.5.0. с использованием критериев Манна-Уитни, точного критерия Фишера.

Результаты

1) Выживаемость животных при ишемическом повреждении головного мозга крыс, вызванного необратимой одномоментной окклюзией общих сонных артерий.

Ишемическое повреждение головного мозга крыс при необратимой окклюзии общих сонных артерий вызывало гибель животных. Через 72 часа после моделируемой патологии в группе контроль-ишемия выживаемость составила 33%. Основная магниевая соль N-(4-ацетоксибензоил)глицина в дозе 10 мг/кг через 24 часа после ОСА достоверно снижала гибель животных по сравнению с группой негативного контроля (контроль-ишемия) (таблица 1). Защитное действие, которое было оказано патентуемым соединением, превосходило таковое у пирацетама и глицина.

2) Неврологический дефицит животных с ишемическим повреждением головного мозга крыс, вызванного необратимой одномоментной окклюзией общих сонных артерий.

В таблице 2 представлена динамика развития неврологического дефицита в течение 72 часов после моделирования патологии. Как показано в таблице, неврологический дефицит (в баллах по шкале McGrow) после необратимой окклюзии сонных артерий был менее выражен у животных, получавших патентуемое соединение.

В тестах ОП, УРПИ и ТЭИ, при оценке неврологического дефицита у животных было установлено, что патентуемое соединение достоверно препятствовало возникновению выраженных нарушений локомоторной и ориентировочно-исследовательской активности животных, устраняло нарушения памяти, вызванные необратимой окклюзией общих сонных артерий (таблица 3).

Таким образом, патентуемое соединение - оснóвная магниевая соль N-(4-ацетоксибензоил)глицина - оказывает церебропротективное действие, увеличивая выживаемость животных и снижая выраженность у них неврологических нарушений по сравнению с группой контроль-ишемия при ишемическом повреждении головного мозга, вызываемым одномоментной перевязкой обеих сонных артерий.

Пример 3. Определение острой токсичности. Острая суточная токсичность при однократном введении была изучена на мышах-самцах массой 20-24 г. Соединение, разведенное в дистилированой воде, вводили животным однократно внутрибрюшинно в различных возрастающих дозах. Наблюдали за животными в течение суток, отмечая количество погибших. LD₅₀ рассчитывали методом пробит-анализа. При исследовании острой токсичности было выявлено, что по классификации токсичности исследуемого вещества при его введении животным под кожу и в брюшную полость [К.К. Сидорова, 1973] заявляемое вещество можно отнести к классу малотоксичных веществ (таблица 4).

Изобретение относится к водорастворимому производному 4-ацетоксигиппуровой кислоты указанной ниже формулы, которое обладает церебропротективным действием. Предлагаемое соединение может найти применение в химико-фармацевтической отрасли для получения эффективных церебропротективных препаратов. 4 табл., 3 пр.

Водорастворимое производное 4-ацетоксигиппуровой кислоты формулы

обладающее церебропротективным действием.