ПРОТИВОВИРУСНОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ СИСТЕМНОГО ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2008 года по МПК A61K31/185 A61P31/12 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается создания средства для лечения вирусных заболеваний, включая ВИЧ-инфекцию (СПИД- и ВИЧ-ассоциированные заболевания).

За последнее десятилетие появились десятки антивирусных препаратов, заметно повысивших эффективность лечения ВИЧ-инфекции. Однако активность большинства лекарств вскоре после начала терапии начинает падать из-за появления штаммов ВИЧ, резистентных к действию препаратов. Этот феномен зависит от многих факторов, среди которых и длительность лечения.

Многолетние интенсивные поиски антивирусных веществ привели к созданию ограниченного набора фармакологически активных препаратов. Многие из них обладают узким спектром действия и в большинстве случаев токсичны, что значительно ограничивает их применение как лекарственных средств. Немногочисленные синтетические противовирусные средства - мидинтан, метисазон - находят ограниченное профилактическое применение, идоксиуридин, оксолин применяются местно при вирусных заболеваниях кожи, причем токсичность первого очень высока [Фармакология. М., Медицина, 1981, с.399-401].

Задачей настоящего изобретения является создание средства, обладающего противовирусной активностью, особенно эффективного при лечении ВИЧ-инфекции, в форме концентрата для приготовления раствора для инфузий.

Для решения поставленной задачи предложено противовирусное средство для системного применения, выполненное в форме раствора для внутривенного введения и содержащее в одной ампуле 3% концентрат фуллевира (натриевая соль фуллеренполиаминокапроновой кислоты) и воду для инъекций при следующем содержании ингредиентов на 1 ампулу средства:

фуллевир30 мгвода для инъекцийдо 1 мл

при этом при внутривенном введении пациенту средство дополнительно содержит 0,9% раствор натрия хлорида или 10% раствор альбумина человека из расчета 100 мл на 1 ампулу.

Фуллевир^® представляет собой водорастворимое производное фуллерена (75 мг/мл) - натриевую соль фуллеренаминокапроновой кислоты с числом присоединенных групп не менее 2, общей формулы:

С₆₀Н_n[NH(СН₂)₅С(O)O^-]_n,

где С₆₀ - фуллереновое ядро,

NH(CH₂)₅C(О)О^- - аминокапроновый анион,

n - целое число не менее 2.

Молекулярный вес зависит от количества присоединенных аминокислот:

для натриевой соли фуллерен-тетрагидро-тетрааминокапроновой кислоты С₆₀H₄[NH(CH₂)₅C(O)O^-]₄ 4Na⁺ - равен 1333,2 г/моль.

Большинство химических реакций с фуллеренами не являются селективными, что затрудняет синтез индивидуальных соединений. Поэтому в продукте присутствуют как изомеры положения, так и соединения, отличающиеся по количеству присоединенных аминокислот.

Способ получения заявленной лекарственной формы осуществляется по общепринятой методике приготовления ампулированных средств.

Полученный раствор красно-коричневого цвета и непрозрачен.

Были проведены экспериментальные исследования по противовирусной активности фуллевира.

Наиболее адекватным способом оценки противовирусного эффекта препаратов в отношении ВИЧ является модель клеток человека, зараженных вирусом. Критерием эффективности препарата является отсутствие или снижение количества инфекционного вируса в клетках, зараженных данным вирусом.

Использовали перевиваемые лимфобластоидные клетки человека МТ-4. Клетки культивировали в концентрации 3,0-5,0·10⁵ клеток в 1 мл среды RPMI 1640 (производства НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН) с 10% сыворотки эмбрионов коров (производства НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН), 100 мкг/мл гентамицина (Фармахим, Болгария). Жизнеспособность клеток определяли окраской 0,4% раствора трипанового синего (Сигма, США).

В качестве источника вируса использовали штаммы ВИЧ-1_BRU, ВИЧ-1_899A из коллекции штаммов вирусов иммунодефицита человека ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН.

Исследовали препарат Фуллевир® в виде порошка.

В качестве антиретровирусного референс-препарата использовали препарат ретровир (азидотимидин) производства ГлаксоСмитКляйн (Бельгия).

Структура исследования:

1) Исследование цитотоксического действия препарата

К клеткам добавляли исследуемый препарат в различных концентрациях. Инкубировали клетки при 37°С в атмосфере с 5% СО₂ и 98% влажности 3-6 дней. Далее определяли жизнеспособность и количество клеток при помощи красителя.

