СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ГЕНЕРАЛИЗОВАННОЙ ФОРМЫ ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ У ДЕТЕЙ ПЕРВЫХ МЕСЯЦЕВ ЖИЗНИ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии, и найдет использование для прогнозирования развития генерализованной формы герпес-вирусной инфекции у детей первых месяцев жизни.

Герпес-вирусная инфекция продолжает оставаться одной из наиболее опасных инфекций у новорожденного ребенка. Наряду с бессимптомным, субклиническим, течением герпес-вирусной инфекции у детей отмечаются и тяжелые (генерализованные) формы заболевания. Диагностика возможности генерализации инфекции при инфицировании герпес-вирусами является необходимой для своевременного назначения иммунозаместительной терапии и в последнее десятилетие осуществляется следующими методами.

Известен (патент РФ№2121683, 1998.11.10) способ дифференциальной диагностики различных форм ДНК-х инфекций, отличающийся тем, что дополнительно определяют антитела подклассов IgG1 - G1IgG2 и IgG3 - IgG4, дифференцируют их по степени разрушения цистеином и сорбции на стафилококк и при наличии антител класса IgG1 диагностируют острую форму, при превалировании антител класса IgG3 - обострение хронической инфекции и при превалировании антител класса IgG4 - персистентно-хроническую форму.

У новорожденных с инфекционной патологией в 3-4 раза снижен уровень интерферона-γ (ИФН-γ) и отмечается тенденция к снижению интерферона-α (Сидоров И.С. и соавт. Состояние иммунной системы у беременных и новорожденных из группы высокого риска по внутриутробному инфицированию, Рос. Вестн. перинат. и педиатрии, 1999).

В случае генерализованной герпетической инфекции у детей первых месяцев жизни имеет место повышение уровней IgM, IgA в сыворотке крови (Н.А.Яценко. Клинико-иммунологические аспекты врожденной герпетической инфекции у детей первых месяцев жизни, 2000, дисс. канд. мед. наук).

При хроническом рецидивирующем генитальном герпесе у больных в возрасте от 21 до 50 лет в 100% случаев определяли снижение клеточного звена иммунитета: зрелых Т-лимфоцитов СД3+, снижение Т-хелперных клеток (СД4+), снижение количества Т-супрессоров (СД8+) при тяжелой форме генитального герпеса. Это служило дополнительным критерием для оценки тяжести заболевания и являлось основанием для назначения иммунокорригирующей терапии. При этом уровень СД3+ составил 57,44±2,58%, СД4+ 31,44±1,43%, СД8+ 21,94±1,46%. (М.В.Мокеева. Клинико-иммунологическое обоснование применения иммуномодуляторов в комплексной этапной терапии хронического рецидивирующего генитального герпеса, 2003, дисс. канд. мед. наук).

У больных с рецидивирующей герпес-вирусной инфекцией повышено содержание СД8+ лимфоцитов в группе больных с тяжелым течением инфекции и снижено содержание СД3+, СД4+ (А.Ю.Одокиенко. Основные закономерности иммунных нарушений у больных герпетической инфекцией и возможности иммунотропной фармакотерапии, Пермь, 2005).

У больных с генерализованной формой инфекции имеет место низкий уровень специфических противовирусных антител, что свидетельствует о необходимости использования других методов диагностики (Н.И.Кудашов. Особенности терапии герпетического поражения головного мозга у новорожденных, Русский медицинский журнал, М., 2005).

По данным Кулакова В.И. и соавт. (Содержание цитокинов в амниотической жидкости, пуповинной и сыворотке крови женщин с внутриутробной инфекцией. Акушерство и гинекология, 2005) выявлено достоверное увеличение коэффициента ИЛ-1/ИЛ-10 при реализации у новорожденного внутриутробной инфекции во всех исследуемых биологических жидкостях.

У новорожденных с признаками внутриутробной инфекции наблюдается низкое содержание Т-хелперов, Т-супрессоров и интерферона-γ (О.В.Макаров и соавт. Современные представления о диагностике внутриутробной инфекции, Москва, 2006).

Прототипом изобретения избран способ диагностики тяжелой рецидивирующей герпетической инфекции, представленный в автореферате канд. диссертации А.Ю.Одокиенко. Основные закономерности иммунных нарушений у больных герпетической инфекцией и возможности иммунотропной фармакотерапии, Пермь, 2005. Сущность способа, избранного в качестве прототипа состоит в том, что при тяжелой рецидивирующей герпетической инфекции обнаруживается сниженный уровень индуцированного интерферона-γ при нормальной продукции спонтанного и повышенный уровень интерлейкина 4.

Способ, избранный в качестве прототипа, обладает рядом несовершенств.

1. Предполагает использование у взрослых в возрасте от 27 до 32 лет и не апробирован у детей первых месяцев жизни.

2. Изменения уровней интерлейкина 4 и интерферона γ характеризуют развитие раннего индуцибельного ответа на внедрение вируса при герпетической инфекции и не отражает особенностей специфического иммунного ответа, развивающегося при срыве защитных реакций и реализации тяжелых заболеваний.

3. Метод не используется у больных с цитомегаловирусной инфекцией.

4. Результаты исследований уровня интерферона γ противоречивы. Так, по данным А.А.Закиной (Патогенетические аспекты перинатальной герпес-вирусной инфекции у детей, 2006, автореф. канд. дисс.) концентрация интерферона-γ у детей при обострении герпес-вирусной инфекции не отличалась от нормы.

Указанные недостатки устраняются в данном заявляемом способе.

