Настоящее изобретение относится к белку растительного происхождения, обладающему противораковыми свойствами, который связывает гормон, высвобождающий гормон роста человека (GHRH или human Growth Hormone releasing hormone).
Гормон роста ("GH, ГР") является белком, состоящим из 191 аминокислот, который стимулирует продукцию различных факторов роста, таких как инсулиноподобный фактор роста I (IGF-1), и вызывает рост большого числа тканей (скелетные ткани, соединительные ткани, мышцы и внутренние органы). ГР также проявляет физиологическую активность, увеличивая синтез нуклеиновых кислот, белков, стимулируя липолиз и уменьшая выделения мочи (Frohman L.A. & Kineman, R.D., Handbook of Physiology, Hormonal Control of Growth, edite par Kostyo, J.L. & Goodman, H.M. (Oxford Univ. Press, New York, 1999), p.189-221).
Синтез ГР регулируется факторами с положительным или отрицательным действием, выделяемыми гипоталамусом. Основным фактором, контролирующим продукцию ГР, является гормон, высвобождающий гормон роста человека (GHRH), который у человека представляет собой пептид, состоящий из 44 аминокилот.
ГР и GHRH причастны к различным заболеваниям. Среди них можно, в частности, упомянуть рак (например, рак предстательной железы или рак легкого), акромегалию, диабетическую ретинопатию и нефропатию; лечение указанных патологий проводят с помощью антагонистов GHRH. Из-за роста числа заболеваний, которые возможно относятся к этой проблеме, в данной области продолжаются поиски антагонистов GHRH.
Таким образом, авторы настоящего изобретения как раз только что выделили новый белок растительного происхождения, обладающий свойством связывать GHRH.
Таким образом, объектом настоящего изобретения является, прежде всего, изолят белка, который можно получить экстракцией из растения Pilocarpus heterophyllus, который отличается тем, что он имеет молярную массу приблизительно 90,9 кДа и содержит фрагменты пептидных последовательностей SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, при этом указанный белок может находиться в гликозилированной или негликозилированной форме. Чтобы упростить приведенное ниже описание, далее указанный белок обозначают как "гетерокарпин".
Указанными последовательностями SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 являются следующие:
SEQ ID NO:1: KLIGARYFDK
SEQ ID NO:2: YGEDIIVGVIDSGV
SEQ ID NO:3: PESESY
Используемый ниже перечень (а также и далее по тексту настоящей заявки) для определения пептидов является перечнем, который определен документом "IUPAC-IUB Commissioner on Biochemical Nomenclature", в котором в соответствии с обычным изображением N-концевой остаток аминокислоты (аминогруппа) показан слева, а С-концевой остаток аминокислоты (карбоксигруппа) показан справа. Термин "природная аминокислота" обозначает одну из природных L-аминокислот, находящихся в природных белках: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp и His.
Белок называют выделенным, если его извлекают из его первоначальной среды. В частности, природный белок является выделенным, если его отделяют от биологического материала, с которым он сосуществует в природной системе.
Настоящее изобретение относится, предпочтительно, к гетерокарпину в негликозилированной форме.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения гетерокарпин получают из экстракта клеток растения Pilocarpus heterophyllus, культивированного in vitro.
Объектом настоящего изобретения является также моноклональное антитело или связующий фрагмент антигена моноклонального антитела, который особым образом связывает гетерокарпин.
Свойством гетерокарпина является связывание GHRH человека. Гетерокарпин связывает GHRH человека in vitro, а также замедляет синтез циклического АМФ, индуцированный в процессе связывания GHRH человека на его рецепторе. У крысы комплекс гетерокарпин/GHRH человека формируется in vivo в крови и в зависимости от дозы замедляет синтез ГР, индуцированный 10 мг GHRH человека в отношении моль на моль. Свойством гетерокарпина является связывание GHRH человека.
