НОВЫЕ ПРИМЕНЕНИЯ И СПОСОБЫ Российский патент 2022 года по МПК A61K36/63 A61P3/04 A61P3/06 A61P3/08 A61P3/10 A61P19/02 A61P29/00 

Данное изобретение относится к экстрактам из Fraxinus angustifolia (в частности, из их крылаток), способам получения такого экстракта и способам, и применениям, связанным с такими экстрактами. В частности, данное изобретение относится к способам лечения дисбиоза кишечной микробиоты, связанного с обратимым ожирением, и/или связанного с метаболическим синдромом, лечения или профилактики патологических состояний, таких как стеатоз печени, неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) и неалкогольный стеатогепатит (НАСГ) и модуляции и/или коррекции кишечной микробиоты.

Перечень или обсуждение очевидно ранее опубликованных документов в данном описании не должно обязательно рассматриваться как признание того, что указанный документ является частью известного уровня техники или является общеизвестным.

Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) представляет собой патологическое состояние, определяемое чрезмерным накоплением жира в форме триглицеридов (стеатоз) в печени (определяемое как накопление более чем в 5% гепатоцитов гистологически). Это наиболее распространенное заболевание печени в развитых странах; которое, например, затрагивает около 30% взрослого населения США. Если его не лечить, патологическое состояние может прогрессивно ухудшаться и в конечном итоге может привести к циррозу печени. НАЖБП особенно распространена у пациентов с ожирением, причем считаются, что около 80% имеют заболевание.

Подгруппа пациентов с НАЖБП демонстрирует повреждение клеток печени и воспаление в дополнение к чрезмерному накоплению жира. Данное патологическое состояние, обозначаемое как неалкогольный стеатогепатит (НАСГ), практически не отличается гистологически от алкогольного стеатогепатита (АСГ) (как описано Всемирной организацией гастроэнтерологов (WGO) в международном руководстве WGO: неалкогольная болезнь печени и неалкогольный стеатогепатит (2012)). В то время как простой стеатоз, наблюдаемый при НАЖБП, прямо не коррелирует с повышенной кратковременной заболеваемостью или смертностью, прогрессирование данного патологического состояния до НАСГ резко повышает риск развития цирроза, печеночной недостаточности и гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК).

В то время как заболеваемость и смертность от болезней печени у пациентов с НАСГ значительно увеличиваются, они еще сильнее коррелируют с заболеваемостью и смертностью от сердечно-сосудистых заболеваний. Широко распространено мнение, что НАСГ представляет собой экспрессию в печени при патологических состояниях, обычно называемых метаболическим синдромом, которые включают заболевания, связанные с сахарным диабетом 2 типа, инсулинорезистентностью, центральным (трункальным) типом ожирения, гиперлипидемией, холестерином липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), гипертриглицеридемией и гипертонией (см., например, Wiernsperger, N., Diabetes Metab Syndr Obes, 6, 379-388 (2013)).

В настоящее время во всем мире наблюдается эпидемия диабета и ожирения. По меньшей мере 1,46 миллиарда взрослых имели избыточный вес или страдали ожирением, и по состоянию на 2008 год около 170 миллионов детей в мире были определены как имеющие избыточный вес или ожирение. Эти цифры продолжают расти, что указывает на то, что НАСГ станет все более распространенной проблемой печени как в богатых, так и в развивающихся странах, увеличивая глобальное бремя заболеваний печени и влияя на общественное здравоохранение и расходы на здравоохранение во всем мире.

По оценкам, в 2012 году НАЖБП и НАСГ увеличат прямые и косвенные расходы на медицинское обслуживание в течение пяти лет примерно на 26%. Как указано выше, сейчас по оценкам около 30% всех взрослых в развитых странах имеют НАЖБП, и считается, что около 2-6% таких взрослых имеют НАСГ. В частности, считается, что НАЖБП поражает до 70-80% индивидуумов с ожирением (см., например, Younossi, Z.М. et al., Clin Gastroenterol Hepatol, 9, 524-530 (2011)).

Точная причина возникновения НАСГ не была выяснена, и почти наверняка не у всех пациентов она одинакова. Она наиболее тесно связана с резистентностью к инсулину, ожирением и метаболическим синдромом; однако не все пациенты с данными патологическими состояниями имеют НАЖБП/НАСГ, и не все пациенты с НАЖБП/НАСГ страдают одним из этих патологических состояний. Тем не менее, учитывая, что НАСГ является потенциально смертельным патологическим состоянием, приводящим к циррозу, печеночной недостаточности и ГЦК, крайне необходимо эффективное лечение.

В настоящее время не существует научно обоснованной лекарственной терапии для НАЖБП/НАСГ. Изменение образа жизни имеет решающее значение при любой попытке изменить течение НАЖБП/НАСГ, а целью терапии является резистентность к инсулину и окислительный стресс. Несмотря на то, что оценивается несколько вариантов лечения, эффективность большинства видов лечения остается неопределенной, или эффекты отменяются, когда варианты лечения прекращают. Цели лечения НАСГ состоят в том, чтобы уменьшить гистологические особенности и улучшить резистентность к инсулину и уровни ферментов печени.

Кишечная микробиота человека состоит из триллионов микроорганизмов, большинство из которых имеют бактериальное и вирусное происхождение и считаются непатогенными. Микробиота функционирует в тандеме с защитой хозяина и иммунной системой для защиты от патогенной колонизации и инвазии. Она также выполняет важную метаболическую функцию, выступая в качестве источника необходимых питательных веществ и витаминов и помогая извлекать энергию и питательные вещества, такие как короткоцепочечные жирные кислоты (SCFA) и аминокислоты, из пищи (см., например, Carding, S. et al, Microb Ecol Health Dis, 26, 26191 (2015)).

Исследования культуры микроорганизмов выявили только небольшое количество видов кишечных бактерий. В настоящее время состав и разнообразие кишечной микробиоты выявляется при помощи культурально-независимых генетических и метагеномных методов. Метагеномный анализ и сиквенирование генов 16S рибосомной РНК продемонстрировали, что на уровне типов доминируют Firmicutes и Bacteriodetes, а также присутствуют Actinobacteria, Proteobacteria, Fusobacteria, Spirochaetae, Verrucomicrobia и Lentisphaerae (из того же источника). В то время как доминирующие типы относительно постоянны среди индивидуумов, разнообразие увеличивается по таксономической линии, причем каждый индивидуум содержит более ста уникальных видов.

Кишечная микробиота развилась вместе с людьми в качестве мутуалистического партнера; тем не менее, изменения в составе кишечной микробиоты, то есть изменение экологической организации кишечной микробиоты (широко известное как дисбиоз), как было установлено, связано с несколькими клиническими состояниями, такими как ожирение, диабет, атеросклероз, аллергические заболевания, желудочно-кишечные заболевания, аутоиммунные заболевания и рак (см., например, Serino, М., et al., Curr Cardiol Rep, 16(11), 540 (2014)), и также НАЖБП (см., например, Boursier, J. and Diehl, A.M., PLoS Pathog, 11(1), e1004559 (2015)). Действительно, считается, что дисбиоз кишечной микробиоты может привести к изменению защиты кишечника, увеличению бактериальной транслокации, что в свою очередь вызывает воспаление тканей и стеатоз печени.

Возможная роль кишечной микробиоты в прогрессировании стеатоза печени включает несколько потенциальных механизмов действия: индукцию ожирения за счет сбора энергии из других неперевариваемых алиментарных полисахаридов; регуляции проницаемости кишечника и стимуляции слабого воспаления; модуляции метаболизма алиментарного холина; и стимуляции эндогенного продуцирования этанола кишечными бактериями (см. Arslan, N., World J Gastroenterol, 20(44), 16452-16463 (2014)).

Более того, считается, что микробиота, вызывающая ожирение, может изменять функцию печени, стимулируя печеночные триглицериды и модулируя системный метаболизм липидов, что может косвенно влиять на накопление жирных кислот в печени. Поэтому восстановление оптимальной системы микроорганизмов кишечника могло бы стать многообещающей стратегией предотвращения прогрессирования стеатоза и, в частности, остановки прогрессирования НАЖБП в НАСГ.

Авторы данного изобретения неожиданно обнаружили, что экстракты, полученные из крылаток и семян Fraxinus angustifolia (в данном документе упоминается как FA) (в частности, из крылаток) обладают сильной активностью в обращении дисбиоза микробиоты кишечника путем модуляции или коррекции кишечной микробиоты. Эти эффекты предполагают, что такие экстракты Fraxinus angustifolia могут иметь многочисленные терапевтические и нетерапевтические (например, косметические) применения, и применения в профилактике заболеваний.

Экстракты Fraxinus angustifolia

В соответствии с данным изобретением, в данном документе обеспечивается экстракт Fraxinus angustifolia (FA) (в частности, экстракт семян крылатки Fraxinus angustifolia (в частности, крылатки)), который может далее упоминаться как «экстракт согласно изобретению».

Как правило, экстракт согласно изобретению может представлять собой экстракт, полученный из FA (в частности, крылаток или семян FA) с использованием процессов, как описано в данном документе.

