ПРОТИВОВИРУСНОЕ СРЕДСТВО Российский патент 2008 года по МПК A61K31/185 A61K9/02 A61P31/12 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается создания средства для лечения вирусных заболеваний, включая ВИЧ-инфекцию (СПИД и ВИЧ ассоциированные заболевания).

Разработка и поиск эффективных препаратов для профилактики и лечения вирусных инфекций является одной из актуальных задач современной фармацевтической промышленности. Если проблема борьбы с заболеваниями бактериальной этиологии успешно решается путем создания новых антибиотиков и других эффективных средств, обладающих протективной активностью, то возможности борьбы с вирусными заболеваниями ограничены.

Биогенное противовирусное средство интерферон находит применение для профилактики гриппа. Приведенные аналоги показывают, что создание противовирусных средств является далеко не решенной задачей. Поэтому поиск новых средств защиты от вирусных инфекций весьма актуален. Известны противовирусные вещества, выделенные из морских животных. Это полифукозные сульфаты, эффективные против ВИЧ [ЕР 0495116 A1, 22.07.92)], и трисульфатированные тритерпеновые гликозиды из антарктической голотурии Staurocucumis liouvillei, эффективные против вируса герпеса [J. Nat. Prod. 2001 Jun; 64 (6): 732-6].

Многолетние интенсивные поиски антивирусных веществ привели к созданию ограниченного набора фармакологически активных препаратов. Многие из них обладают узким спектром действия и в большинстве случаев токсичны, что значительно ограничивает их применение как лекарственных средств. Немногочисленные синтетические противовирусные средства - мидинтан, метисазон - находят ограниченное профилактическое применение, идоксиуридин, оксолин применяются местно при вирусных заболеваниях кожи, причем токсичность первого очень высока [Фармакология. М., Медицина, 1981, с.399-401].

Задачей настоящего изобретения является создание средства, обладающего противовирусной активностью, особенно эффективного при лечении ВИЧ-инфекции.

Технический результат заключается в создании лекарственной формы фуллевира для ректального введения. Ректальное введение фуллевира не оказывает влияние на гематологические показатели периферической крови, а также повреждающего действия на органы и системы организма.

Для решения поставленной задачи предложено противовирусное средство, выполненное в форме суппозитория, и содержит активное вещество фуллевир (натриевая соль фуллеренполиаминокапроновой кислоты) и вспомогательные вещества - пропиленгликоль и витепсол W-35 и/или Н-15 при следующем соотношении ингредиентов на 1 свечу массой 2 г:

фуллевир20 мгпропиленгликоль200 мгвитепсолостальное

Фуллевир® представляет собой водорастворимое производное фуллерена (75 мг/мл) - натриевую соль фуллеренаминокапроновой кислоты с числом присоединенных групп не менее 2, общей формулы

C₆₀H_n[NH(CH₂)₅C(O)O^-]_n,

где С₆₀ - фуллереновое ядро,

NH(CH₂)₅C(O)O^- - аминокапроновый анион,

n - целое число не менее 2.

Молекулярный вес зависит от количества присоединенных аминокислот:

для натриевой соли фуллерен-тетрагидро-тетрааминокапроновой кислоты С₆₀Н₄ [NH(CH₂)₅C(O)O^-]₄ 4Na⁺ равен 1333,2 г/моль.

Большинство химических реакций с фуллеренами не являются селективными, что затрудняет синтез индивидуальных соединений. Поэтому в продукте присутствуют как изомеры положения, так и соединения, отличающиеся по количеству присоединенных аминокислот.

Способ получения:

на 10 суппозиторий - растирают 200 мг субстанции в 2 г полиэтиленгиколя при 40°С до полного растворения. Витепсол (17,8 г) расплавляют и остужают до 35°С. В основу при постоянном перемешивании вносят фуллевир. Свечи формируют массой 2 г ± 5%.

Были проведены экспериментальные исследования по противовирусной активности фуллевира.

Наиболее адекватным способом оценки противовирусного эффекта препаратов в отношении ВИЧ является модель клеток человека, зараженных вирусом. Критерием эффективности препарата является отсутствие или снижение количества инфекционного вируса в клетках, зараженных данным вирусом.