Указанные свойства позволяют использовать соединения по изобретению в фармации. Таким образом, в качестве лекарственного препарата объектом настоящего изобретения является также гетерокарпин в гликозилированной или негликозилированной форме. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим в качестве активного элемента гетерокарпин в гликозилированной или негликозилированной форме, при этом указанные композиции также содержат один или несколько фармацевтически приемлемых наполнителей. Кроме того, объектом изобретения является также применение гетерокарпина в гликозилированной или негликозилированной форме для получения лекарственных средств, предназначенных для подавления влияния GHRH, для лечения пролиферативных заболеваний (и, в частности, рака), лечения акромегалии или лечения диабетической ретинопатии и нефропатии. Что касается рака, то гетерокарпин особенно подходит для получения лекарственного средства, способного лечить раковые и панкреатические опухоли, гипоталамо-гипофизарные ганглиоцитомы, бронхиальные, кишечные и печеночные карциномы, симпатоадренергические опухоли, феохромоцитомы, гипофизарные аденомы и карциномы щитовидной железы. Гетерокарпин особенно пригоден для получения лекарственного средства, способного лечить рак, развитие которого зависит от фактора роста GHRH, и, в частности, для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, в том числе мелкоклеточного рака легких и рака груди (особенно мелкоклеточного рака легких).
Еще одним объектом настоящего изобретения в качестве лекарственного средства является моноклональное антитело или связующий фрагментантигена моноклонального антитела, который особым образом связывает гетерокарпин. Кроме того, изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного элемента моноклональное антитело или связующий фрагментантигена моноклонального антитела, который особым образом связывает гетерокарпин, при этом указанная композиция также содержит один или несколько фармацевтически приемлемых наполнителей. Кроме того, изобретение относится к применению моноклонального антитела или связующего фрагментаантигена моноклонального антитела, который особым образом связывает гетерокарпин, для получения лекарственных средств, предназначенных для подавления эффектов GHRH, лечения пролиферативных заболеваний (и, в частности, рака), лечения акромегалии или лечения диабетической ретинопатии и нефропатии. Что касается рака, то указанное моноклональное антитело или указанный связующий фрагментантигена моноклонального антитела особенно пригодны для получения лекарственного средства, способного лечить раковые и панкреатические опухоли, гипоталамо-гипофизарные ганглиоцитомы, бронхиальные, кишечные и печеночные карциномы, симпатоадренергические опухоли, феохромоцитомы, гипофизарные аденомы и карциномы щитовидной железы.
Настоящее изобретение также относится к применению гетерокарпина в качестве эксципиента в фармацевтической композиции, предназначенной для пролонгированного высвобождения GHRH. Оно также относится к фармацевтической композиции, содержащей GHRH, гетерокарпин и один или несколько фармацевтически приемлемых наполнителей.
Наконец, другими объектами настоящего изобретения являются способы, позволяющие экстрагировать и выделять гетерокарпин из клеток растения Pilocarpus heterophyllus, при этом указанные клетки, предпочтительно, образуются из культур in vitro. Указанные способы включают, главным образом, стадию экстракции клеток растения Pilocarpus heterophyllus водой при температуре от 0 до 50°С и, предпочтительно, от 4 до 25°С, при этом указанная стадия экстрагирования сопровождается фильтрацией с целью отделения фильтрата, богатого гетерокарпином, от клеток Pilocarpus heterophyllus, а также отделением гетерокарпина от других компонентов, извлеченных из растения Pilocarpus heterophyllus.
В соответствии с первым вариантом осуществления настоящего изобретения указанные способы экстракции и выделения включают, главным образом, следующие последовательные стадии:
а) стадию экстракции клеток растения Pilocarpus heterophyllus водой при температуре от 0 до 50°С и, предпочтительно, от 4 до 25°С, при этом после указанной стадии экстракции проводят фильтрацию с целью отделения фильтрата, богатого гетерокарпином, от клеток Pilocarpus heterophyllus;
b) стадию осаждения экстрагированных белков, например, добавлением сульфата аммония, с последующей стадией отделения осадка (фильтрацией или, предпочтительно, центрифугированием);
с) растворение в воде полученного на стадии b) осадка; и
d) стадию гель-хроматографии с целью отделения гетерокарпина от других компонентов раствора.
