ЭКСТРАКТЫ ECHINACEA ANGUSTIFOLIA Российский патент 2008 года по МПК A61K36/28 A61K125/00 B01D11/02 

Настоящее изобретение относится к экстрактам, получаемым из корней Echinacea angustifolia, и способам их приготовления. Экстракт можно использовать при лечении патологических состояний, при которых желательно укрепить иммунную защиту.

Эхинацея является растением, которое происходит из Северной Америки и Мексики; терапевтические свойства эхинацеи были хорошо известны аборигенам Америки, которые использовали ее при лечении ран. Вследствие того предположения, что эхинацея способна увеличивать сопротивляемость к инфекциям, в течение первых лет прошлого столетия становится широко распространенным ее использование при лечении локальных и генерализованных инфекций. Echinacea, в особенности Echinacea angustifolia, в настоящее время весьма рекомендуется для лечения простудных синдромов, в особенности, для лечения переохлаждения, для лечения ран и для лечения микозов.

Общее действие, по-видимому, связано с неспецифическим стимулированием иммунной системы и увеличением чувствительности микробов и патогенных организмов к средствам химиотерапии и антибиотикам. Заживляющие свойства могут быть приписаны способности стабилизировать гиалуроновую кислоту путем ингибирования гиалуронидазы, вызываемого одним из активных компонентов, содержащихся в данном растении, т.е. эхинакозидом, и активности массивных макрофагов, вызываемой полисахаридами. Таким образом, некоторые очаги инфекции остаются локализованными, что поддерживается аккумулированием мукополисахаридов и гистопластических веществ, необходимых для восстановительных процессов.

Поэтому для оптимизации способности Echinacea стимулировать иммунную систему желательно производить экстракты, обогащенные эхинакозидом и полисахаридами.

Среди активных компонентов данного растения также имеются вещества, относящиеся к классу алкиламидов, в частности, эхинацеин и изобутиламиды ундециленовой и додекановой кислот, которые, кроме того, проявляют фитотерапевтические свойства, ингибируя циклооксигеназу (Planta Med. 60(1):37-40, 1994) и 5-липоксигеназу in vitro.

Алкиламиды, хотя и проявляют биологическую активность, являются весьма токсичными. Действительно, проведенные заявителем исследования по совместному воздействию с конкавалином-А (Con-A) или липополисахаридом (LPS) на спленоциты мыши in vitro, доказывают, что алкиламиды являются цитотоксичными, начиная с концентрации 1 мкг/мл. Более того, экстракты, содержащие 20% алкиламидов, существенно подавляют моторику кишечника у мышей при введении i.p. именно в дозе 5 мг/мл или выше и имеют DL₅₀ 236 мг/кг при пероральном введении. Экстракты, содержащие 0,5% алкиламидов, также токсичны, как показано в экспериментах по подострой токсичности, т.е. когда животных обрабатывают в течение 30 дней физиологически активными дозами.

Таким образом, желательно приготовление экстрактов Echinacea с пониженным содержанием алкиламидов и обогащенных эхинакозидом и полисахаридами.

Экстракты эхинацеи могут быть получены с растворителями, например, со смесью этанол/вода или с надкритическим диоксидом углерода.

WO 01/22977 раскрывает способ получения экстрактов Echinacea, содержащих стандартизованные количества двух или трех компонентов данного растения, в частности, полисахаридов, цикориевой кислоты и алкиламидов. Каждый компонент экстрагируется из разных частей растения смесями этанол/вода в течение продолжительного времени. Данные экстракты затем комбинируют для составления фармацевтической композиции.

Объект настоящего изобретения представляет собой экстракт Echinacea angustifolia, характеризующийся содержанием алкиламидов ниже 0,1%, уровнем содержания эхинакозида от 1 до 10% и содержащий от 1 до 15% полисахарида, характерного для Echinacea angustifolia (здесь и далее называемого «данный полисахарид»). Данный полисахарид весит 1,3×10⁵ Да и содержит рамнозу, арабинозу, галактозу и галактуроновую кислоту в соотношении 0,5:2,5:1,75:10,25, имеет основной структурный фрагмент, в котором чередуются линейные и разветвленные участки, линейные участки состоят из частично ацетилированных (9%) и метилированных (35%) остатков галактуроновой кислоты, связанных через α-(1-4) связи, и разветвленные участки состоят из чередования галактуроновой кислоты и рамнозы, к которой присоединены боковые цепи, содержащие арабинозу и галактозу в соотношении 2,5:1,75.

