Способ прогнозирования манифестной формы врожденной цитомегаловирусной инфекции с поражением ЦНС у новорожденного Российский патент 2025 года по МПК G01N33/50 C12Q1/686 C12Q1/70 

Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционным заболеваниям, и может быть использовано в клинической практике для прогнозирования развития манифестных форм врожденной цитомегаловирусной инфекции в антенатальный период.

Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) продолжает оставаться серьезной проблемой общественного здравоохранения, занимая второе место после гипоксии и асфиксии в структуре заболеваемости и смертности новорожденных. По данным литературы манифестные формы врожденной ЦМВИ характеризуется поражением центральной нервной системы (ЦНС), печени, костного мозга и желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). При поражении

ЦНС регистрируются менингоэнцефалит, микро- и гидроцефалия, вентрикуломегалия, корковая атрофия, кистозная трансформация, гипоплазия мозжечка, судорожный синдром. Нарушения слуха возникают у 22-70% детей и в большинстве случаев прогрессируют со временем. Среди новорожденных с манифестной формой уровень смертности достигает 30%.

Независимо от формы заболевания врожденная ЦМВИ имеет ряд последствий: у детей с клиническими проявлениями риск развития нарушения нервной системы, слуха, зрения и поражения других органов достигает до 90%, у бессимптомных -15%. Могут развиваться задержка психомоторного, умственного развития, нейросенсорная глухота или двустороннее снижение слуха, нарушение восприятия речи при сохранении слуха, нарушения зрения, микроцефалия, судороги, парезы/параличи, хориоретинит, фиброз печени и легких. Данные поражения увеличивают уровень детской инвалидности.

Проблема своевременного предотвращения реализации манифестных врожденной ЦМВИ в настоящее время остается одной из самых актуальных во всем мире. Для диагностики ЦМВИ в антенатальный период используют лабораторные исследования крови, мочи, слюны беременной для выявления вирусной ДНК вируса или маркеров иммунного ответа (специфические антитела, авидность), ультразвуковое исследование (УЗИ) плода, редко - магнитно-резонансную томографию (МРТ). Полученные результаты позволяют предположить течение инфекционного заболевания у матери и прогнозировать развитие врожденной инфекции у новорожденного.

В возникновении врожденной ЦМВИ решающую роль играют генетические свойства возбудителя. В последние десятилетия, с развитием методов полногеномного секвенирования все больший интерес вызывает изучение возможной зависимости проявлений инфекционного процесса от молекулярно-генетических характеристик микроорганизмов.

Известен способ прогнозирования риска внутриутробного инфицирования новорожденного [RU 2518541 C1]. Сущность изобретения заключается в определении показателей, характеризующих течение беременности (обострение воспалительных заболеваний мочевыделительной системы, ЛОР-органов, бронхолегочной системы, желудочно-кишечного тракта, аднекситы, эндометриты, сальпингиты, вагиниты, перенесенные инфекции, передаваемые половым путем, острые респираторные вирусные инфекции, токсоплазмоз, краснуха, ЦМВИ, герпесвирусная инфекция, хламидиоз микоплазмоз, данные УЗ-исследования - маловодие, многоводие, гемодинамические нарушения, преждевременное старение плаценты, задержка внутриутробного развития плода) и присваивании им баллов. Полученные баллы суммируют, определяя значение индекса риска внутриутробного инфицирования новорожденного (ИРВИ). В зависимости от значения ИРВИ определяют низкую степень риска, среднюю степень, высокую степень риска внутриутробного инфицирования новорожденного. Однако приведенный способ имеет ряд недостатков. Способ сложен из-за объема необходимой информации. Указанные осложнения беременности встречаются у 70-80% беременных и имеют второстепенное или косвенное значение в прогнозе внутриутробного инфицирования ЦМВ новорожденных. Данные УЗИ обладают низкой специфичностью и могут регистрироваться при других осложнениях беременности и заболеваниях плода. К тому же, использование метода осуществляется в раннем неонатальном периоде, а не в антенатальном, что не позволяет своевременно проводить лечебные мероприятия у беременных женщин.