В соответствии с другим вариантом указанные способы экстракции и выделения включают, главным образом, следующие последовательные стадии:
а) стадию экстракции клеток растения Pilocarpus heterophyllus водой при температуре от 0 до 50°С и, предпочтительно, от 4 до 25°С, при этом после указанной стадии экстракции проводят фильтрацию с целью отделения фильтрата, богатого гетерокарпином, от клеток Pilocarpus heterophyllus;
b) стадию обезжиривания, полученного на стадии а) раствора, подкисленного добавлением не являющейся окислителем кислоты (например, хлористоводородной кислоты, серной кислоты, фосфорной кислоты), при рН, который, предпочтительно, находится в интервале от 2 до 4, с помощью экстракции типа жидкость-жидкость (предпочтительно, с использованием органического растворителя, такого как дихлорметан, гептан, гексан или циклогексан);
с) стадию удаления танинов взаимодействием обезжиренного раствора, полученного на стадии с), с поливинилпирролидоном (а также найлоном 66), с последующей фильтрацией на смоле с крупными порами (предпочтительно, основу подобной смолы, такой как смола Diaion® HP-20, составляет полистирол);
d) изменение рН фильтрата, полученного на стадии с), к щелочному (предпочтительно, рН составляет от 9 до 11) добавлением основания, такого как гидроксид аммония, гидроксид натрия или гидроксид калия;
е) одну или несколько стадий фильтрации на анионообменной смоле, при этом элюентом для указанной или указанных стадий фильтрации, предпочтительно, является буферный раствор, имеющий рН от 9 до 11 и необязательно содержащий соль (такую как, например, хлорид натрия или сульфат аммония) с градиентами концентрации с целью отделения гетерокарпина от других компонентов раствора; и
f) стадию обессоливания, заключающуюся в подаче раствора, полученного на стадии е), на смолу (такую как смола Sephadex®G25 или Superdex®200 HR), разделяющую компоненты смеси в зависимости от их молярной массы и в зависимости от элюирования указанной смеси водой на указанной смоле.
Фармацевтические композиции, содержащие соединение по настоящему изобретению, могут находиться в твердой форме, например, в виде порошков, пилюль, гранул, таблеток, липосом, желатиновых капсул или суппозиториев. Пилюли, таблетки или желатиновые капсулы могут быть покрыты веществом, способным защитить состав от воздействия желудочной кислоты или ферментов в желудке человека в течение времени, достаточного для того, чтобы указанная композиция прошла в тонкий кишечник человека, не успев перевариться. Соединение можно также вводить местно, например, непосредственно в место опухоли. Соединение можно также вводить согласно процессу пролонгированного высвобождения (например, используя композицию для пролонгированного высвобождения или насос для перфузии). Подходящими твердыми основами могут быть, например, фосфат кальция, стеарат магния, карбонат магния, тальк, сахара, лактоза, декстрин, крахмал, желатин, целлюлоза, метилцеллюлоза, натриевое производное карбоксиметилцеллюлозы, поливинилпирролидин и воск.
Фармацевтические композиции, содержащие соединение по настоящему изобретению, могут также находиться в жидкой форме, например, в виде растворов, эмульсий, суспензий или состава с пролонгированным высвобождением. Подходящими жидкими основами могут быть, например, вода, органические растворители, такие как глицерин или гликоли, такие как полиэтиленгликоль, а также их смеси в воде в различных пропорциях.
Лекарственное средство по настоящему изобретению можно водить местно, перорально, парентерально, внутримышечно и т.д.
Доза соединения по настоящему изобретению, предусмотренная для лечения заболеваний и расстройств, упомянутых ранее, зависит от способа введения, возраста и массы тела пациента, а также от его состояния, и должна окончательно определяться лечащим врачом или ветеринаром. Подобное количество, определенное лечащим врачом или ветеринаром, называют в настоящей заявке терапевтически "эффективным количеством".
В соответствии с изобретением гетерокарпин можно получить по способу, описанному далее.
Получение гетерокарпина
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения готовят культуры in vitro скоплений или суспензий клеток, полученных из различных органов растения. Указанные культивированные ткани в полутвердой или жидкой среде способны биосинтезировать соединения, обладающие биологическими свойствами.
Под "скоплением" в настоящей заявке следует понимать макроскопический конгломерат недифференцированных клеток растений в культуральной полутвердой питательной среде. Под "недифференцированными клетками" в настоящей заявке обозначают клетки, которые способны при определенных условиях размножаться в виде скопления или суспензии клеток без проявления морфогенеза. Наконец, под "суспензией клеток" понимают недифференцированные клетки, которые могут образовывать макроскопические конгломераты в культуральной жидкой питательной среде.
Выбор питательной среды, гормонов, условий культуры является неотъемлемой частью настоящего изобретения, так же как и экстракция и анализ экстракта из указанных культур in vitro.