Использовали перевиваемые лимфобластоидные клетки человека МТ-4. Клетки культивировали в концентрации 3,0-5,0·10⁵ клеток в 1 мл среды RPMI 1640 (производства НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН) с 10% сыворотки эмбрионов коров (производства НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН), 100 мкг/мл гентамицина (Фармахим, Болгария). Жизнеспособность клеток определяли окраской 0,4% раствора трипанового синего (Сигма, США).

В качестве источника вируса использовали штаммы ВИЧ-1_BRU, ВИЧ-1₈₉₉A из коллекции штаммов вирусов иммунодефицита человека ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН.

Исследовали препарат Фуллевир® в виде порошка.

В качестве антиретровирусного референс-препарата использовали препарат ретровир (азидотимидин) производства ГлаксоСмитКляйн (Бельгия).

Структура исследования

1) Исследование цитотоксического действия препарата

К клеткам добавляли исследуемый препарат в различных концентрациях. Инкубировали клетки при 37С° в атмосфере с 5% СО₂ и 98% влажности 3-6 дней. Далее определяли жизнеспособность и количество клеток при помощи красителя.

2) Исследование противовирусного действия препарата

а) Инфицирование клеток* (* схема эксперимента может быть другой) - клетки человека инфицируют ВИЧ.

б) Внесение препарата - к зараженным вирусом клеткам добавляли препарат. Инкубация инфицированных клеток при 37С° в атмосфере с 5% CO₂ и 98% влажности 5-7 дней. Учет результатов: световая микроскопия - исследование цитопатического эффекта вируса (ЦПД) и вирусиндуцируемого синцитий образования (синцитий - конгломерат нескольких клеток с общей клеточной оболочкой, образовавшейся в результате слияния их мембран).

Степень цитодеструкции оценивали под микроскопом по общепринятой четырехкрестовой системе знаками + или - соответственно количеству погибших клеток в каждой из четырех лунок, соответствующих одному исследуемому показателю.

++++ - 100%-ная гибель клеток в четырех лунках, использованных в опыте на одно разведение,

+++ - 75%-ная гибель клеток в каждой из четырех лунок,

++ - 50%-ная гибель клеток в каждой из четырех лунок,

+ - 25%-ная гибель клеток в каждой из четырех лунок,

+- - начало дегенерации,

- - отсутствие цитодеструкции.

Методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих иммуноферментных наборов фирм Биорад, Органон Техника (Нидерланды), проводили определение антигена вируса в культуральной жидкости.

Определение оптимальных условий проявления противовирусного действия препарата:

- введение препарата до инфицирования;

- введение препарата одновременно с вирусом;

- введение препарата после инфицирования клеток.

Полученные данные показали, что в концентрации 1-100 мкг/мл Фуллевир® не оказывал заметного цитотоксического действия на лимфобластоидные клетки человека. ИК₅₀ препарата (50%-ная ингибирующая концентрация) составила 400 мкг/мл.

При исследовании противовирусной активности препарата в отношении вируса иммунодефицита человека обнаружен противовирусный эффект.

Наибольшая активность препарата отмечена при концентрации 10 мкг/мл - 95%-ная защита клеток. Доза Фуллевира® 1 мкг/мл обеспечивала 80%-ную резистентность клеток к действию вируса. При этих дозах отмечено исчезновение в клетках вирус-индуцированных синцитиев.

Данные иммуноферментного анализа подтвердили наличие обнаруженной дозовой зависимости: при концентрации препарата 0,5 мкг/мл - снижение антигена вируса в культуральной жидкости на 25,4%, при 1 мкг/мл - 63,7%, при 10 мкг/мл - 95,3%. Таким образом, ЭК₉₅ (95%-ная эффективная концентрация) составляет 10 мкг/мл.

Изучение противовирусного эффекта Фуллевира® при различных схемах его введения (профилактической и лечебной) показало его наличие при всех изученных схемах.

Таким образом, исследование препарата Фуллевир® на модели культур клеток человека обнаружена его выраженная противовирусная активность в отношении вируса иммунодефицита человека в дозах 1-10 мкг/мл при профилактической и лечебной схеме введения.

Было проведено исследование общетоксического действия субстанции и лекарственной формы для ректального применения препарата Фуллевир®.