Известен способ прогнозирования развития врожденной ЦМВИ на основании данных возраста матери, наличия профессии с высоким риском заражения ЦМВ, установленной сероконверсии по IgG к ЦМВ и выявленных изменений развития плода по данным MPT [Hadar, Eran et al. "Antenatal risk factors for symptomatic congenital CMV disease following primary maternal CMV infection." Journal of perinatal medicine vol. 44,3 (2016): 339-44. doi:10.1515/jpm-2014-0322]. Авторами проведен ретроспективный анализ течения антенатального периода у 155 новорожденных с врожденной ЦМВИ, возникшей в результате острой ЦМВИ у матери. С помощью многофакторного логистического регрессионного анализа была создана модель, которая могла бы прогнозировать развитие врожденной инфекции. Однако, в способе не учитываются особенности течения беременности и результаты ПЦР исследования, свидетельствующее о репликативной активности вируса с высоким риском внутриутробного инфицирования. Кроме того, МРТ является достаточно дорогостоящим методом обследования, что существенно затрудняет использование в рутинной практике.

Наиболее близким к предлагаемому способу прогнозирования является способ диагностики врожденного вирусного заболевания плода [RU №2728925 С1]. В крови беременных определяют величину специфических IgM и IgG антител, и при значении специфических IgM выше порога чувствительности реакции более чем в два раза количественно определяют вирусную нагрузку методом полимеразной цепной реакции. При ее значении более 10⁴ копий в мл сыворотки крови осуществляют УЗИ-мониторинг плода в режиме скрининга с интервалом 2 недели, и при выявлении визуализационных признаков поражения плода на сроке гестации 20 недель и более выполняют кордоцентез с последующим забором пуповинной крови для исследования методом ПЦР. При выявлении визуализационных признаков поражения плода, обнаружении IgM к вирусам в сочетании с положительными результатами ПЦР в крови беременной и пуповинной крови плода на сроке 20 недель и более диагностируют врожденное вирусное заболевание плода. Способ позволяет осуществлять пренатальную диагностику врожденное инфекционное заболевание (ВИЗ). Однако данный способ, несмотря на возможность пренатальной диагностики ВИЗ обладает рядом недостатков. Так, данный способ позволяет диагностировать ВИЗ вирусной этиологии в антенатальный период, однако не дает возможности уточнять форму заболевания у плода, от которой зависит исход заболевания, частота инвалидизации, прогноз для жизни и здоровья ребенка в будущем. К недостаткам описанного способа диагностики также относится его инвазивность, забор крови у плода возможно проводить только во время технически сложной операции кордоцентеза, для выполнения которой необходим специально обученный персонал, а также данная операция имеет риск развития ряда осложнений - кровотечение, гипоксия плода, досрочное родоразрешение и т.д. В данном способе предпринята попытка динамического наблюдения развития будущего ребенка по данным УЗИ скрининга, однако данная методика не обладает высокой степенью специфичности для ВИЗ. Таким образом, данный способ не обеспечивает точности прогноза развития манифестной формы врожденной ЦМВИ.

С целью устранения вышеуказанных недостатков авторы предлагают принципиально новый способ прогноза манифестной формы врожденной ЦМВИ в антенатальный период.

Технический результат, достигаемый в данном способе, заключается в повышении точности прогноза манифестной формы врожденной ЦМВИ в антенатальный период за счет учета генетических особенностей вируса. Этот результат достигается тем, что, проводят анализ течения беременности, выявление ДНК ЦМВ методом ПЦР в крови беременной и после получения положительного результата на ДНК ЦМВ в крови и слюне проводят генотипирование вариабельных генов ЦМВ и при выявлении gB7 или gH2 прогнозируют манифестную форму врожденной цитомегаловирусной инфекции.