Клетки семян Pilocarpus heterophyllus могут быть культивированы в суспензии, например, в соответствии со следующей процедурой.
Перед получением культуры органы обеззараживают в соответствии с обычными методами. Органы проростков in vitro также используются в качестве сырья для каллогенеза без проведения предварительной дезинфекции. Предпочтительной основной питательной средой является одна из сред, которую используют в настоящее время для культуры in vitro, речь идет о среде Gamborg (описано в Gamborg et coll., Nutrient requirements of suspension cultures of Soybean root cells, Exp. Cell Res. (1968), 50(1), 151-158). Источником углерода является сахароза, но можно также использовать глюкозу с концентрацией от 1 до 120 г/л, предпочтительно, приблизительно 30 г/л. Можно также снизить содержание макроэлементов под действием фактора 2. В смесь добавляют ауксин или ауксин и цитокинин, предпочтительно, для объединения 2 гормонов, обычно, 2,4-дихлорофеноксиуксусной кислоты и кинетана, а α-нафталинуксусная кислота (ANA), β-индолуксусная кислота (AIA), β-индолбутановая кислота (AIB) или пиклорам могут сочетаться с кинетином или бензиламинопурином (ВАР). Концентрация может варьировать от 0,1 до 10 мг/л для цитокинина (можно выбрать, например, 0,06 мг/л). Витаминами являются такие, которые сочетаются с различными основными средами. Культуры получают на свету или в темноте. Температура может варьировать от 10°С до 33°С, но составляет, предпочтительно, приблизительно 23°С. рН смеси находится в интервале от 4 до 6,5 и, предпочтительно, его доводят до 5,8 перед стерилизацией. В смесь можно добавить или не добавлять агар.
Первичные скопления появляются по прошествии нескольких дней культивирования и могут быть отделены от исходного трансплантата, отобраны и вновь высажены по прошествии приблизительно 1 месяца, затем культивированы на полутвердой среде из агара (в пробирке или чашке Петри), по прошествии от 4 до 8 недель, предпочтительно, 6 недель, можно также сохранить скопление в течение нескольких лет последовательными пересаживаниями в новые среды. Можно также перенести скопление в жидкую перемешиваемую среду культуры (колба Эрленмейера или биореактор) с пересаживаниями от 2 до 6 недель, предпочтительно 3 недель.
Полученные штаммы различаются генетическим происхождением, условиями культивирования, свойствами и отсутствием морфогенеза.
Лиофилизованные клетки Pilocarpus heterophyllus экстрагируют водой при температуре от 0 до 50°С, и, предпочтительно, от 4 до 25°С. Полученный таким образом экстракт лиофилизуют перед повторным растворением в соответствующей концентрации (например, порядка 30% от сухого вещества). Белки, осажденные добавлением концентрированного раствора сульфата аммония (например, с концентрацией от 70 до 90% концентрации насыщения), снова растворяют в минимальном количестве воды, и нерастворимые вещества отделяют центрифугированием. Далее белки отделяют колоночной хроматографией (при этом элюентом, предпочтительно, является вода) и затем извлекают гетерокарпин (регистрируют по его молярной массе порядка 90,9 кДа).
Получение антител, которые специфически связывают гетерокарпин
В настоящем изобретении раскрываются агенты связывания, такие как антитела, которые специфически связывают гетерокарпин. Подобный агент называют «специфически связывающим» белок, если он реагирует на обнаруживаемом уровне (например, анализом ELISA) с указанным белком и не реагирует обнаруживаемым образом с другими белками. "Связывание" относится к нековалентному объединению между двумя отдельными молекулами таким образом, что формируется комплекс. Способность к связыванию может быть измерена, например, определением константы связывания для образования комплекса. Константа связывания представляет собой величину, равную отношению величины концентрации комплекса к произведению величин концентраций некомплексованных компонентов. 2 продукта называют "связанными", когда константа концентрации достигает 103 л/моль. Константу связывания можно определить, используя методы, хорошо известные специалисту.
Любой агент, способный удовлетворять вышеуказанным критериям, может рассматриваться в качестве связывающего агента.
В настоящем изобретении агентом связывания является, предпочтительно, антитело или его фрагмент. Антитела могут быть получены любым способом, доступным специалисту (cf. Harlow et Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Обычно антитела могут быть получены способами клеточного культивирования, включая образование моноклональных антител, или через трансфекции генов антител в клетки-хозяева бактерий или млекопитающих, с целью получения рекомбинантных антител.