2) Исследование противовирусного действия препарата

а) Инфицирование клеток (схема эксперимента может быть другой) - клетки человека инфицируют ВИЧ.

б) Внесение препарата - к зараженным вирусам клеткам добавляли препарат. Инкубация инфицированных клеток при 37°С в атмосфере с 5% СО₂ и 98% влажности 5-7 дней. Учет результатов: световая микроскопия - исследование цитопатического эффекта вируса (ЦПД) и вирусиндуцируемого синцитий образования (синцитий - конгломерат нескольких клеток с общей клеточной оболочкой, образовавшейся в результате слияния их мембран).

Степень цитодеструкции оценивали под микроскопом по общепринятой четырехкрестовой системе знаками + или - соответственно количеству погибших клеток в каждой из четырех лунок, соответствующих одному исследуемому показателю.

++++ - 100%-ная гибель клеток в четырех лунках, использованных в опыте на одно разведение,

+++ - 75%-ная гибель клеток в каждой из четырех лунок,

++ - 50%-ная гибель клеток в каждой из четырех лунок,

+ - 25%-ная гибель клеток в каждой из четырех лунок,

+ - - начало дегенерации,

- - отсутствие цитодеструкции.

Методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих иммуноферментных наборов фирм Биорад, Органон Техника (Нидерланды) проводили определение антигена вируса в культуральной жидкости.

Определение оптимальных условий проявления противовирусного действия препарата:

- введение препарата до инфицирования;

- введение препарата одновременно с вирусом;

- введение препарата после инфицирования клеток.

Полученные данные показали, что в концентрации 1-100 мкг/мл Фуллевир^® не оказывал заметного цитотоксического действия на лимфобластоидные клетки человека. ИК₅₀ препарата (50%-ная ингибирующая концентрация) составила 400 мкг/мл.

При исследовании противовирусной активности препарата в отношении вируса иммунодефицита человека обнаружен противовирусный эффект.

Наибольшая активность препарата отмечена при концентрации 10 мкг/мл - 95% - защита клеток. Доза Фуллевира^® 1 мкг/мл обеспечивала 80% резистентность клеток к действию вируса. При этих дозах отмечено исчезновение в клетках вирус-индуцированных синцитиев.

Данные иммуноферментного анализа подтвердили наличие обнаруженной дозовой зависимости: при концентрации препарата 0,5 мкг/мл - снижение антигена вируса в культуральной жидкости на 25,4%, при 1 мкг/мл - 63,7%, при 10 мкг/мл - 95,3%. Таким образом, ЭК₉₅ (95%-ная эффективная концентрация) составляет 10 мкг/мл.

Изучение противовирусного эффекта Фуллевира^® при различных схемах его введения (профилактической и лечебной) показало его наличие при всех изученных схемах.

Фуллевир^® в лабораторных исследованиях на животных не обладает аллергенной активностью. Не выявлено случаев возникновения гиперчувствительности немедленного или замедленного типа к препарату при разных способах введения в организм в дозах до 300 мг/кг. В этих дозах не установлено иммунотоксическое действие препарата.

Фуллевир^® не обладает мутагенной активностью в отношении клеток млекопитающих в дозах до 15 мг/кг.

Фармакокинетику и распределение препарата Фуллевир^® по органам изучали после однократного введения в дозах 0,25 и 2,5 мг/кг на двух видах животных: мыши и кролики.

Площадь под кинетической кривой «концентрация (С) - время (t)» (AUC) составила: для дозы 0,25 мг/кг - 490 нг × час/мл, для 2,5 мг/кг - 4881 нг × час/мл.

Установлена линейность изменения концентрации (С) препарата Фуллевир^® в плазме от дозы в изученном диапазоне доз (0,25 и 2,5 мг/кг).

Анализ данных по тканевой доступности (f_Т), характеризующей интенсивность проникновения препарата в периферические ткани, показывает, что Фуллевир^® проникает во все органы. Наиболее интенсивно Фуллевир^® проникает в печень, селезенку, почки, легкие, тимус и сердце. Малодоступны для препарата мозг и сальник.

Среднее время удерживания (MRT_Т) для всех органов превышает среднее время удержания в плазме.