Во избежание неоднозначности, все ссылки в данном документе на экстракт Fraxinus angustifolia (FA) будут относиться, в частности, к экстрактам, полученным из экстракта крылаток или семян FA (более конкретно, из крылаток). Кроме того, поскольку крылатка FA будет содержать семена FA, следует понимать, что экстракты из крылаток FA будут содержать (или состоять по существу/состоять из) экстракты из семян FA (крылаток).

Экстракт согласно изобретению может представлять собой водный экстракт, спиртовой экстракт или водно-спиртовой экстракт. Предпочтительно экстракт согласно изобретению представляет собой водно-спиртовой экстракт, такой как водно-метанольный или водно-этанольный экстракт. Например, экстракт согласно изобретению может представлять собой водно-этанольный экстракт, полученный с использованием растворителя для экстракции, содержащего от около 1 до около 99% этанола в воде, например, от около 30% до около 75% этанола в воде, или от около 30% до около 50% этанола в воде, например, от около 35% или от около 40% этанола в воде.

Термин «водный экстракт», используемый в данном документе, относится к экстракту, полученному из Fraxinus angustifolia (FA) при экстракции из растения (в частности, из крылаток), выполненной с использованием воды в качестве единственного растворителя.

Термин «спиртовой экстракт», используемый в данном документе, относится к экстракту, полученному из Fraxinus angustifolia (FA) при экстракции из растения (в частности, из крылатки), выполненной с использованием спирта в качестве единственного растворителя. Например, 100% метанола и/или 100% этанола.

Термин «водно-спиртовой экстракт», используемый в данном описании, относится к экстракту, полученному из Fraxinus angustifolia (FA) при экстракции из растения, выполненной с использованием смеси воды и спирта. Например, от около 1% до около 99% спирта (например, этанола) в воде, такой экстракт будет называться водно-этанольным экстрактом.

В некоторых вариантах осуществления экстракт согласно изобретению может содержать (или по существу состоять/состоять из) следующие соединения (секоиридоиды):

(i) от около 1 мас. % до около 16 мас. % нуженида, например, от около 1 мас. % до около 15 мас. %;

(ii) от около 1 мас. % до около 18 мас. % GL3, например, от около 1 мас. % до около 17 мас. %;

(iii) от около 0,5 мас. % до около 1 мас. % сложного метилового эфира олеозида;

(iv) от около 0,03 мас. % до около 0,12 мас. % эксельсида В;

(v) от около 0,1 мас. % до около 1,7 мас. % GL5; и/или (например, и)

(vi) от около 0,08 мас. % до около 0,8 мас. % салидрозида, например, от около 0,08 мас. % до около 0,7 мас. %.

Если в данном документе не указано иное, приведенные массовые проценты основаны на общей массе полученного (сухого) экстракта.

Во избежание неоднозначности предпочтения, варианты, конкретные признаки и тому подобное, указанные для данного аспекта, признака или параметра изобретения, должны, если контекст не указывает иное, рассматриваться как раскрытые в комбинации с любыми и всеми другими предпочтениями, вариантами конкретных признаков и тому подобное, как указано для тех же или других аспектов, признаков и параметров изобретения.

Когда мы используем термин «содержащий» или «содержит», мы подразумеваем, что описываемый экстракт или композиция должны содержать перечисленные ингредиенты, но могут дополнительно содержать дополнительные ингредиенты. Когда мы используем термин «состоящий по существу из» или «состоит по существу из», мы подразумеваем, что описываемый экстракт или композиция должны содержать перечисленные ингредиенты и могут также содержать небольшие количества (например, до 5 мас. % или более до 1 мас. % или 0,1 мас. %) других ингредиентов при условии, что любые дополнительные ингредиенты не влияют на основные свойства экстракта или композиции. Когда мы используем термин «состоящий из» или «состоит из», мы подразумеваем, что описываемый экстракт или композиция должны содержать только перечисленные ингредиенты.

Используемый в данном документе термин «около», например, когда он относится к измеряемому значению (такому как количество или масса конкретного компонента в реакционной смеси), относится к изменениям ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, ±0,5% или, в частности, ±0,1% от указанного количества.

Например, в некоторых вариантах осуществления экстракт согласно изобретению может содержать (или состоять по существу/состоять из) около 10 мас. % нуженида и/или (например, и) около 10 мас. % GL3.

Во избежание неоднозначности структуры вышеупомянутых соединений изображены ниже.

Кроме того, другие соединения также могут присутствовать в экстракте согласно изобретению. В некоторых вариантах осуществления другие соединения, которые могут присутствовать, включают, но не ограничиваются ими, кумарины, такие как фраксин, фраксетин, эскулин, эскулетин, скополин, 7-метилэкулин и глюкозид фраксидина.

Например, в определенных вариантах осуществления экстракт согласно изобретению может дополнительно содержать (или состоять по существу/состоять из):

фраксин (около 0,095%);

фраксетин (около 0,117%);

эскулин (около 0,017%);

эскулетин (около 0,017%);

скополин (около 0,038%);

7-метилэкулин (около 0,040%); и/или (например, и)

глюкозид фраксидина (около 0,061%).

В конкретных вариантах осуществления общее количество кумаринов (рассчитанное на основе обнаруженных кумаринов в виде фраксина) составляло около 0,39%. Кроме того, другие кумарины могут быть идентифицированы (например, с помощью LC/MS) на уровнях, слишком низких для количественной оценки (поскольку их присутствие было ниже 5 м.д.), но могут включать цихориин, скополетин, калинкантозид, мандшурин, фраксидин, изофраксидин и фраксинол.

Квалифицированному специалисту будет понятно, что экстракт согласно изобретению может быть представлен в твердой форме. Под твердой формой подразумевается, что соединение может быть представлено в виде аморфного твердого вещества или в виде кристаллического или частично кристаллического твердого вещества.

Композиции и введение

Согласно данному изобретению экстракт согласно изобретению может быть обеспечен в форме (подходящей) композиции, такой как фармацевтическая композиция или пищевая композиция (которая может называться функциональной пищевой композицией или диетической композицией).

В конкретных вариантах осуществления экстракт согласно изобретению может быть обеспечен в форме фармацевтической композиции (которая также может называться фармацевтической композицией) или функциональной пищевой композиции, содержащей экстракт согласно изобретению и, необязательно, фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество или (функциональный) приемлемый для пищи ингредиент, при необходимости.

Используемые в данном документе ссылки на фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества могут относиться к фармацевтически приемлемым адъювантам, разбавителям и/или носителям, как известно специалистам в данной области техники.

К пищевым приемлемым ингредиентам относятся те, которые известны в данной области техники (включая те, которые также упоминаются в данном документе как фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества) и которые могут быть природными или неприродными, то есть их структура может встречаться в природе или нет. В некоторых случаях они могут происходить из природных соединений и быть впоследствии модифицированы (например, мальтодекстрин)

В конкретных вариантах осуществления экстракт согласно изобретению может быть представлен в форме фармацевтической композиции или функциональной пищевой композиции, дополнительно содержащей неприродный носитель или модифицированный природный носитель, такой как мальтодекстрин.

Под «фармацевтически приемлемым» подразумевается, что дополнительные компоненты композиции являются стерильными и апирогенными. Такие компоненты должны быть «приемлемыми» в том смысле, что они совместимы с экстрактом согласно изобретению и безвредны для получающих его пациентов. Таким образом, «фармацевтически приемлемый» включает любое соединение(я), используемое при формировании части состава, которое предназначено для действия только в качестве вспомогательного вещества, т.е. не предназначено для самой биологической активности. Таким образом, фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, как правило, безопасно, нетоксично и ни биологически, ни иным образом нежелательно.

Квалифицированному специалисту будет понятно, что экстракты согласно изобретению (например, в форме композиций, таких как фармацевтические композиции, известные специалистам в данной области техники, такие как описанные в данном документе) могут быть введены пациенту или субъекту (например, больному человеку или животному, или субъекту) любым подходящим путем, например, пероральным, ректальным, назальным, легочным, трансбуккальным, сублингвальным, трансдермальным, интрацистернальным, внутрибрюшинным и парентеральным путем (включая подкожный, внутримышечный, интратекальный, внутривенный и интрадермальный).

В частности, экстракты согласно изобретению можно применять перорально. В таких случаях фармацевтические композиции согласно данному изобретению могут быть специально составлены для введения пероральным путем.

Фармацевтические композиции для перорального введения включают твердые лекарственные формы, такие как твердые или мягкие капсулы, таблетки, троше, драже, пилюли, пастилки, порошки и гранулы. При необходимости они могут быть приготовлены с покрытиями, такими как кишечнорастворимые покрытия, или они могут быть составлены таким образом, чтобы обеспечить контролируемое высвобождение активного ингредиента, такое как замедленное или пролонгированное высвобождение, в соответствии со способами, хорошо известными в данной области техники.

Жидкие лекарственные формы для перорального введения включают растворы, эмульсии, водные или масляные суспензии, сиропы и эликсиры.

Композиции (например, фармацевтические или пищевые композиции), описанные в данном документе, такие как те, которые предназначены для перорального введения, могут быть получены в соответствии со способами, известными специалистам в данной области техники, такими как добавление компонентов композиции в смесь.