Среди других методов используют, предпочтительно, методы, описанные далее. Иммуноген, содержащий гетерокарпин, вводят группе млекопитающих (например, мышам, крысам, кроликам, баранам или козам). На указанной стадии гетерокарпин может служить иммуногеном без модификации. В качестве альтернативы может быть вызван более высокий относящийся к иммунитету отклик, если гетерокарпин связывают с транспортным белком, таким как бычий сывороточный альбумин или гемоцианин пателлы. Иммуноген вводят животному-хозяину, предпочтительно, по определенной ранее схеме и животным периодически пускают кровь. Таким образом, особые поликлональные антитела гетерокарпина могут быть очищены из подобных антисывороток, например, афинной хроматографией, используя гетерокарпин, иммобилизованный на соответствующей твердой основе.
Фармацевтические композиции, предназначенные для высвобождения GHRH
Указанные композиции могут быть, в частности, получены из гетерокарпина и GHRH в соответствии с методами, описанными в журнале De Wolf et Brett, Pharmacological Reviews (2000), 52, 207-236 и приведенные в нем ссылки.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют то же значение, что и принятое специалистами в области, к которой относится настоящее изобретение. Также, все публикации, заявки на патент, все патенты и все другие упомянутые ссылки включены в настоящее описание посредством ссылки.
Следующие примеры приведены для иллюстрации вышеуказанных процессов и никаким образом не ограничивают настоящее изобретение.
ПОЛУЧЕНИЕ ГЕТЕРОКАРПИНА
Пример 1:
Культивирование клеток in vitro:
Проращивают семя Pilocarpus heterophyllus и берут на анализ росток, полученный в результате указанного проращивания. Указанный саженец помещают в культуру в среде Gamborg (Gamborg et coll., Nutrient requirements of suspension cultures of Soybean root cells, Exp. Cell Res. (1968), 50(1), 151-158), добавляют 30 г/л сахарозы, 1 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и 0,06 мг/л кинетина. Культуру получают в пробирках при температуре 23°С в темноте. Каждые 6 недель осуществляют пересаживания в обычных условиях. Гранулоподобные штаммы имеют бежевую окраску.
Кинетику роста штаммов, основанную на увеличении массы свежего и сухого вещества биомассы, исследуют на восьмую неделю. Скопления из 2 пробирок объединяют и дважды в неделю осуществляют сбор, при этом первый сбор происходит во время 0. Далее скопления и агар собирают и лиофилизуют. Устанавливают, что до шести недель культивирования рост является экспоненциальным до появления стационарной фазы роста.
Экстракция клеточных культур:
25 г лиофилизованных клеток Pilocarpus heterophyllus извлекают, помещая 2 раза в 375 мл воды при температуре 4°С, и оставляют на ночь при температуре 4°С, далее в 250 мл при температуре 4°С в течение 4 час и наконец промывают 125 мл воды при температуре 4°С. Каждый полученный таким образом водный раствор фильтруют под вакуумом через стеклянный фильтр со слоем целита, с целью отделения клеточного дебриса от водного раствора. Объединенные водные растворы далее лиофилизуют с целью получения 9,4 г сухого вещества. Лиофилизованный сухой экстракт затем растворяют в 31 мл воды при температуре 20°С с целью получения раствора, содержащего 30% сухого экстракта. При постоянном перемешивании на магнитной мешалке добавляют маленькими порциями 17,4 г сульфата аммония с тем, чтобы осадить фракцию белка. Осадок белка затем отделяют от раствора сульфата аммония центрифугированием при скорости 3000 об/мин в течение 20 мин. Раствор сульфата аммония декантируют и осажденные белки растворяют в 22 мл воды, снова центрифугируют и фильтруют с целью удаления нерастворимых частиц.
Затем полученный фильтрат подвергают гель-фильтрационной хроматографии. Его впрыскивают в колонку (Buchi № 19678, L=230 мм; внутренний диаметр=26 мм), наполненную SuperdexТМ200(Anersham Pharmacia Biotech, ссылка № 17-1043-01; частицы со средним диаметром 13 мкм), полученную в соответствии с рекомендациями изготовителя, используя в качестве элюента сверхчистую воду (Water's Milli-Q) с расходом 5 мл в минуту. Далее собирают фракции по 40 мл, при этом активный белок находится в третьей и четвертой фракциях. Указанные фракции лиофилизуют с целью получения порядка 14,2 мг активного продукта.
