СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ У НОВОРОЖДЕННЫХ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/68 G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии, и найдет использование для диагностики цитомегаловирусной инфекции у детей первых трех месяцев жизни.

Цитомегаловирусная инфекция, протекающая бессимптомно для матери, нередко вызывает тяжелые и необратимые изменения у плода, которые могут проявляться в любом возрасте (Л.Б.Кистенева. Цитомегаловирусная инфекция как проблема перинатальной патологии: этиология, патогенез, диагностика. Российский вестник перинатологии и педиатрии, 2003, №4, С.55-59). Таким образом, проблема вертикальной передачи цитомегаловируса от беременной к плоду с последующей реализацией инфекции в виде многообразных патологических проявлений у новорожденного актуальна до настоящего времени.

Врожденная цитомегаловирусная инфекция в большинстве случаев протекает субклинически, и только у 5-10% детей при рождении обнаруживаются те или иные признаки заболевания. Клиническая диагностика цитомегалии затруднена в связи с выраженным полиморфизмом заболевания (Revello M.G., Gerna G. Diagnisis and management of human cytomegalovirus infection in the morther, fetus and newbom infant. Clin.Mcrobiol. Rev.2002; 15:4:680-715). Дети, инфицированные цитомегаловирусами, даже при отсутствии у них клинических проявлений нуждаются в длительном наблюдении (Fowler K.B., Stagno S, Pass R.F. Maternal immunity and prevention of congenital cytomegalovirus infection. JAMA 2003; 26: 289: 8:1008-1011).

Проблема диагностики цитомегаловирусной инфекции является чрезвычайно важной. С одной стороны, в практике неонатологов имеет место позднее распознавание и несвоевременное лечение данной патологии, с другой - отмечается наличие гипердиагностики.

Серологическая диагностика основана на выявлении специфических антител IgG, IgM к цитомегаловирусу иммуноферментным анализом. Однако отсутствие специфичных антител нередко не означает отсутствие инфекционного процесса, так как исследование могло проводиться в фазе формирования иммунного ответа (Л.Б.Кистенева. Цитомегаловирусная инфекция как проблема перинатальной патологии: этиология, патогенез, диагностика. Российский вестник перинатологии и педиатрии, 2003, №4, С.55-59).

В работах последних лет (Ю.Н.Воронцова и соавт. Сравнительный анализ клинических и лабораторных характеристик врожденной цитомегаловирусной инфекции у недоношенных детей. Российский вестник перинатологии и педиатрии, 2004, №2) показано, что отрицательный результат обследования методом полимеразной цепной реакции, полученный в первые дни жизни, не исключает отсроченной реализации внутриутробной цитомегаловирусной инфекции. Исследованиями Н.И.Кудашова и соавт. (Клинико-иммунологические критерии диагностики герпесвирусной инфекции новорожденных. Российский вестник перинатологии и педиатрии, 1998; 5; - С.12-18) доказано, что специфические IgM к вирусу цитомегалии удавалось выявить лишь у 8,7% детей, что подтверждало данные других исследователей об ограниченности диагностической ценности данного показателя.

Оптимизация диагностики цитомегаловирусной инфекции в неонатальном периоде в последние десятилетия осуществлялась с помощью следующих дополнительных методов.

При цитомегаловирусной инфекции у детей первых месяцев жизни определяют нейтропеническое состояние (абсолютное количество нейтрофилов менее 1,5×10⁹/л), при этом относительное количество нейтрофилов может быть либо сниженным, либо субнормальным 22,17±2,15%), длительность которого составляет 1-3 недели, что значительно меньше, чем длительность нейтропении другого генеза, отмечаются высокие показатели спонтанной хемилюминисценции (34,3±3,8×10³ имп./с) и значительное снижение индекса стимуляции (4,25±0,7), выделение субпопуляций Т-лимфоцитов выявило снижение относительного и абсолютного количества СД3 (42,06±1,28%) и СД4 (22,40±2,80%) (Г.И.Гордиенко. Значение синдрома нейтропении при цитомегаловирусной инфекции у детей первых месяцев жизни. Педиатрия, 1999, №1, C.11-14).

У новорожденных с внутриутробной герпес-цитомегаловирусной инфекцией при проведении эхоэнцефалографии с помощью ультразвуковых приборов определяют субэпендимальные кисты и кисты сосудистых сплетений, являющиеся маркерами патоморфологических изменений, возникающих в головном мозге под влиянием инфекции (О.Е.Озерова и соавт. УЗ-особенности структурных изменений головного мозга новорожденных с внутриутробной цитомегаловирусной инфекцией. Журнал «Sono-Ace-Jntemational», 2000, №6).