Острая токсичность субстанции Фуллевир® была изучена на мышах и крысах. Показатели ЛД₅₀ при внутривенном введении мышам находились в пределах 198-234 мг/кг; при внутривенном введении крысам - 312-383 мг/кг; при пероральном введении превышала для мышей 8000 мг/кг, для крыс - 6250 мг/кг; при ректальном способе введения превышала 3125 мг/кг. Разница в показателе ЛД₅₀ в зависимости от пола животных несущественна. Гибель животных наступала в первые сутки при клинических проявлениях общего характера: угнетение, отказ от корма и воды, цианоз видимых слизистых оболочек. При патологоанатомическом исследовании отмечено значительное кровенаполнение паренхиматозных органов, очаговые кровоизлияния в легких и почках.

В хроническом эксперименте субстанцию Фуллевир® испытывали на белых аутбредных крысах в дозах 0,3 мг/кг массы тела (эквитерапевтическая), а также 1,5 и 3,0 мг/кг при ректальном ведении. Всего использовано 192 животных (96 самок и 96 самцов). Через 1, 3 и 6 месяцев, а также через 2 недели восстановительного периода у равных по численности групп животных отбирали для исследования образцы крови и мочи, после чего умерщвляли и проводили патологоанатомическое исследование. На протяжении всего периода введения субстанции Фуллевир® крысам и во время восстановительного периода не было отмечено признаков изменения клинического состояния животных. Введение препарата не сказывалось на поведении, состоянии шерстного покрова, видимых слизистых оболочек подопытных животных.

Длительное, в течение 6 месяцев, ректальное введение субстанции Фуллевир® крысам не оказывало влияния на показатели периферической крови. Изменения биохимических показателей сыворотки крови, возникающие в отдельные периоды введения крысам субстанции Фуллевир®, не имеют дозовой, временной или иной зависимости. Уровень этих изменений не существенен, значения показателей не выходят за рамки нормы для данного вида животных. В результате патологоанатомического исследования не установлено морфологических признаков токсического воздействия субстанции Фуллевир® на организм подопытных крыс при ректальном введении в течение 6 месяцев в дозах 0,3-3,0 мг/кг.

Острую токсичность лекарственной формы Фуллевир® изучали при однократном ректальном введении кроликам и крысам. Введенные дозы лекарственной формы Фуллевир® составили: для кроликов - 10 мг/кг массы тела (по субстанции, что по лекарственной форме составляет 1 суппозиторий массой 2 г для кролика массой тела 2 кг); для крыс - 7,5 мг/кг массы тела (по субстанции). При наблюдении за животными не было отмечено каких-либо признаков интоксикации или местного раздражающего действия после введения препарата.

Лекарственную форму Фуллевир® испытывали в хроническом эксперименте на кроликах при ректальном введении в двух дозах (по субстанции): 0,3 мг/кг (эквитерапевтическая) и 3,0 мг/кг. Для каждой дозы были сформированы группы кроликов по 24 особи в каждой. Такое же количество кроликов составило контрольную группу. Общее количество кроликов в эксперименте 72 головы.

На протяжении всего 6-месячного курса введения лекарственной формы Фуллевир® и во время восстановительного периода не было отмечено признаков изменения клинического состояния животных. Масса тела подопытных и контрольных животных во все сроки наблюдения не имела статистически значимых отличий.

Ректальное введение лекарственной формы Фуллевир® кроликам не оказывает влияния на гематологические показатели периферической крови. Проведенным патологоанатомическим исследованием не установлено морфологических признаков токсического воздействия субстанции Фуллевир® на организм подопытных кроликов при ректальном введении в течение 6 месяцев в эквитерапевтической дозе 0,3 мг/кг (по субстанции). При воздействии дозы 3,0 мг/кг в течение 3 месяцев в одном случае были установлены признаки имевшего место ранее мелкоочагового повреждения почек, предположительно постинфарктной природы. Какой-либо другой патологии не обнаружено.

Таким образом, проведенными на лабораторных животных исследованиями субстанции нового лекарственного препарата Фуллевир® и его лекарственной формы для ректального применения установлено отсутствие выраженного повреждающего действия на органы и системы организма в диапазоне доз от эквитерапевтической - 0,3 мг/кг массы тела - до десятикратно ее превышающей. Препарат может быть рекомендован для проведения клинических исследований.

Фуллевир® в лабораторных исследованиях на животных не обладает аллергенной активностью. Не выявлено случаев возникновения гиперчувствительности немедленного или замедленного типа к препарату при разных способах введения в организм в дозах до 300 мг/кг. В этих дозах не установлено иммунотоксическое действие препарата. Фуллевир® не обладает мутагенной активностью в отношении клеток млекопитающих в дозах до 15 мг/кг.