О чистоте полученного продукта свидетельствует единственная полоса при электрофорезе в полиакриламидном геле, содержащем додецилсульфат натрия (SDS PAGE). Продукт, соответствующий указанной полосе, обозначают далее как гетерокарпин.
Пример 2:
Клетки, культивированные in vitro в соответствии с процессом, который описан в примере 1, экстрагируют по методу, описанному далее.
100 г лиофилизованных клеток Pilocarpus heterophyllus экстрагируют с помощью 2 литров деионизованной воды при температуре 20°С, при этом смесь продолжают перемешивать всю ночь. Клетки и экстракт фильтруют отсасыванием через стеклянный фильтр (пористость 3, диаметр 20 см), покрытый слоем целита (предварительно промытого кислотой; толщиной от 1 до 2 см). Извлеченные клетки перед их удалением промывают 400 мл деионизованной воды. Затем водный фильтрат подкисляют до рН 3,0 добавлением порядка 10 мл 18%-ной хлористоводородной кислоты. Далее подкисленный раствор обезжиривают экстракцией жидкость-жидкость с помощью 400 мл дихлорметана. Фазу дихлорметана декантируют, затем удаляют. Обезжиренный раствор подвергают выпариванию на ротационном испарителе с целью удаления оставшегося дихлорметана. Далее к обезжиренному раствору добавляют порядка 30 г поливинилпирролидона (рН порядка 3,0) и перемешивают смесь в течение приблизительно 30 мин для удаления танинов. Смесь фильтруют отсасыванием через фильтр со стеклянным фильтрующим дном (пористость 3, диаметр 10 см), покрытым смешанным слоем из смеси 25 г целита (предварительно промытого кислотой) и 25 г поливинилпирролидона. Затем фильтрат пропускают через слой 400 мл Diaion®HP-20 (Mitsubishi Chemical Company), предварительно активированный в соответствии с инструкциями изготовителя. Далее целевой фильтрат подщелачивают (рН 10) добавлением порядка 60 мл 20%-ного раствора гидроксида аммония. После 30 мин покоя появляется легкий осадок. Далее 1 г целита (предварительно промытого кислотой) добавляют к щелочному раствору, который затем фильтруют отсасыванием через фильтр с мембраной (0,22 мкм). Затем порядка 2 л фильтрата пропускают через колонку Hiprep® Q XL 16/10, установленную над очистителем Akta® и предварительно уравновешенную при рН 10,2 с помощью буферного раствора 0,1М пиперазин/HCl, с расходом 0,5 мл в минуту (колонка Hiprep® и очиститель Akta® являются продуктами компании Amersham Biosciences). Колонку затем последовательно промывают 6 объемами колонки целевым буферным раствором при рН 10,2, 5 объемами колонки того же буферного раствора, содержащего концентрацию 0,2М NaCl, и 10 объемами колонки того же буферного раствора, содержащего концентрацию 1М NaCl. Большая часть гетерокарпина собирается в трех первых 3 объемах колонки буферного раствора, содержащего концентрацию 1М NaCl. Активные фракции обессоливают прохождением через колонку Sephadex® G25 (объем слоя: 260 мл), используя деионизованную воду в качестве элюента. Активные фракции, находящиеся в первом объеме колонки, соответствующие мертвому объему, затем лиофилизуют с целью получения 179 мг гетерокарпина. Полученный таким образом гетерокарпин дает практически одну полосу на геле SDS PAGE.
Определение свойств гетерокарпина
Анализ и микропоследовательность оснований в ДНК:
Образцы помещают на 10%-ый полиакриламидный гель. После миграции гели фиксируют и окрашивают в голубой цвет с помощью красителя Coomassie.
Гелевые дрожжи, показанные на Фиг. 3, соответствуют дрожжам 1, 2, 3, 4 и 5 и являются соответственно маркером молекулярной массы (Amersham), 0,5, 1 и 2 мкг содержимого конечной фракции гетерокарпина, которая получена в примере 1, и маркером молекулярной массы (Amersham). Определение молекулярной массы с помощью стандартной кривой показателя молекулярной массы с использованием классических средств обработки данных, хорошо известных специалисту (например, программу Bio-Profil Bio1D de Viber Lourmat), позволяет установить, что гетерокарпин имеет молекулярную массу 90,9 кД (±1,6 кД).