У детей с внутриутробной инфекцией отмечается достоверное снижение по сравнению с нормой α-фетопротеина до 50% и ниже, в то время как другая перинатальная патология неинфекционного генеза характеризовалась высоким значением этого показателя (И.И.Ткачева и соавт. Рациональные методы профилактики и лечения инфекционно-воспалительных заболеваний матери, плода и новорожденного при акушерской и экстрагенитальной патологии. Вестник Российский Ассоциации акушеров -гинекологов, 1999, №3).

Вышеуказанные способы диагностики недостаточно совершенны в связи с тем, что на основании данных эхографии головного мозга и клинической картины заболевания у новорожденных можно лишь заподозрить герпес-цитомегаловирусную инфекцию, не проводя дифференцильную диагностику между указанными инфекциями, и сформировать группу для комплексного иммунологического обследования, в результате которого диагноз будет уточнен. Нейтропеническое состояние у детей раннего возраста также может встречаться как сопутствующий синдром не только при цитомегаловирусной инфекции, но и при других интра- и постнатальных вирусных инфекциях, а также при генерализованных вирусно-бактериальных инфекциях.

В «Протоколах диагностики, лечения и профилактики внутриутробных инфекций у новорожденных детей» (Москва, 2001), предложены лабораторные критерии активности ЦМВИ. Сущность способа состоит в том, что новорожденным в крови проводят исследование серологических маркеров иммунного ответа методом ИФА (специфические анти ЦМВ IgG и IgM), и выявление антител класса IgM в пуповинной крови ребенка первых недель жизни является одним из важных критериев диагностики внутриутробной ЦМВ-инфекции. Подтверждением активного периода врожденной ЦМВИ служит также выявление наряду с анти-ЦМВ IgM анти ЦМВ IgG с нарастанием их титров в динамике. Данный способ обладает рядом несовершенств:

1. Выявление антицитомегаловирусных иммуноглобулинов G в сыворотке крови новорожденного без сопоставления с материнскими титрами не является диагностически значимым вследствие возможности их трансплацентарного переноса из организма матери.

2. У некоторых детей с врожденной ЦМВИ из-за развития иммунологической толерантности к антигену вируса цитомегалии возможен неадекватный специфический анти-ЦМВ иммунный ответ (инфицирование ЦМВ не сопровождается эффективным синтезом анти-ЦМВ-антител).

Прототипом изобретения избран способ диагностики внутриутробной инфекции у новорожденных, родившихся у пациенток группы высокого инфекционного риска, среди которых достоверно чаще выявлялась цитомегаловирусная инфекция. При этом определяется содержание цитокинов в амниотической жидкости, пуповинной крови и сыворотке крови женщин с внутриутробной инфекций (В.И.Кулаков и соавт. Содержание цитокинов в амниотичесокй жидкости, пуповинной крови и сыворотке крови женщин с внутриутробной инфекцией. Акушерство и гинекология, 2005, №5, С.14-17).

Сущность способа, избранного в качестве прототипа, состоит в том, что реализация внутриутробной инфекции сопровождается достоверным увеличением коэффициента соотношения ИЛ-1/ИЛ-10 в сыворотке крови беременной, амниотической жидкости и пуповинной крови новорожденного.

Способ, избранный в качестве прототипа, обладает рядом несовершенств:

1. Предполагает использование одновременно в нескольких биологических жидкостях: в сыворотке крови беременной, в амниотической жидкости и пуповинной крови.

2. Не позволяет прогнозировать изолированно цитомегаловирусную инфекцию.

3. Используется только для прогноза ВУИ у новорожденных и не может быть использован для прогноза ЦМВИ у детей первых трех месяцев жизни.

Указанные недостатки устраняются в данном заявленном способе.

Задача изобретения: повышение точности доклинической диагностики цитомегаловирусной инфекции у новорожденных и детей первых трех месяцев жизни.

Поставленная задача решается тем, что детям, родившимся клинически здоровыми от матерей, инфицированных цитомегаловирусом, в пуповинной крови определяют интерлейкин-2 (ИЛ-2) и интерлейкин-4 (ИЛ-4) методом ИФА набором реактивов ИФА-IL-2, и ИФА-IL-4 (фирма «ProCon», Россия) и при выявлении уровней ИЛ-2 232 пг/мл и выше, ИЛ-4 195 пг/мл и выше прогнозируют развитие цитомегаловирусной инфекции у детей первых трех месяцев жизни.

Технический результат, получаемый в результате использования предлагаемого способа, состоит в простоте и нетравматичности метода, обеспечивающего дифференцированный подход к доклинической диагностике отсроченной манифестации цитомегаловирусной инфекции у новорожденных, родившихся от матерей, инфицированных цитомегаловирусом, и своевременное начало адекватного лечения при отсутствии симптомов развития заболевания.