Экстракт получают из корней дикорастущей или культивированной Echinacea angustifolia способом, включающим следующие стадии:

1) экстрагирование корневищ органическим растворителем или смесью органический растворитель/вода, содержание воды в которой составляет не более 40% (об./об.), и неоднократное промывание объединенного и сконцентрированного экстрактов неполярным растворителем;

2) экстрагирование корневищ водой или смесью органический растворитель/вода, содержание воды в которой составляет 60% (об./об.) или выше, предпочтительно от 80 до 85% (об./об.).

3) смешивание экстрактов, полученных на предыдущих стадиях.

Для целей настоящего изобретения «органический растворитель» означает органический растворитель, выбранный из ацетона или спирта, содержащего от одного до трех атомов углерода, предпочтительно, этанола.

Первая стадия, которая позволяет удалить алкиламидные компоненты и получить экстракт, обогащенный эхинакозидом, предпочтительно включает:

1а) экстрагирование корневищ при температуре в пределах от 20°C до температуры кипения с обратным холодильником органического растворителя или смеси вода/органический растворитель, предпочтительно, до температуры кипения с обратным холодильником;

1b) концентрирование объединенных экстрактов до малого объема;

1c) растворение концентрата в смеси вода/органический растворитель, в которой содержание воды составляет не ниже 50%;

1d) повторные промывания смеси в воде/органическом растворителе неполярным растворителем, выбранным, например, из петролейного эфира, пентана, гексана или гептана, предпочтительно, гексана;

1e) выпаривание смеси вода/органический растворитель.

Вторая стадия, которая позволяет получить экстракт, обогащенный полисахаридом, предпочтительно включает:

2а) экстрагирование корневищ при температуре в интервале от 20°C до температуры кипения воды или смеси растворителей, предпочтительно, в интервале от 40 до 70°C;

2b) концентрирование экстракта до малого объема;

2с) растворение остатка в смеси вода/органический растворитель с содержанием органического растворителя от 50 до 70% (об./об.) с получением осадка;

2d) фильтрование и промывание осадка таким же растворителем.

В соответствии с предпочтительным воплощением настоящего изобретения стадию 2с осуществляют с использованием этанола, более предпочтительно, с 66,5% (об./об.) этанолом, т.е. остаток, полученный на стадии 2b, растворяют в трех частях воды и добавляют 7 объемов 95% (об./об.) этанола при комнатной температуре и при перемешивании.

Третья стадия предпочтительно включает:

3a) растворение объединенных экстрактов, полученных на предыдущих стадиях, в смеси вода/органический растворитель, предпочтительно в органическом растворителе, представляющем собой этанол с содержанием воды 60% (об./об.) или выше, предпочтительный интервал составляет от 80 до 85% (об./об.);

3b) концентрирование полученного раствора на основе растворителя вода/органический растворитель и его высушивание при низком давлении.

Экстрагирование на стадии 1a предпочтительно осуществляют 90% (об./об.) этанолом, тогда как экстрагирование на стадии 2a предпочтительно осуществляют 15% (об./об.) этанолом.

Экстракт настоящего изобретения показывает иммуностимулирующие свойства на мышах, в частности, он способен стимулировать активацию Т-лимфоцитов и сокращать смертность от инфекции, вызванной Candida albicans у мышей с иммунитетом, подавленным циклоспорином А. Поэтому экстракт по настоящему изобретению можно использовать для производства медикаментов, пищевых добавок или нутрацевтических композиций для введения в условиях, когда желательно укрепление иммунной системы организма.

Данный экстракт можно составить в соответствии с общепринятыми методиками, например, в соответствии с теми, которые описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook, XVII ed. Mack. Pub., N.Y., U.S.A.

Настоящее изобретение далее иллюстрируется несколькими примерами.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Стадия 1: Приготовление экстракта, обогащенного эхинакозидом

600 г почвенных корневищ Echinacea angustifolia помещают в экстрактор и экстрагируют при температуре кипения с обратным холодильником в течение 4 ч в 2,5 л 90% (об./об.) этанола. После собирания экстракта семь следующих экстракций проводят тем же растворителем; экстракты смешивают, и корневища сохраняют для следующей стадии.

Объединенный экстракт фильтруют и концентрируют при пониженном давлении до малого объема. Концентрат разбавляют водой и этанолом, получая 50% (об./об.) этанольный раствор, который затем десятикратно экстрагируют гексаном. Гексановый слой, содержащий алкиламиды, отбрасывают.