Для анализа микропоследовательности оснований в ДНК белка полоску полиакриламида, содержащую белок, разрезают и выдерживают в 300 мкл буферного раствора для настаивания, содержащего 50 мМ Tris (рН 8,6), 0,03% додецилсульфата натрия, при температуре 35°С в течение 18 час в присутствии 0,4 мкг эндолизина-С (Sigma). Полученные пептиды разделяют посредством HPLC на колонне с DEAE-С18 с диаметром 1 мм. Градиентное разделение проводят смесью ацетонитрила (от 2 до 70%) и 0,1%-ной трифторуксусной кислоты (TFA). Определение последовательности оснований в ДНК затем осуществляют с помощью секвенсера Procise (Applied Biosystem). Три пика, расположенных последовательно, позволяют однозначно охарактеризовать гетерокарпин. Соответствующие последовательности обозначены в настоящей заявке как последовательности SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3.
Анализ гликопротеинов осуществляют определением структуры сахаров гликопротеинов, разделенных на геле SDS-PAGE. Системой детекции является модификация методов "Periodic acid-Schiff", которая приводит к появлению пурпурных полосок, указывающих на гликопротеины (Sigma). Для гетерокарпина по примеру 1 получают результат, представленный на Фиг. 4.
Фармакологические свойства гетерокарпина
Стабильные трансфекции человеческого рецептора GHRH (hGHRH-R):
Эмбриональные человеческие клетки почек, НЕК-293 (клеточный штамм, разработанный Dr. Stuart Sealfon, Mount Sinai Medical School, New York, New York), устойчиво экспрессирующие человеческий рецептор GHRH, были получены от Dr. Kelly Mayo (Northwestern University, Chicago, IL).
Клеточная культура и получение мембран:
Описанные ранее клетки НЕК-293, стабильно трансфицированные человеческим рецептором GHRH, культивируют в DMEM (модифицированная по методу Дульбекко среда Игла, с большим содержанием глюкозы; получают от Life technologies) с добавлением 0,4 мг/мл G418 (Life technologies). Клетки гомогенизируют в буферном растворе А, содержащем 50 мМ HEPES (рН 7,4), 5 мМ хлорида магния (MgCl2), 2 мМ этиленгликоль-бис(2-аминоэтил)-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (EGTA) и 50 мкг/мл бацитрацина и подвергают ультразвуковой обработке в том же буферном растворе А. Указанным образом гомогенизованные клетки центрифугируют при температуре 4°С с ускорением 39000 g в течение 10 мин, суспендируют в буферном раствор А и снова центрифугируют при температуре 4°С с ускорением 40000 g в течение 10 мин. Полное количество мембранных белков определяют по методу Брэдфорда. Указанным образом покрытые осадком мембраны хранят при температуре минус 80°С для дальнейшего использования.
Тестирование на конкурентное связывание hGHRH-R:
Мембраны клеток НЕК-293, стабильно трансфицированные рецептором GHRH человека, разбавляют до концентрации 100 мкг/мл в активном буферном растворе, содержащем 50 мМ HEPES (рН 7,4), 5 мМ MgCl2, 2 мМ EGTA, 50 мкг/мл бацитрацина и 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Мембраны помещают в инкубатор с 0,05 нМ [125I]GHRH(1-44 амид)(Amersham) в конечном объеме 200 мкл в присутствии возрастающих концентраций гетерокарпина в течение 2 час при температуре 23°С. Реакцию останавливают быстрой фильтрацией на фильтрах с 96 отверстиями GF/С, предварительно заправленных 0,1% полиэтиленимином. Затем фильтры промывают три раза при температуре 4°С промывочным буферным раствором, содержащим 50 мМ Tris (рН 7,4), используя фильтровальную установку Packard с 96 отверстиями. Высушенные фильтры заливают 20 мкл коктейля для сцинтилляции (Microscint O, Packard) и подсчитывают на Topcount (Packard). Определяют неспецифическую активность в присутствии 100 нМ hGHRH. Получают кривую зависимости ответной реакции от дозы для hGHRH (0,001 нМ-100 нМ), и полученные результаты представлены на Фиг. 1.