Патогенетический выбор данных маркеров обусловлен следующим. Установлено, что под влиянием ИЛ-2 усиливается пролиферация В-лимфоцитов, цитокин ИЛ-4 играет решающую роль в синтезе основных классов иммуноглобулинов-антител, играющих важную роль в защите организма от инфекций (Р.М.Хаитов, Б.В.Пинегин. Современные представления о защите организма от инфекций. Иммунология, №1. - 2000). Действие этих цитокинов в течение раннего индуцибельного ответа определяет основные механизмы противовирусной защиты на первых этапах развития инфекционного процесса. Под влиянием ИЛ-4 Т-клетки СД4 дифференцируются в Th2-хелперы, ответственные за развитие гуморального иммунитета. Активация на Т-клетках проявляется экспрессией антигенного рецептора СД 154, для которого на В-клетках имеется специфический лиганд СД 40. Взаимодействие СД 154 и СД 40 служит мощным индуктором для пролиферации В-лимфоцитов, которая существенно усиливается под влиянием ИЛ-2. ИЛ-2 необходим для последовательной пролиферации и дифференцировки В-лимфоцитов при стимуляции определенным фрагментом вирусной ДНК.

Все вышесказанное явилось основанием использования повышение уровня ИЛ-2 и ИЛ-4 в крови пуповины для прогноза отсроченной диагностики ЦМВИ у детей первых трех месяцев жизни.

Работоспособность данного метода демонстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Ребенок Г-ов, родился 31.01.2002 г (история родов №80/553) у женщины с отягощенным акушерским анамнезом (2 самоаборта, четыре неразвивающихся беременности), инфицированной цитомегаловирусом. Беременность протекала на фоне эндоцервицита, эрозии шейки матки. Во время беременности у женщины отмечался гестационный пиелонефрит, острый цистит, угроза преждевременных родов, поздний гестоз.

При ДНК диагностике мочи в первые сутки цитомегаловирус не обнаружен. Роды II, в срок. Ребенок родился в удовлетворительной состоянии, массой 3150, длиной 49 см, оценкой по шкале Апгар 8-9 баллов. Кожные покровы бледно-розовые, чистые. В первые сутки жизни проведено исследование уровня интерлейкина (ИЛ-2) и интерлейкина 4 (ИЛ-4) в пуповинной крови по стандартной методике с помощью тест-системы ИФА-IL-2 и ИФА-2 IL-4 (фирмы «ProCon», Россия).

Уровень ИЛ-2 - 232 пг/мл, уровень ИЛ-4 - 195 пг/мл, т.е. у ребенка прогнозируют манифестацию цитомегаловирусной инфекции в первые 3 месяца жизни. Однако в первые 7 суток, когда ребенок находился в роддоме, клинических признаков заболевания не было.

В течение 2-х месяцев после выписки из роддома ребенок развивался соответственно возрасту. В возрасте 2,5 месяцев у ребенка появился насморк, кашель, бледность, гиперемия зева, повысилась температура до 37,8°С, отмечалась неврологическая симптоматика в виде судорожной готовности, гипотонии мышц, снижения сухожильных рефлексов.

Ребенок в возрасте трех месяцев был госпитализирован в отделение патологии новорожденных РНИИАП.

Ребенку во время нахождения в стационаре в возрасте 3-х месяцев была проведена ДНК-диагностика мочи методом ПЦР, при которой был обнаружен цитомегаловирус. При проведении нейросонографического исследования выявлены на сосудистом сплетении субэпендимальные псевдокисты слева: размером 1,9 мм и справа - 2 мм.

При осмотре ЛОР-врачом поставлен диагноз острого ринофарингита.

Ребенку проведен общий анализ крови, в котором выявлен лимфоцитоз. Поставлен диагноз: цитомегаловирусная инфекция: последствие церебральной ишемии II степени, гипертензионный синдром; ринофарингит.

Пример 2

Ребенок Д-лия, родился 29.01.04 (история родов №75) у женщины 24 лет, инфицированной цитомегаловирусом, беременность которой протекала на фоне эрозии шейки матки. В течение беременности отмечалась угроза преждевременных родов в 31 неделю, маловодие, фетоплацентарная недостаточность, гипоплазия плаценты.

В анамнезе у женщины 1 неразвивающаяся беременность. Роды I, в срок. Ребенок родился в удовлетворительном состоянии, массой 3100, длиной 51 см, с оценкой по шкале Апгар 7-8 баллов. Кожные покровы бледно-розовые, чистые. В первые сутки жизни проведено исследование уровней интерлейкина (ИЛ-2) и интерлейкина 4 (ИЛ-4) в пуповинной крови. Уровень ИЛ-2 - 231 пг/мл, уровень ИЛ-4 - 194 пг/мл.