Очищенный водно-спиртовой раствор концентрируют досуха при пониженном давлении с получением 78,5 г экстракта (титр эхинакозида по данным ВЭЖХ 9,8%, титр алкиламидов по данным ВЭЖХ 0,07%).

Пример 2

Стадия 2: приготовление экстракта, обогащенного полисахаридом

Корневища Echinacea angustifolia, полученные после экстракции 90% (об./об.) этанолом в соответствии с примером 1, далее восьмикратно экстрагируют 2,5 л 15% (об./об.) этанола при 70°C.

Объединенные экстракты фильтруют и концентрируют досуха при пониженном давлении. Полученный сухой экстракт (171 г) растворяют в 510 мл воды и добавляют при перемешивании 1200 мл 95% (об./об.) этанола. Осадок фильтруют, промывают 66,5% (об./об.) этанолом и сушат при 60°C при пониженном давлении с получением 130 г очищенного экстракта (титр полисахарида по данным ГПХ 8,9%).

Пример 3

Смешивание промежуточных экстрактов

78,5 г экстракта, обогащенного эхинакозидом, объединяют со 106,5 г экстракта, обогащенного полисахаридом. Смесь доводят до 925 мл 15% (об./об.) этанолом, перемешивают в течение 1 часа и концентрируют досуха при пониженном давлении с получением 185 г экстракта Echinacea angustifolia (титр эхинакозида по данным ВЭЖХ 4,2%, титр алкиламидов по данным ВЭЖХ 0,04%, титр полисахарида по данным ВЭЖХ 5,12%). Профиль ВЭЖХ данного экстракта представлен на фиг.1 (неполисахаридная фракция) и 2 (полисахаридная фракция).

Пример 4

Определение содержания полисахарида с помощью ВЭЖХ

Исследование данных экстрактов на содержание полисахарида настоящего изобретения проводят на колонке TosoHaas TSK-Gel G 5000 PWXL, элюируя водой, содержащей 0,5% триэтиламина, в изократических условиях при скорости потока 0,5 мл/мин. В течение данного анализа, продолжавшегося 30 минут, поддерживали температуру колонки 50°C.

Инъекционный объем составил 50 мкл. Испарительный детектор ELSD (Детектор Испарительного Светорассеяния) Sedex mod.75 (S.E.D.E.R.E) c присоединенным распылителем, поддерживающим 60°C при давлении газа 2,2 бар.

Пример 5

Определение содержания эхинакозида и алкиламидов с помощью ВЭЖХ

Определение с помощью ВЭЖХ содержания эхинакозида и алкиламидов в экстрактах Echinacea angustifolia проводили на обращенно-фазовой колонке Agilent Zorbax SB-C18, соединенной с детектором УФ и видимого света (длина волны 235 нм), элюируемой подходящим градиентом вода/ацетонитрил, содержащим 0,01% трифторуксусной кислоты, при скорости потока 1,0 мл/мин. В течение данного анализа, продолжавшегося 30 минут, поддерживали комнатную температуру колонки.

Инъекционный объем составил 10 мкл.

БИОЛОГИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Эксперимент 1

Тест на образование γ-интерферона Т-лимфоцитами (Zucca M. et al., New Microbiol., 1996, 19, 39-46)

Мышиные Т-лимфоциты, полученные отделением от спленоцитов на колонке с нейлоновым волокном, культивировали в среде 1640 RPMI с 4% эмбриональной телячьей сывороткой в планшете для микротитрования с дополнительной предварительной инкубацией с α-CD3 (анти-CD3 моноклональные антитела в качестве активатора клеточной функции, ответственного за продуцирование интерферона). Через 48 часов после добавления тестируемых соединений оценивали высвобождение γ-интерферона в инкубационной среде.

Таблица 1Лечениеγ-интерферон пг/млСреда4,5±0,5α-CD3149,5±25,0α-CD3+экстракт примера 5, 0,1 мкг/мл280,0±35,8α-CD3+экстракт примера 5, 1,0 мкг/мл355,8±61,4α-CD3+экстракт примера 5, 10,0 мкг/мл442,0±70,5

Эксперимент 2

Влияние на смертность, вызванную Candida albicans у мышей (Microbiology, 2000, 146,1881-9)

Дрожжи культивировали на среде Sabouraud с агаром и инокулировали внутривенно в концентрации 3,5×10⁵ мышам с неподавленным иммунитетом и в концентрации 2,9×10⁵ мышам с иммунитетом, подавленным циклоспорином А (CsA) в дозе 1 мг/кг i.p. Мышей подвергали лечению ежедневно именно 5 и 10 мг/кг i.p. экстракта настоящего изобретения до смерти всех мышей контрольной группы (не подвергавшихся лечению). Результаты доказывают выживание групп животных, подвергавшихся лечению.