Фармакокинетику и распределение препарата Фуллевир® по органам изучали после однократного введения в дозах 0,25 и 2,5 мг/кг на двух видах животных: мыши и кролики.

Площадь под кинетической кривой «концентрация (С) - время (t)» (AUC) составила: для дозы 0,25 мг/кг - 490 нг × час/мл, для 2,5 мг/кг - 4881 нг × час/мл.

Установлена линейность изменения концентрации (С) препарата Фуллевир® в плазме от дозы в изученном диапазоне доз (0,25 и 2,5 мг/кг).

Анализ данных по тканевой доступности (f_Т), характеризующей интенсивность проникновения препарата в периферические ткани, показывает, что Фуллевир® проникает во все органы. Наиболее интенсивно Фуллевир® проникает в печень, селезенку, почки, легкие, тимус и сердце. Малодоступны для препарата мозг и сальник.

Среднее время удерживания (MRT_т) для всех органов превышает среднее время удержания в плазме.

Фуллевир® в терапевтических дозах хорошо связывается с белками плазмы. Фуллевир® элиминируется в неизмененном виде. Изучение экскреции препарата Фуллевир® показало, что за трое суток с мочой выводится 52-54% от введенной дозы.

Таким образом экспериментальные исследования препарата фуллевир показали, что он эффективен против ВИЧ-инфекции.

Применение препарата фуллевир при лечении больных с ВИЧ-инфекцией приводит к снижению вирусной нагрузки в лимфоцитах и сыворотки крови, увеличению количества CD-4 клеток, увеличению длительности ремиссии, предотвращению оппортунистических инфекций, возникающих на фоне иммунодефицита, и может быть показано к применению при СПИД и ВИЧ ассоциированных заболеваниях.

Перед началом терапии необходимо проводит полное клинико-лабораторное обследование больного с обязательным определением уровня вирусной нагрузки на плазму и количества Т-4 лимфоцитов. До лечения и во время лечения необходимо также контролировать количество вируса в лимфоцитах, выделенных из крови больных.

Необходимо также регулярно контролировать функцию почек, определять содержание форменных элементов крови, осуществлять неврологическое обследование.

Не рекомендуется во время лечения заявленным средством комбинировать с нейро- и нейротоксичными препаратами.

Курс лечения подбирается индивидуально и зависит от степени тяжести заболевания, а также от реакции больного на лечение. Эффективно сочетание с однократной инфузией препарата фуллевир.

Рекомендуемый курс лечения:

- интенсивная терапия: по 1 суппозиторию ректально ежедневно в течение 3 месяцев. Возможны повторные курсы лечения после консультации врача;

- поддерживающая терапия: по 1 суппозиторию ректально 1 раз в три дня.

Противопоказанием для лечения является выраженная почечная недостаточность.

Доза препарата фуллевир при клиренсе креатинина 50% от нормы должна быть уменьшена в два раза. Препарат фуллевир противопоказан лицам, если клиренс составляет 30% от нормы.

Противопоказанием может явиться доброкачественная гиперплазия предстательной железы, вызывающая нарушения мочеспускания.

Гипоальбуминемия может привести к усилению фармакологического эффекта.

Препарат не назначают пациентам с повышенной чувствительностью к компонентам препарата.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается создания средства для лечения вирусных заболеваний, включая ВИЧ-инфекцию (СПИД и ВИЧ ассоциированные заболевания). Противовирусное средство выполнено в форме суппозитория и содержит активное вещество фуллевир (натриевая соль фуллеренполиаминокапроновой кислоты) и вспомогательные вещества - пропиленгликоль и витепсол W-35 и/или Н-15 - при следующем соотношении ингредиентов на 1 свечу массой 2 г: фуллевир 20 мг; пропиленгликоль 200 мг; витепсол остальное. Ректальное введение фуллевира не оказывает влияние на гематологические показатели периферической крови и повреждающего действия на органы и системы организма.

Противовирусное средство, характеризующееся тем, что оно выполнено в форме суппозитория и содержит активное вещество фуллевир (натриевая соль фуллеренполиаминокапроновой кислоты) и вспомогательные вещества - пропиленгликоль и витепсол W-35 и/или Н-15 при следующем соотношении ингредиентов на 1 свечу массой 2 г:

фуллевир20 мгпропиленгликоль200 мгвитепсолостальное