Такие композиции, как описано в данном документе, могут содержать один или более дополнительных компонентов, выбранных из группы, состоящей из пищевых ингредиентов, таких как подсластители, ароматизаторы, красители и консерванты. Таблетки могут содержать активный ингредиент(ы) в смеси с нетоксичными фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами (или ингредиентами), которые подходят для изготовления таблеток. Эти вспомогательные вещества (ингредиенты) могут, например, представлять собой: инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат натрия, лактоза, фосфат кальция или фосфат натрия; гранулирующие и дезинтегрирующие агенты, например, кукурузный крахмал, мальтодекстрин, или альгиновая кислота; связывающие агенты, например, крахмал, желатин или аравийская камедь; и смазывающие агенты, например, стеарат магния, стеариновая кислота или тальк. Таблетки могут быть непокрытыми или они могут быть покрыты известными способами для задержки распада и абсорбции в желудочно-кишечном тракте и, таким образом, обеспечивают отложенное действие в течение более длительного периода. Например, может быть использован материал с временной задержкой, такой как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат.

Подходящие фармацевтические носители включают инертные твердые разбавители или наполнители, стерильные водные растворы и различные органические растворители. Примерами твердых носителей являются лактоза, сульфат кальция, сахароза, циклодекстрин, мальтодекстрин, тальк, желатин, агар, пектин, акация, стеарат магния, стеариновая кислота, аравийская камедь, модифицированный крахмал и низшие алкильные эфиры целлюлозы. Примерами жидких носителей являются сироп, арахисовое масло, оливковое масло, фосфолипиды, жирные кислоты, амины жирных кислот, полиоксиэтилен и вода. Кроме того, носитель или разбавитель может включать любой материал с замедленным высвобождением, известный в данной области техники, такой как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат, один или в смеси с воском.

В зависимости от расстройства и пациента, подлежащего лечению, а также от пути введения, экстракты согласно изобретению могут вводиться в различных дозах (т.е. терапевтически эффективных дозах, которые вводят пациенту, нуждающемуся в этом). В этом отношении специалисту будет понятно, что доза, вводимая млекопитающему, в частности человеку, в контексте данного изобретения, должна быть достаточной чтобы вызвать терапевтический ответ у млекопитающего в течение приемлемого периода времени. Специалисту в данной области будет понятно, что на выбор точной дозы и композиции и наиболее подходящего режима доставки также будут влиять, среди прочего, фармакологические свойства композиции, природа и тяжесть патологического состояния, которое лечат, и физическое состояние и ясность ума пациента, а также активность конкретного соединения, возраст, состояние, масса тела, пол и реакция пациента, которого нужно лечить, а также стадия/тяжесть заболевания.

Как правило, в применении или в способе согласно изобретению, описанном в данном документе, экстракт или композицию, содержащую экстракт, вводят в количестве от около 100 мг/сут до около 2000 мг/сут или от около 500 мг/сут до около 1500 мг/сут, или около 1000 мг/сут.

В любом случае, врач или другой квалифицированный специалист сможет регулярно определять фактическую дозу, которая будет наиболее подходящей для отдельного пациента. Вышеуказанные дозы являются типовыми для среднего случая; конечно, могут быть отдельные случаи, когда возможно применение больших или меньших диапазонов доз, при этом такие диапазоны включены в объем данного изобретения.

При включении в композицию (например, фармацевтическую композицию), как описано в данном документе, экстракт обычно присутствует в количестве от около 1 мас. % до около 100 мас. %, например, от около 10 мас. % до около 90 мас. %, или от около 20 мас. % до около 80 мас. %, или от около 30 мас. % до около 70 мас. %, или от около 40 мас. % до около 60 мас. %.

Способы получения экстрактов

Экстракт согласно изобретению может быть выделен из семян иди крылаток FA (в частности, из крылаток FA) с использованием способов разделения, которые выбирают для требуемого экстракта, который может определить специалист в данной области техники.

Как правило, экстракт согласно изобретению может быть получен с помощью способов экстракции и выделения, как схематично описано в данном документе ниже, или их стандартных модификаций.

Например, способы экстракции и выделения экстрактов согласно изобретению могут включать (или состоять по существу/состоять из) следующие этапы:

(i) экстракцию из крылаток FA (которые могут быть измельчены) при помощи подходящего растворителя;

(ii) упаривание растворителя; и, при необходимости,

(iii) очистку экстракта (например, с помощью хроматографии).

Как правило, крылатки FA измельчают в гранулы с размером частиц в диапазоне от около 0,1 мм до около 30 мм для увеличения площади поверхности для контакта с растворителем и повышения эффективности экстракции.

Конкретные растворители, которые могут быть использованы в процессе экстракции, включают спирты, такие как метанол), и смеси спирт/вода (такие как смеси метанола и воды). Например, растворители для экстракции могут представлять собой воду, водно-спиртовую смесь (от около 1% до около 99% спирта в воде). Например, от около 30% до около 75% спирта в воде или от около 30% до около 50% спирта в воде, например, от около 35% или от около 40% спирта в воде), или спирт. Конкретные спирты, которые могут быть приведены, включают этанол (EtOH) и метанол (МеОН).

В конкретных вариантах осуществления растворитель для экстракции может представлять собой смесь этанол-вода, например, от около 30% до около 75% этанола в воде или от около 30% до около 50% этанола в воде. Например, от около 35% или от около 40% этанола в воде.

В одном варианте осуществления температура экстракции находится в диапазоне от около 20°С до около 100°С. В конкретном варианте осуществления температура для экстракции находится в диапазоне от около 50°С до около 70°С.

Как правило, соотношение растительного материала к смеси растворителей, используемой в процессе экстракции, варьируется от около 1:1 до около 1:10 на грамм/миллилитр, например, от около 1:3 до около 1:8.

Инкубационный период (т.е. период, в течение которого растительный материал находится в контакте с растворителем) обычно составляет от около 2 часов до около 24 часов.

После инкубации растительных материалов и растворителя, растворитель отделяют от остаточного растительного материала и экстрагирующую композицию концентрируют (т.е. удаляют растворитель) до тех пор, пока экстракционная композиция не будет иметь твердый компонент. Как правило, твердый компонент может содержать (или состоять по существу/состоять из) от около 1% до около 35% секоиридоидов FA. Другие компоненты включают фенольные соединения, салидрозид, кумарины и флавоноиды.

После завершения процесса экстракции при необходимости секоиридоид(ы) может быть самостоятельно выделен из экстракта FA (т.е. очищен) с использованием хроматографического процесса.

Как правило, экстракт согласно изобретению может быть получен с использованием следующего процесса:

- порошок FA для экстракции (т.е. полученный путем измельчения крылатки) растворяют в спирте, и секоиридоид(ы) экстрагируют спиртом из порошка. Затем спирт упаривают и оставшийся остаток, содержащий секоиридоид(ы), загружают в хроматографическую колонку, заполненную обратнофазной смолой С-18;

- несколько фракций, содержащих различные соединения, элюируют серией воды и 10% МеОН/90% воды и системой МеОН. Фракции сравнивают с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и объединяют те элюаты, которые имеют сходные профили ВЭЖХ;

- объединенные фракции разделяют с помощью колоночной хроматографии на силикагеле с нормальной фазой и элюируют хлороформом (CHCl₃), смесью CHCl₃ - метанол, начиная с 90%, 80% CHCl₃ до 100% МеОН, с получением нескольких субфракций. Субфракции сравнивают с помощью ВЭЖХ и фракции, которые содержат эксельсид А и эксельсид В, объединяют, соответственно. Объединенные фракции дополнительно очищают комбинацией колоночной хроматографии на смолах С-18, MCI GEL СНР-20Р и/или Sephadex LH-20 с получением чистого эксельсида А и эксельсида В.

Термины «выделенный» и «очищенный», используемые в данном документе, относятся к экстракту или секоиридоиду(ам), отделенному по меньшей мере от одного другого компонента (например, полипептида или производного целлюлозы), присутствующего с экстрактом или секоиридоидом(ами) в его природном источнике. В одном варианте осуществления экстракт или секоиридоид(ы) обеспечивают в чистом виде или в присутствии растворителя, буфера, иона или другого компонента, обычно присутствующего в его растворе.

Таким образом, термины «выделенный» и «очищенный» не относятся к экстракту или секоиридоиду(ам), присутствующему в их природном источнике. Аналогично, термин «экстракт» относится к компонентам природного материала, полученным в процессе экстракции, а не к тем компонентам, которые присутствуют в их природном источнике (например, в виде семян FA).

В конкретных вариантах осуществления экстракт согласно изобретению, полученный такими способами, может быть:

- по существу свободным от других растительных материалов (например, не содержать растительной целлюлозы);

- по существу свободным от растительных клеток; и/или

- по существу свободным от веществ клеток растений.

Используемые в данном документе ссылки на материал, который «по существу свободен от» другого материала, могут относиться к материалу, состоящему из менее чем 1 мас. % (например, менее чем 0,1 мас. %, например, менее чем 0,01 мас. % или менее чем 0,001 мас. %) данного другого материала.

В альтернативных вариантах осуществления способ извлечения и выделения экстракта FA из семян FA может быть описан как включающий (или состоящий по существу/состоящий из) этапы:

(a) измельчения семян FA на частицы;

(b) приведения в контакт частиц со смесью растворителей;

(c) отделения измельченных частиц от смеси растворителей; и

(d) упаривания смеси растворителей.