Таблица 2Лечение% выживших животныхCandida albicans (CA)+CsA0CA+экстракт примера 5, 500 мг/кг20CA+экстракт примера 5, 1000 мг/кг40CA+CSa0CA+Csa+экстракт примера 5, 500 мг/кг30CA+Csa+экстракт примера 5, 1000 мг/кг60

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и используется при лечении патологических состояний, при которых желательно укрепление иммунной системы. Экстракт корневищ Echinacea angustifolia для лечения патологических состояний, при которых желательно укреплять иммунную систему, характеризующийся определенным содержанием алкиламидов, эхинакозида, полисахарида, при этом полисахарид имеет определенную массу и состоит из рамнозы, арабинозы, галактозы и галактуроновой кислоты в определенном соотношении. Способ получения экстракта, включающий экстрагирование корневищ Echinacea angustifolia органическим растворителем или смесью органический растворитель/вода, при определенном содержании воды и последовательное промывание объединенного и сконцентрированного экстрактов неполярным растворителем, экстрагирование корневищ Echinacea angustifolia водой или смесью органический растворитель/вода, при определенном содержании воды, смешивание экстрактов, полученных на предыдущих стадиях. Применение экстракта корневищ Echinacea angustifolia для изготовления фармацевтических и нутрацевтических композиций и пищевых добавок, предназначенных для лечения патологических состояний, при которых желательно укрепить иммунную систему. Фармацевтические или нутрацевтические композиции и пищевые добавки, содержащие экстракт корневищ Echinacea angustifolia в смеси с подходящими наполнителями и/или носителями для лечения патологических состояний, при которых желательно укрепить иммунную систему. Вышеописанный экстракт, композициии и пищевые добавки на его основе обладают повышенным иммуностимулирующим действием. 4 н. и 12 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл.

1. Экстракт корневищ Echinacea angustifolia, характеризующийся содержанием алкиламидов ниже, чем 0,1%, содержанием эхинакозида от 1 до 10% и содержанием полисахарида от 1 до 15%, полисахарид имеет массу 1,3×10⁵ Да и состоит из рамнозы, арабинозы, галактозы и галактуроновой кислоты в соотношении 0,5:2,5:1,75:10,25 для лечения патологических состояний, при которых желательно укреплять иммунную систему.2. Экстракт по п.1, в котором полисахарид имеет основной структурный фрагмент с чередующимися линейными и разветвленными участками, линейные участки состоят из частично ацетилированных и метилированных остатков галактуроновой кислоты, связанных через α-(1-4) связи, и разветвленные участки состоят из чередования галактуроновой кислоты и рамнозы, к которой присоединены боковые цепи, содержащие арабинозу и галактозу в соотношении 2,5:1,75.3. Способ получения экстракта по любому из предыдущих пунктов, который включает следующие стадии:

1) экстрагирование корневищ органическим растворителем или смесью органический растворитель/вода, содержание воды в которой составляет не более 40% (об./об.) и последовательное промывание объединенного и сконцентрированного экстрактов неполярным растворителем;

2) экстрагирование корневищ водой или смесью органический растворитель/вода, содержание воды в которой составляет 60% (об./об.) или выше;

3) смешивание экстрактов, полученных на предыдущих стадиях.

1а) экстрагирование корневищ при температуре в интервале от 20°С до температуры кипения с обратным холодильником органического растворителя или смеси вода/органический растворитель;

1b) концентрирование объединенных экстрактов до малого объема;

1с) растворение концентрата в смеси вода/органический растворитель, содержание воды в которой не ниже 50% (об./об.);

1d) повторяющееся промывание смеси в воде/органическом растворителе неполярным растворителем;

1е) выпаривание смеси вода/органический растворитель.

2а) экстрагирование корневищ, полученных после экстрагирования на предыдущей стадии, при температуре от 20°С до температуры кипения воды или смеси растворителей;

2b) концентрирование экстракта до малого объема;

2с) растворение остатка в смеси вода/органический растворитель с содержанием органического растворителя от 50 до 70% (об./об.) с получением осадка;

2d) фильтрование и промывание осадка упомянутым смешанным растворителем.

3а) растворение объединенных экстрактов, полученных на предыдущих

стадиях, в смеси вода/органический растворитель с содержанием воды 60% (об./об.) или выше;

3b) концентрирование водноспиртового раствора и его высушивание при пониженном давлении.