Авторами было установлено, что среди беременных с клиническими симптомам ОРВИ и лабораторными признаками цитолиза на долю ЦМВИ приходится около 14,6%. Наиболее частыми проявлениями инфекции были утомляемость, слабость, субфебрильная лихорадка, головная боль, ринит, фарингит, кашель. Полученные данные указывают на необходимость исключения ЦМВИ при развитии респираторного заболевания во время беременности, особенно в тех случаях, когда исключена другая этиология.

После установления ЦМВИ у беременной на основании анализа течения беременности и получения положительного результата ДНК ЦМВ методом ПЦР в крови, слюне, авторами впервые использовали секвенирование участки генома ЦМВ, а при выявлении gB7 или gH2 участков прогнозируют манифестную форму врожденной ЦМВИ.

Впервые авторы с использованием технологии высокопроизводительного секвенирования исследовали вариабельные участки генома ЦМВ. Анализ результатов секвенирования генов позволил оценить распределение генотипов у детей с врожденной ЦМВИ и выявить связь между конкретным генотипом и развитием манифестных формах врожденной ЦМВИ.

Оценка результатов обследовании детей с врожденной ЦМВИ и статистической обработки данных исследования проводилась с использованием пакета прикладных программ Statistica 7.0. В случае нормального распределения выборки сравнительный анализ количественных данных в двух независимых группах проводился с помощью однофакторного дисперсионного анализа. При отсутствии нормального распределения выборки сравнительный анализ количественных признаков в трех независимых группах проводили с помощью критерия Краскела-Уоллиса. Сравнительный анализ качественных признаков в двух независимых группах проводили с помощью критерия хи-квадрат Пирсона. Различия считались статистически значимыми при р<0,05.

Авторы впервые установили, что при оценке результатов обследования детей с врожденной ЦМВИ, что с наибольшей частотой встречались gB7 (60,0%), gHl (50,0%), gH2 (50,0%i) генотипы ЦМВ. А при сопоставлении клинических проявлений врожденной ЦМВИ в зависимости от выявляемых генотипов, что при манифестных формах заболевания регистрировалось достоверное преобладание генотипов gB7 и gH2 (р=0,049 и р=0,027, соответственно) (см. таблица 1 и 2).

Авторами показано, что при обнаружении у беременной, то есть в антенатальный период, визуализационных (УЗИ) признаков патологии развития плода и выявлении ДНК ЦМВ в пуповинной крови методом ПЦР при выполнении кордоцентеза. В дальнейшем при проведении секвенирования участков генома ЦМВ регистрировались именно эти два генотипа gB7 и gH2.

Авторы доказали, что данное исследование может проводиться при уровне концентрации ДНК ЦМВ выше 10 нг/мкл, значение порогового цикла (Ct) менее 30). Средняя арифметическая величина (М) уровня Ct в слюне составила 11,81±4,70 (95%: 5,98 - 17,64), в крови - 25,42±6,76 (95% ДИ: 20,87 - 29,96). Следовательно, для успешного проведения генотипирования ЦМВ может использоваться слюна (р=0,001).

В доступной нам литературе подобных способов прогнозирования развития манифестных форм врожденной ЦМВИ не обнаружено, а совокупность предложенных клинико-анамнестических, лабораторных и генетических признаков, новизна и эффективность позволяют нам представить способ, как заявочный материал на изобретение.

Способ реализуется следующим образом при возникновении у беременной на любом сроке гестации неспецифических симптомов острой респираторной инфекции (слабость, повышенная утомляемость, головная боль, лихорадка, неярко выраженные катаральные явления) в сочетании с гематологическими (лимфоцитоз, моноцитоз, анемия, тромбоцитопения) и биохимическими (повышение активности АЛТ и/или ACT) изменениями необходимо исключение врожденной ЦМВИ в антенатальный период, для подтвеждения которого проводится обследование на ДНК ЦМВ методом ПЦР.