В других таких вариантах осуществления способ также может включать (или состоять по существу/состоять из) этапы:

(e) растворения продукта (d) в спирте; и

(f) упаривания спирта.

Как правило, при экстракции экстракта FA из семян FA (т.е. этапы (а) - (d), как описано в данном документе выше): измельченные частицы имеют диаметр от около 0,1 мм до 30 мм; и/или температура составляет от около 20°С до около 100°С; и/или отношение измельченных частиц к смеси растворителей составляет от около 1 г к 1 мл до около 1 г к 8 мл; и/или измельченные частицы приводят в контакт со смесью растворителей от около 2 часов до около 24 часов; и/или смесь растворителей представляет собой воду, водно-спиртовую смесь или спирт.

В конкретных вариантах осуществления экстракт согласно изобретению, как описано в данном документе, может представлять собой экстракт, полученный (или получаемый) способом, как описано в данном документе.

Терапевтические и нетерапевтические применения

Как описано в данном документе, экстракт согласно изобретению может иметь определенные биологические эффекты, которые могут быть полезны при лечении заболеваний. Таким образом, согласно данному изобретению предусмотрено применение экстракта согласно изобретению в медицине (или в качестве фармацевтического препарата).

Кроме того, как описано в данном документе, экстракт согласно изобретению может быть особенно полезен при лечении заболеваний, таких как описанные в данном документе, таких как стеатоз печени (стеатоз в печени).

Экстракт согласно изобретению также может помочь пациентам в снижении или ограничении набора веса. Например, экстракт согласно изобретению может уменьшать набор веса у субъекта, соблюдающего рацион с высоким содержанием жира (как изображено на Фиг. 1).

Экстракт согласно изобретению также может уменьшать непереносимость глюкозы. Как правило, экстракт согласно изобретению может уменьшать непереносимость глюкозы у субъекта, соблюдающего рацион с высоким содержанием жира (как изображено на Фиг. 2).

Экстракт согласно изобретению может также снизить уровень жира, отложившегося в печени (стеатоз печени). Как правило, экстракт согласно изобретению может снижать уровень жира, отложившегося в печени у субъекта, имеющего рацион с высоким содержанием жира (как изображено на Фиг. 3).

Таким образом, в аспекте изобретения предложен экстракт Fraxinus angustifolia (т.е. экстракт согласно изобретению) для применения в:

(a) обращении дисбиоза кишечной микробиоты, связанного с ожирением и/или метаболическим синдромом;

(b) лечении или предотвращении стеатоза печени, неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП) и/или неалкогольного стеатогепатита (НАСГ);

(c) лечении или предотвращении повышенной кишечной проницаемости и/или гиперпроницаемости кишечника;

(d) лечении или предотвращении вызванных дисбиозом кишечника сердечнососудистых заболеваний и/или кардиометаболических заболеваний;

(e) лечении или предотвращении слабого воспаления;

(f) лечении или предотвращении атеросклероза;

(g) лечении или предотвращении ожирения; и/или

(h) лечении или предотвращении инсулинорезистентности, непереносимости глюкозы, предиабета и/или диабета (такого как диабет 2 типа).

В альтернативном аспекте изобретения предлагается применение экстракта Fraxinus angustifolia при изготовлении лекарственного средства для:

(a) обращения дисбиоза кишечной микробиоты, связанного с ожирением и/или метаболическим синдромом;

(b) лечения или предотвращения стеатоза печени, неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП) и/или неалкогольного стеатогепатита (НАСГ);

(c) лечения или предотвращения повышенной кишечной проницаемости и/или гиперпроницаемости кишечника;

(d) лечения или предотвращения вызванных дисбиозом кишечника сердечнососудистых заболеваний и/или кардиометаболических заболеваний;

(е) лечения или предотвращения слабого воспаления;

(f) лечения или предотвращения атеросклероза;

(g) лечения или предотвращения ожирения; и/или

(h) лечения или предотвращения инсулинорезистентности, непереносимости глюкозы, предиабета и/или диабета (такого как диабет 2 типа).

В дополнительном альтернативном аспекте изобретения предложен способ для:

(a) обращения дисбиоза кишечной микробиоты, связанного с ожирением и/или метаболическим синдромом;

(b) лечения или предотвращения стеатоза печени, неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП) и/или неалкогольного стеатогепатита (НАСГ);

(c) лечения или предотвращения повышенной кишечной проницаемости и/или гиперпроницаемости кишечника;

(d) лечения или предотвращения вызванных дисбиозом кишечника сердечнососудистых заболеваний и/или кардиометаболических заболеваний;

(e) лечения или предотвращения слабого воспаления;

(f) лечения или предотвращения атеросклероза;

(g) лечения или предотвращения ожирения; и/или

(h) лечения или предотвращения инсулинорезистентности, непереносимости глюкозы, предиабета и/или диабета (такого как диабет 2 типа),

включающий введение терапевтически эффективного количества экстракта Fraxinus angustifolia нуждающемуся в этом субъекту.

В конкретных вариантах осуществления заболевание или расстройство, которое следует обратить, вылечить или предотвратить, выбирают из группы (групп), состоящей из:

- дисбиоза кишечника, связанного с микробиотой кишечника, дисбиоза кишечника, связанного с метаболическим синдромом; и/или

- стеатоза печени, неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП) и неалкогольного стеатогепатита (НАСГ).

Используемый в данном документе термин «лечение» (и, аналогично, «процесс лечения») имеет свое обычное значение в области медицины. В частности, термин может относиться к достижению снижения тяжести одного или более клинических симптомов, связанных с заболеванием или расстройством (например, микозом), что может быть определено с использованием методик, известных специалистам в данной области техники (например, врачом) и/или для замедления прогрессирования заболевания или расстройства (т.е. увеличения количества времени, необходимого для того, чтобы заболевание или расстройство перешло в более тяжелое состояние, например, по сравнению с ожидаемым временем, необходимым для пациента, который не подвергался такому лечению).

Используемый в данном документе термин «предотвращение» (и, аналогично, «предупреждение») включает ссылки на профилактику заболевания или расстройства (и наоборот). В частности, этот термин может относиться к достижению снижения вероятности развития у пациента (или здорового пациента) патологического состояния (например, по меньшей мере 10% уменьшение, такое как по меньшей мере 20%, 30% или 40% уменьшение, например, по меньшей мере 50% уменьшение).

Во избежание неоднозначности, в контексте данного изобретения термины «лечение» и «предотвращение» включают терапевтическое или паллиативное лечение нуждающихся в этом субъектов/пациентов, а также профилактическое лечение и/или диагностику пациентов, которые подвержены соответствующим заболеваниям.

Используемый в данном документе в отношении патологических состояний термин «уменьшение» может относиться к уменьшению наблюдаемого количества или уменьшению в размере.

Используемый в данном документе в отношении к патологическим состояниям термин «обращение» может относиться к возврату соответствующего признака в нормальное состояние, как известно специалистам в данной области техники. Например, обращение различных типов дисбиоза микробиоты кишечника может относиться к изменению уровней и/или природы микробиоты кишечника к уровням и/или природе, которая является такой же или более похожей на ту, которую специалист ожидает обнаружить в здоровом субъекте.

Во избежание неоднозначности в конкретных вариантах осуществления экстракт Fraxinus angustifolia содержит (или состоит по существу/состоит из):

(i) от около 1 мас. % до около 15 мас. % нуженида;

(ii) от около 1 мас. % до около 17 мас. % GL3;

(iii) от около 0,5 мас. % до около 1 мас. % сложного метилового эфира олеозида;

(iv) от около 0,03 мас. % до около 0,12 мас. % эксельсида В;

(v) от около 0,1 мас. % до около 1,7 мас. % GL5; и

(vi) от около 0,08 мас. % до около 0,7 мас. % салидрозида.

В частности, экстракт FA может содержать (или состоять по существу/состоять из) около 10 мас. % нуженида и около 10 мас. % Gl3.

Кроме того, во избежание неоднозначности экстракт Fraxinus angustifolia может быть в форме композиции (например, фармацевтической композиции или пищевой композиции), как описано в данном документе.

Используемые в данном документе термины «субъект» и «пациент» могут использоваться взаимозаменяемо и включают виды млекопитающих (в частности, людей).

Используемый в данном документе термин «терапевтически эффективное количество» может относиться к количеству экстракта согласно изобретению или композиции, содержащей экстракт LA согласно изобретению, которая оказывает терапевтическое воздействие на получающего лечение пациента (например, количество, достаточное для лечения или предотвращения заболевания). Эффект может быть объективным (т.е. измеряемым каким-либо анализом или маркером) или субъективным (т.е. оцениваемым по результатам опроса жалоб или ощущений субъекта относительно эффекта).