Конкурентное образование циклического АМФ:
Клетки НЕК-293, стабильно трансфицированные рецептором GHRH человека, помещают на планшеты для культивирования с 48 лунками и культивируют в течение 3 дней. Затем среду культуры извлекают и замещают средой В, содержащей 250 мкл DMEM (модифицированная по методу Дульбекко среда Игла с большим содержанием глюкозы; поставляется компанией Life technologies) в присутствии 0,5% BSA, 0,5 мМ 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX) и предварительно подвергают инкубации в течение 5 мин при температуре 37°С. По окончании периода предварительной инкубации гетерокарпин тестируют в течение дополнительных 20 мин. Наблюдаемые концентрации представлены на Фиг. 2. Инкубацию останавливают добавлением 100 мкл 0,1М HCl и аликвотные части анализируют на содержание циклического АМФ, используя комплект FlashPlate (New England Nuclear).
Дозировка GH у крыс:
Уровни GH у крыс (самцы, Sprague Dawley) измеряют с помощью проб крови на анализ посредством ферментативно-иммунологического теста, разработанного компанией Spi-Bio (Spi-Bio, France). Крысам внутривенно вводят гетерокарпин в возрастающих дозах (применяют один и тот же носитель, 1, 3 и 10 нмоль), затем, спустя 10 мин, внутривенно вводят 10 мкг (3 нмоль) hGHRH. По прошествии 10 мин после введения hGHRH уровни гормона роста измеряют с помощью проб крови на анализ, как описано ранее. Полученные результаты представлены на Фиг. 5.
Измерение противоопухолевой активности:
Опухолевые клетки человека и в особенности клетки мелкоклеточного рака легких Н-69 вводят подкожно подопытным мышам с целью получения ксенопрививки опухоли человека приблизительно 80 мм3 по прошествии порядка десяти дней после первой прививки. Мышей лечат через день внутривенным введением гетерокарпина с возрастающими дозами (единственный носитель, 2,5 мг/кг, 5 мг/кг и 10 мг/кг). Далее измеряют объем опухоли каждые 4 дня в течение всего срока лечения.
Краткое описание фигур:
На Фиг 1 изображена кривая, представляющая ингибирование связывания GHRH человека рецептором GHRH человека в зависимости от возрастающих концентраций гетерокарпина.
На Фиг 2 изображена кривая, представляющая замедление получения циклического АМФ в клетках, устойчиво трансфекцированных рецептором GHRH человека, в присутствии 10 нМ GHRH человека в зависимости от возрастающих концентраций гетерокарпина.
Фиг. 3 является изображением гелевой пластинки белка SDS-PAGE, которая показывает присутствие гетерокарпина, имеющего молекулярный вес 90,9 кДа.
Фиг. 4 является изображением гелевой пластинки белка SDS-PAGE, которая показывает, что гетерокарпин является гликопротеином (секция В).
На Фиг. 5 представлены гистограммы, изображающие ингибирование синтеза GH у крыс в присутствии 10 мкг GHRH человека в зависимости от возрастающих концентраций гетерокарпина.
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, развитие которого зависит от фактора роста GHRH, и, в частности, для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, выбранного из мелкоклеточного рака легких и рака груди. Данное средство получают из белка растительного происхождения, полученного из растения Pilocarpus heterophyllus, обладающего противораковыми свойствами, который связывает фактор, высвобождающий гормон роста человека (GHRH). Данное изобретение обеспечивает высокую противораковую активность в отношении мелкоклеточного рака легких и рака груди. 4 з.п. ф-лы, 4 ил.
| WO 9516707 А, 22.06.1995 | |||
| Генератор равномерно распределенных псевдослучайных чисел | 1977 |
|
SU674007A2 |
| RU 95103969 А1, 27.05.1997 | |||
| КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ АНГИОГЕНЕЗА, МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, ПОЛИПЕПТИД, СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ РОСТА ОПУХОЛИ (ВАРИАНТЫ) | 1992 |
|
RU2170589C2 |
| Jaffe CA | |||
| et | |||
| al | |||
| "Supression of growth hormone (GH) hypersecretion due to ectopic GH-releasing hormone (GHRH) by a selective GHRH antagonist.", J | |||
| Clin | |||
| Endocrinol | |||
| Metab, 1997 Feb; 82(2):634-7. | |||