При положительном результате ПЦР на ДНК ЦМВ в крови с уровнем концентрации ДНК ЦМВ выше 10 нг/мкл следует проводить генетического исследование (секвенирование участков генома ЦМВ с применением набора VAHTS® Universal Plus DNA Library Prep Kit for Illumina V2.), в качестве биологического материала может быть использована не только кровь, но и слюна. При идентификации генотипа gB7 и/или gH2, свидетельствующего о высоком риске развития манифестной формы врожденной ЦМВИ В дальнейшем проводится консилиум для решения вопроса о необходимости назначения специфической противовирусной терапии.

Разработанный нами способ прогнозирования развития манифестных форм врожденной ЦМВИ был апробирован у 317 беременных, наблюдавшихся в различных родовспомогательных учреждениях Санкт-Петербурга и 50 новорожденных с врожденной ЦМВИ.

Высокая эффективность заявляемого способа прогнозирования манифестных форм врожденной цитомегаловирусной инфекции у новорожденного проиллюстрирована нижеследующими примерами.

Клинический пример 1

Беременная, 27 лет. На 14 неделе беременности отмечалось повышение температуры тела до 37,5-38,0°С, появилась слабость и утомляемость, дискомфорт в горле, периодически - затруднение носового дыхания со скудным отделяемым. Консультирована врачом-инфекционистом, в результате лабораторного обследования в крови методом ПЦР выявлена ДНК ЦМВ. Качественное определение ДНК ЦМВ в слюне и моче показало положительный результат. Диагностирована острая ЦМВИ. При проведении генотипирования идентифицирован генотип gB7. В 22 недели был выполнен амниоцентез и кордоцентез. В амниотической жидкости ДНК ЦМВ не обнаружена, при этом в пуповинной крови выявлены IgM (КП 5,6) и IgG к ЦМВ (КП 8,9). Таким образом было подтверждено антенатальное инфицирование плода. Учитывая развитие острой ЦМВИ в первом триместре беременности, антенатальное заражение плода, выявление генотипа gB7 с риском развития манифестной формы врожденной ЦМВИ, после получения письменного согласия беременной была начата терапия прямым противовирусным препаратом.

Ребенок (девочка) родился на 38 неделе, масса тела при рождении 2870 г., рост 47 см, окружность головы 34 см, окружность груди 33 см, оценка по шкале Апгар - 8/9 баллов. Состояние при рождении удовлетворительное, период адаптации без особенностей, клинических проявлений заболевания не выявлено. Качественная ПЦР крови и мочи на ЦМВ - положительно. Аудиоскрининг пройден. Осмотрена неврологом, офтальмологом, выполнена нейросонография: без патологии.

Клинический пример 2

Беременная Е. 32 года, отмечалось повышение температуры тела до 37,5-37,7С, беспокоил насморк и головная боль. В последующие дни температура тела нормализовалась. В крови методом ИФА выявлены иммуноглобулины класса М (IgM) 3,77 у.е./мл, ДНК ЦМВ методом ПЦР при отрицательных IgG CMV. При проведении генотипирования идентифицирован генотип gH2. Пациентке диагностирована острая ЦМВИ с высоким риском развития манифестной формы врожденной ЦМВИ, проведен консилиум в составе врачей-инфекционистов и акушер-гинекологов, принято решение о проведении терапии антицитомегаловирусным иммуноглобулином. Терапию беременная перенесла удовлетворительно, побочных явлений на введение препарата не зафиксировано.

Ребенок от 2 беременности, 2 срочных родов в 39 0/7 недель путем кесарева сечения. Масса тела при рождении 3000 г, рост 51 см. Оценка по шкале Апгар 8/8. Состояние ребенка удовлетворительное, период адаптации без особенностей. Аудиоскрининг пройден в родильном доме, выполнена нейросонография (без патологии), в результате осмотра врача-офтальмолога и невролога патологии не выявлено. В возрасте 12 суток жизни ребенок обследован на ЦМВИ: методом ИФА в крови выявлены IgM (КП 5,8) и IgG (КП 29,04) к ЦМВ, ДНК ЦМВ методом ПЦР обнаружена в крови (3,6 копий/мл), в слюне (140000 копий/мл) и в моче (152000 копий/мл). Повторно выполнены УЗИ головного мозга и ОБП, осмотр невролога и офтальмолога (без патологии). На основании анамнестических, лабораторных и инструментальных данных, принимая во внимание отсутствие специфических признаков поражения головного мозга, желудочно-кишечного тракта, почек, органов зрения и слуха, выставлен клинический диагноз: Врожденная цитомегаловирусная инфекция, субклиническая форма.