Как описано в данном документе, изменения в составе кишечной микробиоты, такие как изменение типичной экологической организации кишечной микробиоты (дисбиоз), связаны с такими патологическими состояниями, как ожирение, резистентность к инсулину, непереносимость глюкозы, преддиабет, диабет, стеатоз печени, неалкогольная жировая болезнь печени, неспецифическое воспаление, мальабсорбционный синдром и/или синдром повышенной кишечной проницаемости, сердечно-сосудистые заболевания, вызванные дисбиозом микробиоты кишечника, кардиометаболические заболевания и атеросклероз. Таким образом, потенциал для восстановления оптимальной кишечной системы микроорганизмов обеспечивает стратегию предотвращения прогрессирования стеатоза и прогрессирования НАЖБП в НАСГ. Кроме того, этот эффект также может быть полезен для улучшения общего состояния здоровья пациентов, которые не страдают от определенного патологического состояния или расстройства.

Таким образом, в конкретных вариантах осуществления применение (включая экстракт для применения) или способ, как описано в данном документе, может включать (или состоять из) задержку или остановку (последний термин может упоминаться как остановка или предотвращение) прогрессирования стеатоза; особенно задержку или остановку (например, задержку) прогрессирования НАЖБП в НАСГ.

Используемые в данном документе ссылки на остановку прогрессирования патологического состояния будут относиться к лечению данного заболевания таким образом, что специалист в данной области не сможет наблюдать какого-либо значительного ухудшения данного заболевания в течение периода времени после начала такого лечения и/или в течение которого такое лечение обеспечивается. Аналогично, ссылки на остановку прогрессирования одного (первого) патологического состояния в другое (второе) патологическое состояние будут относиться к лечению этого первого заболевания таким образом, что специалист в данной области техники не сможет наблюдать начало второго патологического состояния в течение периода времени после начала такого лечения и/или в течение которого такое лечение обеспечивается.

Используемые в данном документе ссылки на задержку прогрессирования болезненного состояния будут относиться к лечению этого заболевания таким образом, чтобы квалифицированный специалист мог наблюдать, что после начала такого лечения и/или в течение которого такое лечение обеспечивается, время, необходимое для ухудшения болезненного состояния дольше (т.е. значимы с медицинской точки зрения период времени, например, по меньшей мере на одна неделю или, в частности, по меньшей мере на четыре или восемь недель), чем это ожидалось бы, если бы такое лечение не проводилось. Аналогично, ссылки на задержку прогрессирования одного (первого) патологического состояния в другое (второе) патологическое состояние будут относиться к лечению этого первого заболевания таким образом, чтобы специалист мог наблюдать, что после начала такого лечения и/или во время которого такое лечение обеспечивается, время, необходимое для перехода первого течения патологического состояния во второе патологическое состояние, больше, чем ожидалось бы, если бы такое лечение не проводилось.

Кроме того, в другом аспекте изобретения предложено применение (например, нетерапевтическое применение) экстракта Fraxinus angustifolia (т.е. экстракта согласно изобретению) в:

(i) модуляции или коррекции кишечной микробиоты;

(ii) уменьшении содержания жира в организме; и/или

(iii) снижении концентрации глюкозы в крови.

В альтернативном аспекте изобретения предложен способ (например, нетерапевтический способ):

(i) модуляции или коррекции кишечной микробиоты;

(ii) уменьшении содержания жира в организме; и/или

(iii) снижении концентрации глюкозы в крови,

включающий введение эффективного количества экстракта Fraxinus angustifolia субъекту, нуждающемуся в этом.

Используемые в данном документе термины «модулировать» (или «модуляция») или «корректировать» (или «коррекция») могут относиться к увеличению (обогащению) и/или уменьшению определенных таксономических групп (тип, класс, порядок, семейство и род), присутствующих в кишечнике. Например, ссылка на модуляцию или коррекцию может относиться к эффекту, который увеличивает и/или уменьшает определенные операционные таксономические единицы (ОТЕ), присутствующие в кишечнике.

Термин «эффективное количество» относится к количеству экстракта согласно изобретению или композиции, содержащей экстракт согласно изобретению, которое оказывает воздействие на субъекта, которому вводили экстракт или композицию (например, количество, достаточное для того, чтобы вызвать желаемый эффект, такой как увеличение и/или уменьшение определенных таксономических групп (типа, класса, порядка, семейства и рода), присутствующих в кишечнике). Эффект может быть объективным (т.е. измеряемым каким-либо анализом или маркером) или субъективным (т.е. оцениваемым по результатам опроса жалоб или ощущений субъекта относительно эффекта).

Как описано в данном документе, применение или способ могут привести к увеличению и/или уменьшению определенных таксономических групп (типа, класса, порядка, семейства и рода), присутствующих в кишечнике, например, увеличение (обогащение) и/или уменьшение некоторых операционных таксономических единиц (ОТЕ), присутствующих в кишечнике.

В конкретных вариантах осуществления модуляция или коррекция относится к:

- повышению уровней бактериальных групп, выбранных из родов Burkholderiales, Sutterellacae, Parasutterella, Betaproteobacteria и Enterorhabdus; и/или

- снижению уровней бактериальных групп, выбранных из родов Prevotellaceae, Flavonifractor, Clostridium IV и Butyricicoccus.

В более конкретных вариантах осуществления модуляция или коррекция относится к повышению уровня бактериальных групп, выбранных из семейств, состоящих из Coriobacteriaceae, Lactobacillaceae и Rikenellaceae.

В еще более конкретных вариантах осуществления модуляция или коррекция относится к:

- повышению уровней бактериальных групп, выбранных из родов Coriobacteriaceae Olsenella, Lactobacillaceae Lactobacillus и Rikenellaceae Alistipes; и/или

- снижению уровней Ruminococcaceae Butyricicoccus.

Поскольку наличие определенных бактериальных таксономических групп связано с высокими уровнями стеатоза в печени, обогащение определенных бактериальных таксономических групп, возникающих в результате модуляции или коррекции при помощи экстракта согласно изобретению, или композиции, содержащей экстракт согласно изобретению, может уменьшать или предотвращать развитие или прогрессирование стеатоза в печени и/или прогрессирование НАЖБП в НАСГ.

- Таким образом, в конкретных вариантах осуществления модулирующая или корректирующая микробиота кишечника предназначена для (то есть приводит или оказывает эффект) профилактики или лечения неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП) и/или замедления (или остановки) прогрессирования НАЖБП в неалкогольный стеатогепатит (НАСГ).

В дополнительном аспекте изобретения предложен способ модуляции или коррекции микробиоты кишечника для предотвращения или лечения НАЖБП и/или задержки (или остановки) прогрессирования НАЖБП в НАСГ, включающий введение эффективного количества экстракта Fraxinus angustifolia субъекту, нуждающемуся в этом.

Предотвращение или лечение неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП) и/или задержка (или остановка) прогрессирования НАЖБП в неалкогольный стеатогепатит (НАСГ) может быть достигнута путем:

- повышения уровней бактериальных групп, выбранных из родов Burkholderiales, Sutterellacae, Parasutterella, Betaproteobacteria и Enterorhabdus; и/или

- снижения уровней бактериальных групп, выбранных из рода, состоящих из Prevotellaceae, Flavonifractor, Clostridium IV и Butyricicoccus; и/или

- повышения уровня бактериальных групп, выбранных из семейств, состоящих из Coriobacteriaceae, Lactobacillaceae и Rikenellaceae; и/или

- повышения уровней бактериальных групп, выбранных из родов Coriobacteriaceae Olsenella, Lactobacillaceae Lactobacillus и Rikenellaceae Alistipes; и/или

снижения уровней Ruminococcaceae Butyricicoccus.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1 изображено: (А) масса тела, (В) увеличение массы тела мышей в течение 12 недель потребления рациона с высоким содержанием жира (60%) с или без экстракта Fraxinus angustifolia в концентрации 200 мг/кг массы тела, и (С) состав тела мышей после 12-недельного лечения.

* указывает на то, что результат статистически значимо отличается от контроля, р<0,05.

На Фиг. 2 изображено: (А) уровень глюкозы в крови до и после 15, 30, 60, 90 и 120 минут после перорального введения глюкозы через желудочный зонд и (В) соответствующие значения площади под фармакокинетической кривой (AUC) у мышей в конце 12-недельного потребления рациона с высоким содержанием жиров (60%) с или без экстракта Fraxinus angustifolia в концентрации 200 мг/кг массы тела.

* указывает на то, что результат статистически значимо отличается от контроля, р<0,05.

На Фиг. 3 изображено: (А) срез печени, полученный из замороженной печени и окрашенный масляным красным О, контрольных и получавших лечение Fraxinus angustifolia мышей (увеличение ×20); и (В) процентное содержание жира по площади; срезы, окрашенные масляным красным О, анализировали с помощью программного обеспечения для анализа ImageJ для получения количественного гистологического измерения стеатоза; гистограмма интенсивности пикселей была получена из изображения, площадь была измерена, и результаты были выражены в виде процентного содержания жира по площади. Данные представлены при помощи диаграммы размаха, демонстрирующей медиану, первый квартиль, третий квартиль, минимум и максимум.

** указывает на то, что результат статистически значимо отличается от контроля, р=0,004 (критерий Манна-Уитни)

На Фиг. 4 изображена относительная доля таксономических групп на уровне класса, демонстрирующая отдельные исследуемые образцы для каждого типа образца на группу: мышей, получавших рацион с высоким содержанием жира (HFD60), через 1 месяц (_Т1) или 3 месяца (_Т3), или мышей, получавших рацион с высоким содержанием жира и экстракт Fraxinus angustifolia (HFD60 + F. angust) через 1 месяц (_Т1) или через 3 месяца (_Т3).