Фуллевир^® в терапевтических дозах хорошо связывается с белками плазмы. Фуллевир^® элиминируется в неизмененном виде. Изучение экскреции препарата Фуллевир^® показало, что за трое суток с мочой выводится 52-54% от введенной дозы.

Таким образом экспериментальные исследования препарата фуллевир показали, что он эффективен против ВИЧ-инфекции.

Применение препарата фуллевир при лечении больных с ВИЧ-инфекцией приводит к снижению вирусной нагрузки в лимфоцитах и сыворотки крови, увеличению количества CD-4 клеток, увеличению длительности ремиссии, предотвращению оппортунистических инфекций, возникающих на фоне иммунодефицита и может быть показан к применению при СПИД- и ВИЧ-ассоциированных заболеваниях.

Перед началом терапии необходимо проводить полное клинико-лабораторное обследование больного с обязательным определением уровня вирусной нагрузки на плазму и количества Т-4 лимфоцитов. До лечения и во время лечения необходимо также контролировать количество вируса в лимфоцитах, выделенных из крови больных.

Необходимо также регулярно контролировать функцию почек, определять содержание форменных элементов крови, осуществлять неврологическое обследование.

Не рекомендуется во время лечения заявленным средством комбинировать с нейро- и нейротоксичными препаратами.

Фуллевир 3% концентрат для приготовления инфузий предназначен только для внутривенных инфузий (непосредственно в вену) и может применяться только в разбавленном виде.

Для внутривенного введения используют раствор препарата, приготовленный ex tempore из концентрата путем добавления 100 мл 0,9% раствора натрия хлорида или 100 мл 10% раствора альбумина человека на каждую ампулу, содержащую 1 мл 3% концентрата фуллевира.

Препарат вводят внутривенно, капельно со скоростью 3 мл (50-60 капель) в минуту.

Фуллевир в кислой среде (рН ниже 5,6) переходит в нерастворимую форму, поэтому необходимо контролировать рН растворов, используемых для разведения препарата.

Фуллевир способен к комплексообразованию с железом и его солями. Готовый к применению раствор выдерживают в течнение 20 минут при комнатной температуре. Используют только прозрачные растворы.

Раствор для инфузий каждый раз перед употреблением готовят заново

Противопоказанием для лечения является выраженная почечная недостаточность.

Доза препарата фуллевир при клиренсе креатинина 50% от нормы должна быть уменьшена в два раза. Препарат фуллевир противопоказан лицам, если клиренс составляет 30% от нормы.

Противопоказанием может явиться доброкачественная гиперплазия предстательной железы, вызывающая нарушения мочеспускания.

Гипоальбуминемия может привести к усилению фармакологического эффекта.

Препарат не назначают пациентам с повышенной чувствительностью к компонентам препарата.

Альбумин не следует применять при тромбозах, внутреннем кровотечении, повышенной чувствительности к белковым препаратам крови.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается создания средства для лечения вирусных заболеваний, включая ВИЧ-инфекцию (СПИД- и ВИЧ-ассоциированные заболевания). Противовирусное средство для системного применения выполнено в форме раствора для внутривенного введения и содержит в одной ампуле 3% концентрат фуллевира (натриевая соль фуллеренполиаминокапроновой кислоты) и воду для инъекций при следующем содержании ингредиентов на 1 ампулу средства: фуллевир 30 мг; вода для инъекций - до 1 мл, при этом при внутривенном введении пациенту средство дополнительно содержит 0,9% раствор натрия хлорида или 10% раствор альбумина человека из расчета 100 мл на 1 ампулу. Применение препарата фуллевир при лечении больных с ВИЧ-инфекцией приводит к снижению вирусной нагрузки в лимфоцитах и сыворотки крови, увеличению количества CD-4 клеток, увеличению ремиссии, предотвращению оппортунистических инфекций, возникающих на фоне иммунодефицита, и может быть показано к применению при СПИД- и ВИЧ-ассоциированных заболеваниях. 1 з.п. ф-лы.

1. Противовирусное средство для системного применения, характеризующееся тем, что оно выполнено в форме раствора для внутривенного введения и содержит в одной ампуле 3%-ный концентрат фуллевира (натриевая соль фуллеренполиаминокапроновой кислоты) и воду для инъекций при следующем содержании ингредиентов на 1 ампулу средства:

фуллевир30 мгвода для инъекцийдо 1 мл