По нашим данным ребенок в течение первых трех месяцев не должен иметь проявлений цитомегаловирусной инфекции. При обследовании ребенка в возрасте первых трех месяцев не выявлено клинических симптомов манифестации цитомегаловирусной инфекции. Лабораторные методы исследования (ПЦР мочи и ИФА крови) также установили отсутствие цитомегаловирусной инфекции у ребенка.

Пример 3.

Ребенок Г-на, родилась 17.01.03 (история родов №225/30) у женщины 25 лет, беременность которой протекала на фоне хронического аднексита, эндоцервицита. Во время беременности у женщины отмечалось реактивация цитомегаловирусной инфекции в III триместре.

Роды II в срок. Ребенок родился в удовлетворительном состоянии массой 3850, длиной 52 см, с оценкой по шкале Апгар 8-9 баллов. Кожа бледно-розовая, чистая. В первые сутки жизни проведено исследование уровней интерлейкина-2 и интерлейкина-4 в пуповинной крови. Уровень ИЛ-2 - 283 пг/мл, уровень ИЛ-4 - 226 пг/мл. По нашим данным ребенок в течении первых трех месяцев жизни должен иметь проявления цитомегаловирусной инфекции.

При обследовании ребенка в возрасте 1,5 месяцев жизни выявлены клинические симптомы манифестации цитомегаловирусной инфекции. Лабораторные методы исследования (ПЦР мочи, ИФА крови), проведенные за этот период также подтвердили наличие цитомегаловирусной инфекции у данного ребенка.

Ранняя диагностика цитомегаловирусной инфекции по заявляемому способу проводилась у 32 новорожденных, матери которых были инфицированы цитомегаловирусом и имели хронические воспалительные гинекологические заболевания в виде хронического аденексита, эндометрита, кольпита. У всех детей в родильном доме имел место отрицательный результат обследования на цитомегаловирусную инфекцию методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

После выписки из роддома дети были разделены на 2 группы. В 1-й группе новорожденных (N=20), имевших в пуповинной крови значение ИЛ-2 232 пг/мл и выше и ИЛ-4 195 пг/мл и выше, имело место выявление ДНК-вируса цитомегалии в моче в возрасте 2-3 месяцев жизни в сочетании с клиническими проявлениями ЦМВИ, т.е. развилась впоследствии цитомегаловирусная инфекция, что показывает высокую прогностическую точность заявляемого способа. У детей с клинико-лабораторными проявлениями ЦМВИ отмечались конъюгационная желтуха (6 случаев), дисбактериоз кишечника (3 случая), гипоксическиишемическое поражение ЦНС (13 случаев), инфекция мочевыводящих путей (3 случая), лимфадений (2 случая) и их сочетания.

Во 2-й группе новорожденных (N=12) ИЛ-2 и ИЛ-4 имели значения ниже 232 пг/мл и 195 пг/мл соответственно, у этих детей в возрасте 2-3 месяцев жизни не определялся ДНК-вирус цитомегалии в моче и дети этой группы были клинически здоровыми.

Таким образом, используемые нами показатели позволяют проводить раннюю диагностику клинической манифестации цитомегаловирусной инфекции у новорожденных.

Предложенный нами способ достаточно прост, нетравматичен, так как используется пуповинная кровь, позволяет на доклинической стадии прогнозировать отсроченную манифестацию цитомегаловирусной инфекции и на основании полученных результатов осуществлять дифференцированное диспансерное наблюдение и своевременно начинать адекватное лечение при позднем развитии симптомов заболевания.

Заявляемый способ апробирован на достаточном клиническом материале и может широко использоваться в педиатрической практике.

Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии, и может быть использовано для диагностики цитомегаловирусной инфекции (ЦМВ) у детей первых трех месяцев жизни, рожденных от матерей, инфицированных ЦМВ. Сущность способа: в пуповинной крови новорожденных определяют содержание интерлейкина-2 (ИЛ-2) и интерлейкина-4 (ИЛ-4) методом ИФА. При содержании ИЛ-2 232 пг/мл и выше, а ИЛ-4 195 пг/мл и выше у детей прогнозируют клиническую манифестацию ЦМВ в первые три месяца жизни. Использование способа позволяет повысить точность ранней диагностики ЦМВ у новорожденных, родившихся от матерей, инфицированных ЦМВ, что позволяет своевременно проводить адекватное лечение при отсутствии симптомов развития заболевания.

Способ ранней диагностики цитомегаловирусной инфекции у новорожденных от матерей, инфицированных цитомегаловирусом, включающий исследование крови, отличающийся тем, что в пуповинной крови определяют содержание интерлейкина-2 (ИЛ-2) и интерлейкина-4 (ИЛ-4) методом ИФА, и при содержании ИЛ-2 232 пг/мл и выше, ИЛ-4 195 пг/мл и выше у детей прогнозируют клиническую манифестацию цитомегаловирусной инфекции в первые три месяца жизни.