На Фиг. 5 изображена относительная доля таксономических групп на уровне класса, демонстрирующая среднее для каждого типа образца на группу: мышей, получавших рацион с высоким содержанием жира (HFD60), через 1 месяц (_Т1) или 3 месяца (_Т3), или мышей, получавших рацион с высоким содержанием жира и экстракт Fraxinus angustifolia (HFD60 + F. angust) через 1 месяц (_Т1) или через 3 месяца (_Т3).

На Фиг. 6 изображена относительная доля таксономических групп на уровне семейства, демонстрирующая отдельные исследуемые образцы для каждого типа образца на группу: мышей, получавших рацион с высоким содержанием жира (HFD60), через 1 месяц (_Т1) или 3 месяца (_Т3), или мышей, получавших рацион с высоким содержанием жира и экстракт Fraxinus angustifolia (HFD60 + F. angust) через 1 месяц (_T1) или через 3 месяца (_T3).

На Фиг. 7 изображена относительная доля таксономических групп на уровне семейства, демонстрирующая среднее для каждого типа образца на группу: мышей, получавших рацион с высоким содержанием жира (HFD60), через 1 месяц (_Т1) или 3 месяца (_Т3), или мышей, получавших рацион с высоким содержанием жира и экстракт Fraxinus angustifolia (HFD60 + F. angust) через 1 месяц (_Т1) или через 3 месяца (_Т3).

На Фиг. 8 и 9 изображен анализ главных координат (РСоА) для сравнения образцов из разных групп мышей (мышей, получавших рацион с высоким содержанием жиров (HFD60) через 1 месяц (_Т1) или 3 месяца (_Т3) или мышей, получавших рацион с высоким содержанием жира и экстракт Fraxinus angustifolia (HFD60 + F. angust) через 1 месяц (_Т1) или 3 месяца (_Т3)) на основе обобщенных метрик для подсчета расстояния UniFrac. Изображены оба графика РСоА со значениями альфа 0 и 1.

На Фиг. 10 изображено сравнение через 3 месяца между мышами, получавшими рацион с высоким содержанием жира без добавок, и мышами, получавшими рацион с высоким содержанием жира с добавлением экстракта Fraxinus angustifolia. Величину эффекта линейного дискриминантного анализа определяли с использованием значений по умолчанию (альфа-значение 0,5 для факторного критерия Краскела-Уоллиса среди классов и парного критерия Уилкоксона между подклассами, пороговое значение 2,0 для логарифмического показателя ЛДА (линейный дискриминантный анализ) для дискриминационных признаков) и алгоритм для мультиклассового анализа устанавливали на «все против всех». (В) Кладограмма LEfSe (величина эффекта линейного дискриминантного анализа) из данных о величине эффекта ЛДА была получена с помощью Bacteria в качестве корня дерева с максимальным таксономическим уровнем шесть родов. Выделенные области (зеленый или красный) представляют собой обогащение указанных таксономических групп в соответствующей группе.

На Фиг. 11 изображено сравнение между мышами, получавшими рацион с высоким содержанием жира без добавок, и мышами, получавшими рацион с высоким содержанием жира с добавлением экстракта Fraxinus angustifolia, через 3 месяца. Кладограмма LEfSe из данных о величине эффекта ЛДА была получена с помощью Bacteria в качестве корня дерева с максимальным таксономическим уровнем шесть родов. Выделенные области (зеленый или красный) представляют собой обогащение указанных таксономических групп в соответствующей группе.

На Фиг. 12, 13 и 14 представлен регрессионный анализ таксономических групп семейства «Случайный лес» и процент окрашивания печени красителем масляным красным О в зависимости от степени тяжести стеатоза.

Данное изобретение будет дополнительно описано со ссылкой на следующие неограничивающие примеры.

Примеры

Пример 1 - Экстракция Fraxinus angustifolia с использованием воды

В общей сложности 2,5 кг крылаток F. angustifolia сушили на воздухе и затем измельчали в грубый порошок с размером частиц приблизительно 1-2 мм. Грубый порошок замачивали в воде в перколяторе при 80-90°С в течение 5 часов и водный экстракт сливали из перколятора. Процесс экстракции повторяли три раза. Все водные экстракты объединяли и концентрировали в ротационном вакуумном испарителе. После упаривания воды было получено в общей сложности 550 граммов высушенного порошкообразного экстракта. Анализ ВЭЖХ демонстрирует, что этот порошкообразный экстракт содержал два основных секоиридоида, 11,4% (мас./мас.) нуженида и 6,2% GB. Композиция также содержала 0,19% сложного олеозид-1-1-метилового эфира, 0,41% эксельсида В, 0,63% GI5, 0,2% салидрозида, вместе с некоторыми второстепенными секоиридоидами, включая лигстрозид, сложный диметиловый эфир олеозида и эксельсид А.

Пример 2 - Экстракция Fraxinus angustifolia с использованием воды, воды-EtOH и EtOH.

Было приготовлено 5 образцов, и каждый образец содержал 5 г крылаток F. angustifolia. Каждый образец измельчали в порошок и подвергали экстракции растворителем с помощью 200 мл воды, 25% EtOH/75% воды, 50% EtOH/50% воды, 75% EtOH/25% воды и EtOH, соответственно. После экстракции в течение 24 часов при комнатной температуре (22-24°С) растворители упаривали и остаточные твердые вещества анализировали с помощью ВЭЖХ. Содержание секоиридоидов и салидрозида приведено в таблице 1.

Пример 3 - Выделение секоиридоидов из Fraxinus angustifolia

Добавляли 3,5 л метанола и смешивали с 500 г порошкообразного экстракта, полученного по методике, изображенной в примере 1, в течение 3 часов при комнатной температуре. Раствор метанола отделяли от порошка с помощью процесса фильтрации. Один и тот же процесс повторяли один раз, и два метанольных экстракта объединяли и концентрировали при пониженном давлении с получением в общей сложности 54 граммов высушенного метанольного экстракта. Метанольный экстракт повторно растворяли в воде и фильтровали для удаления нерастворимых в воде веществ. Фильтрат далее подвергали разделению обращеннофазной колоночной хроматографией на смоле С-18, промытой водой и градиентной системой растворителей МеОН-вода, от 10% МеОН в воде до 100% МеОН. Всего было собрано 7 фракций. Каждую фракцию, элюированную из колонки, упаривали в вакууме и объединяли при помощи анализа методом ВЭЖХ. Фракции 2, 3 и 7 загружали в хроматографическую колонку, заполненную смолой из силикагеля, и элюировали системой хлороформ-метанол, начиная с CHCl₃, 10% МеОН/CHCl₃, 20% МеОН/CHCl₃ до 100% МеОН. Фракции, собранные на колонке с силикагелем, сравнивали с помощью анализа методом ВЭЖХ, и каждый отделенный элюат многократно подвергали колоночной хроматографии на смолах MCI GEL СНР-20Р и/или Sephadex LH-20 и элюировали системой вода-метанол до получения единственного чистого соединения. Были идентифицированы соединения: эксельсид А, эксельсид В, нуженид, Gl3, Gl5, лигстрозид, сложный диметиловый эфир олеозида, сложный олеозид-1,1-метиловый эфир и салидрозид. Все химические структуры были установлены спектроскопическими способами.

Пример 4. Тестирование влияния экстракта Fraxinus angustifolia на стеатоз печени у мышей.

9-недельные взрослые самцы мышей C57BL/6 приобретали у Charles River (Charles River Laboratories, Л'Арбрель, Рона, Франция) и размещали при постоянной комнатной температуре и влажности, и поддерживали в цикле свет : темнота 12:12 ч в СПФ (свободных от патогенной микрофлоры) условиях. Их кормили рационом с высоким содержанием жиров (HFD) с 60% энергии из жира, полученного SAFE (Scientific Animal Food & Engineering, Ожи, Франция), в течение 12 недель, и воду давали ad libitum. В таблицах 2 и 3 приведен состав и питательная ценность HFD, соответственно.

В группе лечения экстракт Fraxinus angustifolia (Vahl) непосредственно смешивали с рационом, таким образом, вводили перорально в дозе 200 мг/кг/сутки, что соответствует эквивалентной дозе для человека 1 г/сутки согласно формуле FDA (2005): эквивалентная доза HED для человека (мг/кг) = доза для животных в мг/кг × (масса животного в кг/массу человека в кг). Высушенный экстракт крылаток Fraxinus angustifolia был получен при помощи экстракции 30% (об./об.) этанолом в воде, как описано в данном документе. Экстракт может предпочтительно содержать приблизительно 10% (мас. %) нуженида и GL3 в пересчете на общую сухую массу растительного экстракта. Влияние употребления экстракта Fraxinus angustifolia (Vahl) анализировали путем сравнения различных параметров у крыс, употребляющих как HFD, так и экстракт (группа F. angustifolia), по сравнению с крысами, употребляющими только HFD (контрольная группа).