Клинический пример 3

Первородящая (25 лет) беременная П. Из анамнеза известно, что женщина работает в детском саду. На сроке 22-23 нед. перенесла острое респираторное заболевание с лихорадкой до 39°С, шейный лимфаденит, получала антибактериальную терапию амоксиклавом и симптоматическую. При УЗИ скрининге на 31 нед. выявлено ВПР ЦНС внутренняя гидроцефалия, признаки гипоплазии мозолистого тела, УЗ признаки нарушения кортикального развития головного мозга плода. Проведено вирусологическое обследование - обнаружены антитела IgG к ЦМВ, Ig М к ЦМВ отрицательные, выделена ДНК ЦМВ в сыворотке крови (10⁶ копий/мл), ДНК ЦМВ в слюне 10⁸ копий/мл, на 33 неделе проведено МРТ плода и выявлены деструктивные поражения полушарий головного мозга, ветрикуломегалия заместительного характера. Диагностирована острая ЦМВИ. При проведении генотипирования идентифицирован генотип gB7. Проведен неонатальный консилиум, матери рекомендовано прервать беременность, от операции она отказалась. На 40 нед родился мальчик в тяжелом сосоянии с весом 4090, ростом 55 см, в первые сутки переведен в ДГБ №1 С ДЗ: Врожденная цитомегаловирусная инфекция манифестная форма с поражением ЦНС и печени.

Данный способ прогноза врожденной ЦМВИ имеет большую клиническую значимость. Способ позволяет предотвращать рождение детей с тяжелыми органными нарушениями и снизить уровень младенческой смертности. Данный способ прогнозирования манифестных форм врожденной ЦМВИ является перспективным и необходимым для проведения своевременной терапии беременных с целью рождения ребенка без органной патологии.

Изобретение относится к медицине, а именно к инфектологии, и может быть использовано для прогнозирования манифестной формы врожденной цитомегаловирусной инфекции (ЦМВИ) с поражением ЦНС у новорожденного. При возникновении у беременной женщины на любом сроке гестации слабости, повышенной утомляемости, головной боли, лихорадки и катаральных проявлений проводят обследование на ДНК ЦМВ методом ПЦР. В случае положительного результата на ДНК ЦМВ проводят генотипирование вариабельных генов ЦМВ. При выявлении gB7 или gH2 прогнозируют манифестную форму врожденной ЦМВИ с поражением ЦНС у новорожденного. Способ обеспечивает повышение точности прогноза манифестной формы врожденной ЦМВИ с поражением ЦНС у новорожденного за счет идентификации генотипов gB7 или gH2 ЦМВ в крови и слюне беременной. 2 табл., 3 пр.

Способ прогнозирования манифестной формы врожденной цитомегаловирусной инфекции с поражением ЦНС у новорожденного, характеризующийся тем, что при возникновении у беременной женщины на любом сроке гестации неспецифических симптомов острой респираторной инфекции - слабость, повышенная утомляемость, головная боль, лихорадка, катаральные проявления - проводят обследование на ДНК ЦМВ методом ПЦР, в качестве биологического материала используют кровь и слюну беременной, в случае положительного результата на ДНК ЦМВ проводят генотипирование вариабельных генов ЦМВ и при выявлении gB7 или gH2 прогнозируют манифестную форму врожденной цитомегаловирусной инфекции с поражением ЦНС у новорожденного.