В течение 12 недель наблюдали массу тела и увеличение массы тела, и состав тела (процентная доля жировой массы, сухой массы и воды) оценивали с помощью ЯМР в конце лечения. Пероральный тест толерантности к глюкозе (OGTT) проводили после 12 недель лечения путем введения 2 г глюкозы на кг массы тела мышам натощак и после гликемии в течение 2 часов после введения глюкозы.

При умерщвлении печень тщательно отнимали, взвешивали и кондиционировали для обоих гистологических анализов. Для выявления отложения липидов в печени срезы печени готовили из замороженной печени и окрашивали масляным красным О, как сообщалось ранее (Fowler, S.D., Greenspan, Р., О.J. Histochem Cytochem, 33, 833-836 (1985)). Срезы, окрашенные масляным красным О, анализировали с помощью программного обеспечения для анализа ImageJ (Национальный институт психического здоровья, Бетесда, Мэриленд, США) для получения количественного гистологического измерения стеатоза. Чтобы обеспечить репрезентативную выборку для каждого образца было сделано пять случайных изображений при увеличении ×20 для каждой биопсии печени. Из изображения была получена гистограмма пиксельной интенсивности, была измерена площадь, а результаты были выражены в виде процентного содержания жира по площади.

Как изображено на Фиг. 1, 12-недельное употребление рациона с высоким содержанием жиров вызывало сильное увеличение массы тела, которому противодействовало одновременное употребление экстракта Fraxinus angustifolia. В частности, экстракт Fraxinus angustifolia способен уменьшать жировую массу у мышей, получавших HFD в течение 12 недель.

Как изображено на Фиг. 2, употребление экстракта Fraxinus angustifolia также способно значительно снизить непереносимость глюкозы у мышей, которых кормят HFD, как показано значительным снижением концентрации глюкозы в крови через 30 и 60 минут после гликемической нагрузки (р<0,05) и значительное уменьшение площади под фармакокинетической кривой (гликемия в зависимости от времени) (AUC) (р=0,07).

Как изображено на Фиг. 3, 12-недельное употребление рациона с высоким содержанием жиров вызвало высокий уровень жирового отложения в печени, то есть стеатоз в контрольной группе (35,2%), что является классическим для этого типа рациона в качестве модели вызванного рационом ожирения, диабета и стеатоза печени (см.: Takahashi Y, Soejima Y, Fukusato T, World J Gastroenterol, 18(19), 2300-2308 (2012); и Zhou, Y. and Xie, L., Am J Digest Dis, 2(1), 60-67 (2015)). 12-недельное лечение экстрактом Fraxinus angustifolia позволило значительно снизить тяжесть стеатоза (р=0,004), поскольку только 22,8% жира было обнаружено в печени мышей, получавших экстракт, что соответствует снижению стеатоза на 35%. Согласно системе гистологической оценке Всемирной гастроэнтерологической организации (2012) и классификации от Kleiner и Brunt (Kleiner, DE and Brunt, EM, Semin Liver Dis, 32, 3-13 (2012)), которые классифицируют степень тяжести стеатоза в соответствии с содержанием жира (степень 0: <5%, степень 1: 5-33%, степень 2: 34-66%, степень 3: >67%), лечение с использованием Fraxinus angustifolia гарантировало снижение степени тяжести стеатоза со 2 степени до 1 степени.

Пример 5. Тестирование влияния экстракта Fraxinus angustifolia на дисбоз кишечной микробиоты у мышей

Чтобы оценить модификацию кишечной микробиоты, вызванную потреблением экстракта Fraxinus angustifolia у мышей, получавших рацион с высоким содержанием жира, было проведено метагеномное исследование 16S рДНК на образцах фекалий мыши в начале (4 недели) и после 12 недель потребления HFD с или без экстракта Fraxinus angustifolia (10 мышей на группу, общее количество 40 мышей). Бактериальные популяции, содержащиеся в образцах, определяли с использованием высокопроизводительного сиквенирования следующего поколения вариабельных областей (V3-V4) бактериального гена 16S рДНК.

Метагеномная технология используется для классификации организмов из образца для метагеномного анализа путем амплификации определенных областей в гене 16S рибосомальной РНК. Данная метагеномная технология является исключительной для бактерий. Основным результатом является классификация ридов по нескольким таксономическим уровням: тип, класс, порядок, семейство и род. Популяция микроорганизмов, присутствующая в образцах, была определена с использованием высокопроизводительного сиквенирования следующего поколения вариабельных областей бактериального гена 16S рРНК. Технология включала следующие этапы:

(1) Конструирование библиотеки и сиквенирование

ПЦР-амплификацию проводили с использованием универсальных праймеров 16S, нацеленных на область V3-V4 гена бактериальной рибосомальной 16S. Длина соединенных пар была установлена таким образом, что бы охватывать ампликон из 476 пар оснований благодаря набору для сиквенирования спаренных концов MiSeq V3 2 x 300. Для каждого образца была создана библиотека сиквенирования путем добавления адаптеров сиквенирования. Детекцию фрагментов сиквенирования проводили с использованием технологии MiSeq Illumina®.

(2) Биоинформатическая обработка

Целевые метагеномные последовательности из микробиоты были проанализированы с использованием следующей биоинформатической обработки; вкратце, после демультиплексирования парных чтений Ilumina с уникальным кодом отдельные последовательности считывания были очищены и спарены для каждого образца независимо в более длинные фрагменты. После качественной фильтрации и выравнивания по эталонной базе данных 16S были выполнены кластеризация в операционные таксономические единицы (ОТЕ) с порогом идентификации 97% и таксономическое сопоставление для определения профилей сообщества.

На основании этих результатов были сделано графическое представление относительной доли таксономических групп (типа, класса, порядка, семейства и рода), присутствующих в 1) отдельных образцах исследования и 2) среднем для каждого типа/группы образцов.

Как изображено на Фиг. 4, 5, 6 и 7, профили кишечной микробиоты были сходными в начале потребления пищи с высоким содержанием жиров (Т1), хотя некоторые незначительные различия можно было наблюдать в классе и более интенсивно на уровне семейства у мышей, которые потребляли экстракт Fraxinus angustifolia, по сравнению с мышами, которые не потребляли экстракт одновременно с HFD.

Анализ главных координат (РСоА) был выполнен для сравнения выборок на основе обобщенных метрик для подсчета расстояния UniFrac (Lozupone С, Lladser ME, Knights D, Stombaugh J, Knight R (2011) UniFrac: an effective distance metric for microbial community comparison. ISME J. 5 (2): 169-172), чтобы проиллюстрировать различия в группах мышей.

Как изображено на Фиг. 8 и 9, несмотря на то, что состав кишечной микробиоты мышей был сходным в начале потребления пищи с высоким содержанием жиров (Т1), как показано при помощи составных профилей распределения у индивидуумов, можно отметить, что после 3 месяцев лечения экстрактом Fraxinus angustifolia, получавшие лечение индивидуумы могут быть дифференцированы от не получавших лечение индивидуумов по составу их кишечной микробиоты.

Величина эффекта линейного дискриминантного анализа (ЛДА) (LEfSe) (Segata, N. et al., Genome Biol, 12(6), R60 (2011)) была затем использована для анализа многомерных сравнений классов метагеномных данных. LefSe - алгоритм для обнаружения и объяснения многомерных биомаркеров, который может идентифицировать таксономические группы, характеризующие различия между двумя или более биологическими условиями. В нем подчеркивается как статистическая значимость, так и биологическая значимость, что позволяет исследователям выявлять дифференциально представленные признаки, которые также соответствуют биологически значимым категориям (подклассам). LEfSe сначала четко определяет признаки, которые статистически различаются среди биологических классов. Затем он выполняет дополнительные тесты для оценки соответствия этих различий в отношении ожидаемого биологического поведения. Величину эффекта линейного дискриминантного анализа определяли с использованием значений по умолчанию (альфа-значение 0,5 для факторного критерия Краскела-Уоллиса среди классов и парного критерия Уилкоксона между подклассами, пороговое значение 2,0 для логарифмического показателя ЛДА (линейный дискримантный анализ) для дискриминационных признаков) и алгоритм для мультиклассового анализа установлен на «все против всех».

Как изображено на Фиг. 10 и 11, анализ LefSe выявил, что на уровнях рода или ОТЕ происходило обогащение различных таксономических групп (Burkholderiales, Sutterellacae, Parasutterella, Betaproteobacteria, Enterorhabdus и других ОТЕ) у мышей, получавших экстракт Fraxinus angustifolia, в сравнении с нелечеными мышами, получавшими HFD. Напротив, Prevotellaceae, Flavonifractor, Clostridium_IV, Butyricicoccus и другие таксономические группы были менее представлены у мышей, получавших экстракт Fraxinus angustifolia, по сравнению с нелечеными мышами, получавшими HFD. Эти результаты подчеркивают изменение кишечной микробиоты, вызванное добавлением экстракта Fraxinus angustifolia.

Корреляция между анализом микробиома и тяжестью стеатоза была проанализирована с использованием анализа методом «Случайный лес» (Touw, W.G. et al., Brief Bioinform, 14(3), 315-26 (2013)). Как изображено на фиг. 12, 13 и 14, относительная численность нескольких таксономических групп на уровне семейства или рода, соответственно, соотносится с тяжестью стеатоза у мышей, получавших рацион с высоким содержанием жиров, ясно демонстрируя, что экстракт Fraxinus angustifolia способен модифицировать микробиоту кишечника и, в частности, относительную численность некоторых семейств или родов (Coriobacteriaceae, Lactobacillaceae, Rikenellaceae) и то, что эти модификации могут уменьшить развитие стеатоза. Результаты анализа корреляции между численностью таксономических групп (по семейству и роду) и степенью тяжести стеатоза изображены в таблицах 4 и 5 ниже.

Группа изобретений относится к области медицины и пищевой промышленности, а именно к экстракту Fraxinus angustifolia для применения в: (а) обращении дисбиоза кишечной микробиоты, связанного с ожирением и/или метаболическим синдромом; (b) лечении или предотвращении стеатоза печени, неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП) и/или неалкогольного стеатогепатита (НАСГ); (c) лечении или предотвращении повышенной кишечной проницаемости и/или гиперпроницаемости кишечника; (d) лечении или предотвращении вызванных дисбиозом кишечника сердечно-сосудистых заболеваний и/или кардиометаболических заболеваний; (e) лечении или предотвращении слабого воспаления; (f) лечении или предотвращении атеросклероза; (g) лечении или предотвращении ожирения; и/или (h) лечении или предотвращении инсулинорезистентности, непереносимости глюкозы, предиабета и/или диабета, отличающемуся тем, что экстракт получают из крылаток Fraxinus angustifolia и причем экстракт получают с использованием метанольного, этанольного, водно-метанольного или водно-этанольного растворителя для экстракции, а также относится к фармацевтической композиции, содержащей экстракт Fraxinus angustifolia и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, и относится к применению экстракта Fraxinus angustifolia и фармацевтической композиции в: (a) обращении дисбиоза кишечной микробиоты, связанного с ожирением и/или метаболическим синдромом; (b) лечении или предотвращении стеатоза печени, неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП) и/или неалкогольного стеатогепатита (НАСГ); (c) лечении или предотвращении повышенной кишечной проницаемости и/или гиперпроницаемости кишечника; (d) лечении или предотвращении вызванных дисбиозом кишечника сердечно-сосудистых заболеваний и/или кардиометаболических заболеваний; (e) лечении или предотвращении слабого воспаления; (f) лечении или предотвращении атеросклероза; (g) лечении или предотвращении ожирения; и/или лечении или предотвращении инсулинорезистентности, непереносимости глюкозы, предиабета и/или диабета, и также относится к пищевой композиции, содержащей экстракт крылаток Fraxinus angustifolia, и приемлемый для пищи ингредиент, причем экстракт получают с использованием метанольного, этанольного, водно-метанольного или водно-этанольного растворителя для экстракции, и также относится к нетерапевтическому применению экстракта крылаток Fraxinus angustifolia или пищевой композиции в: (i) модуляции или коррекции кишечной микробиоты; (ii) уменьшении содержания жира в организме; и/или (iii) снижении концентрации глюкозы в крови. Группа изобретений обеспечивает получение экстракта крылаток Fraxinus angustifolia, который обладает сильной активностью в обращении дисбиоза микробиоты кишечника путем модуляции или коррекции кишечной микробиоты, где данная активность может иметь многочисленные терапевтические и нетерапевтические (например, косметические) применения, и применения в профилактике заболеваний, например, использование экстракта крылаток Fraxinus angustifolia для лечения стеатоза печени, использование для лечения и предупреждения ожирения, инсулинорезистентности, непереносимости глюкозы, предиабета и/или диабета, атеросклероза. 5 н. и 14 з.п. ф-лы, 5 табл., 5 пр., 14 ил.

1. Экстракт Fraxinus angustifolia для применения в:

(a) обращении дисбиоза кишечной микробиоты, связанного с ожирением и/или метаболическим синдромом;

(b) лечении или предотвращении стеатоза печени, неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП) и/или неалкогольного стеатогепатита (НАСГ);

(c) лечении или предотвращении повышенной кишечной проницаемости и/или гиперпроницаемости кишечника;

(d) лечении или предотвращении вызванных дисбиозом кишечника сердечно-сосудистых заболеваний и/или кардиометаболических заболеваний;

(e) лечении или предотвращении слабого воспаления;

(f) лечении или предотвращении атеросклероза;

(g) лечении или предотвращении ожирения; и/или

(h) лечении или предотвращении инсулинорезистентности, непереносимости глюкозы, предиабета и/или диабета, отличающийся тем, что экстракт получают из крылаток Fraxinus angustifolia и причем экстракт получают с использованием метанольного, этанольного, водно-метанольного или водно-этанольного растворителя для экстракции.

2. Экстракт по п.1, отличающийся тем, что экстракт содержит:

(i) от 1 мас.% до 15 мас.% нуженида;

(ii) от 1 мас.% до 17 мас.% GL3;

(iii) от 0,5 мас.% до 1 мас.% сложного метилового эфира олеозида;

(iv) от 0,03 мас.% до 0,12 мас.% эксельсида В (excelside В);

(v) от 0,1 мас.% до 1,7 мас.% GL5; и

(vi) от 0,08 мас.% до 0,7 мас.% салидрозида.

3. Экстракт по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что экстракт содержит 10 мас.% нуженида и/или 10 мас.% GL3.

4. Экстракт по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что водно-этанольный экстракт получают с использованием растворителя, содержащего от 30% до 75% этанола.

5. Фармацевтическая композиция, содержащая экстракт Fraxinus angustifolia по любому из предшествующих пунктов и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

6. Фармацевтическая композиция по п.5, отличающаяся тем, что композиция предназначена для перорального введения.

7. Применение экстракта Fraxinus angustifolia по любому из пп.1-4 или фармацевтической композиции по любому из пп.5, 6 в:

(a) обращении дисбиоза кишечной микробиоты, связанного с ожирением и/или метаболическим синдромом;

(b) лечении или предотвращении стеатоза печени, неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП) и/или неалкогольного стеатогепатита (НАСГ);

(c) лечении или предотвращении повышенной кишечной проницаемости и/или гиперпроницаемости кишечника;

(d) лечении или предотвращении вызванных дисбиозом кишечника сердечно-сосудистых заболеваний и/или кардиометаболических заболеваний;

(e) лечении или предотвращении слабого воспаления;

(f) лечении или предотвращении атеросклероза;

(g) лечении или предотвращении ожирения; и/или

лечении или предотвращении инсулинорезистентности,

непереносимости глюкозы, предиабета и/или диабета.

8. Применение по п.7, отличающееся тем, что применение или способ осуществляют по отношению к субъекту-человеку.

9. Применение по любому из пп.7, 8, отличающееся тем, что заболевание или расстройство выбирают из группы, состоящей из: дисбиоза микробиоты кишечника, связанного с ожирением, и дисбиоза микробиоты кишечника, связанного с метаболическим синдромом; и/или стеатоза печени, неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП) и неалкогольного стеатогепатита (НАСГ).

10. Применение по любому из пп.7-9, отличающееся тем, что лечение или предотвращение увеличивает бактериальные группы, выбранные из родов Burkholderiales, Sutterellacae, Parasutterella, Betaproteobacteria и Enterorhabdus.

11. Применение по любому из пп.7-9, отличающееся тем, что лечение или предотвращение увеличивает бактериальные группы, выбранные из родов Prevotellaceae, Flavonifractor, Clostridium IV и Butyricicoccus.

12. Применение по любому из пп.7-9, отличающееся тем, что лечение или предотвращение увеличивает бактериальные группы, выбранные из семейств, включающих Coriobacteriaceae, Lactobacillaceae и Rikenellaceae.

13. Пищевая композиция, содержащая экстракт Fraxinus angustifolia и приемлемый для пищи ингредиент, причем экстракт получают из крылаток Fraxinus angustifolia и причем экстракт получают с использованием метанольного, этанольного, водно-метанольного или водно-этанольного растворителя для экстракции.

14. Пищевая композиция по п.13, отличающаяся тем, что композиция предназначена для перорального введения.

15. Нетерапевтическое применение экстракта крылаток Fraxinus angustifolia или пищевой композиции по любому из пп.13, 14 в:

(i) модуляции или коррекции кишечной микробиоты;

(ii) уменьшении содержания жира в организме; и/или

(iii) снижении концентрации глюкозы в крови;

причем экстракт получают из крылаток Fraxinus angustifolia и причем экстракт получают с использованием метанольного, этанольного, водно-метанольного или водно-этанольного растворителя для экстракции.

16. Применение по п.15, отличающееся тем, что применение осуществляют по отношению к субъекту-человеку.

17. Применение по п.15, отличающееся тем, что модуляция или коррекция увеличивает бактериальные группы, выбранные из родов Burkholderiales, Sutterellacae, Parasutterella, Betaproteobacteria и Enterorhabdus.

18. Применение no п.15, отличающееся тем, что модуляция или коррекция увеличивает бактериальные группы, выбранные из родов Prevotellaceae, Flavonifractor, Clostridium IV и Butyricicoccus.

19. Применение по п.15, отличающееся тем, что модуляция или коррекция увеличивает бактериальные группы, выбранные из семейств, включающих Coriobacteriaceae, Lactobacillaceae и Rikenellaceae.