Задача изобретения: повышение точности прогнозирования генерализованной формы герпес-вирусной инфекции у детей первых месяцев жизни, инфицированных герпес-вирусами, для назначения адекватной терапии.

Поставленная задача решается тем, что детям, инфицированным герпес-вирусами, проводят (после установления инфицирования) определение в сыворотке периферической крови субпопуляций В-лимфоцитов с рецепторами СД20+ СД40 и при выявлении уровня субпопуляций лимфоцитов с рецепторами СД20+ СД40 выше 14,8% прогнозируют развитие генерализованной формы герпес-вирусной инфекции.

Данный способ позволяет диагностировать развитие генерализованной формы герпес-вирусной инфекции и своевременно назначать иммунозаместительную терапию. В работе А.А.Ярилина (Межклеточная кооперация при иммунном ответе. Выбор клеткой форм ответа. Иммунология, №1, 1999) указано, что через В-лимфоциты с рецептором СД40 подается сигнал к дифференцировке В-клеток и обеспечивается осуществление всех основных взаимодействий, определяющих участие В-лимфоцитов в гуморальном иммунном ответе. Вследствие отсутствия сигнала, поступающего в В-лимфоциты через молекулу СД40, нарушается процесс образования полноценных антител к патогенам. Сигнал, передаваемый в В-лимфоциты через молекулу СД40 обусловливает основные события Т-В взаимодействия, обеспечивает включение в В-лимфоцитах событий первостепенной важности: переключение классов иммуноглобулинов, дифференцировку при гуморальном ответе. Этот сигнал важен для защиты В-лимфоцитов от апоптоза. Однако в литературе не встречается примеров использования этих методов при диагностике генерализованной формы герпес-вирусной инфекции у детей первых месяцев.

В связи с тем, что в ранней диагностике генерализованной формы герпес-вирусной инфекции велика роль иммунной системы, нами был исследован уровень субпопуляции В-лимфоцитов в сыворотке крови с рецепторами СД40+ как маркера, обеспечивающего способность В-лимфоцитов к переключению классов иммуноглобулинов.

Все вышеуказанное явилось основанием использования определения повышения субпопуляций В-лимфоцитов с рецепторами СД20+ СД40 в сыворотке крови у детей первых месяцев жизни, инфицированных герпес-вирусами, для прогноза развития генерализованной формы герпес-вирусной инфекции. Технический результат, получаемый в результате реализации предлагаемого способа, состоит в прогнозировании генерализованных форм герпес-вирусной инфекции у детей первых месяцев жизни. Способ позволяет своевременно назначать адекватные лечебные мероприятия, направленные на предупреждение генерализации герпес-вирусной инфекции, обладает высокой точностью, достаточно прост.

Выполнение способа и его эффективность описаны в следующих примерах.

Пример 1.

Ребенок Ш-ий, родился 19.09.2006 (история болезни №7187) у женщины, страдающей вегетососудистой дистонией по кардиальноому типу. Беременность протекала на фоне кольпита. Во время беременности у женщины отмечалась острая респираторно-вирусная инфекция, угроза прерывания. Роды вторые, в сроке 32 недели беременности, длительный безводный период. Ребенок родился в тяжелом состоянии, вялый, отмечалась судорожная готовность. При проведении ДНК-диагностики мочи на первые сутки жизни выделена ДНК цитомегаловируса. Методом иммуноферментного анализа определялся повышенный уровень IgG к цитомегаловирусу, в то время как антитела IgM к цитомегаловирусу не определялись.

Проведено исследование субпопуляций В-лимфоцитов СД20+ СД40 в сыворотке крови. Для этого производился забор 2,0 мл крови из периферической вены. После выделения лейкоцитарного пула крови в фиколверографиновом градиенте оценивали фенотипическую характеристику В-лимфоцитов методом проточной цитофлуориметрии с использованием моноклональных антител (фирмы CALTAG) (проточный цитофлуориметр аппарат COULTEN EpicsXL). Применяли антитела СД20+ (типирование суммарной популяции В-лимфоцитов) и маркер СД20+ СД40.

Уровень субпопуляций В-лимфоцитов с рецепторами СД20+ СД40 составил 18,2%, то есть по нашим данным ребенок угрожаем по развитию генерализованной формы герпес-вирусной инфекции.

Состояние ребенка в роддоме было тяжелым и характеризовалось бледностью кожи, ослабленным дыханием в легких, гепатомегалией. Ребенок был переведен на искусственную вентиляцию легких. У ребенка отмечался тремор конечностей, отсутствие фиксации взгляда, мышечная гипотония. При осмотре окулиста выявлено сужение сосудов на глазном дне.

По данным УЗИ сердца, проведенного на 3 сутки жизни, диагностирована постгипоксическая кардиопатия.

В общем анализе крови определялся лейкоцитоз, лимфоцитоз, моноцитоз, в иммунограмме имело место повышение иммуноглобулинов класса А. Заболевание протекало в тяжелой форме.

На основании клинических симптомов, данных ДНК-диагностики мочи, свидетельствующих об обнаружении ДНК цитомегаловируса, ребенку был выставлен диагноз: цитомегаловирусная инфекция, генерализовання форма, двусторонняя пневмония, гнойный трахеобронхит, церебральная ишемия III степени, синдром угнетения, анемия. Ребенок с низкой массой тела при сроке гестации 32 недели.

Назначена антибактериальная, иммунозаместительная, противовирусная терапия, интерферонотерапия. Ребенок находился в стационаре в течение 34 дней, выписан домой с улучшением на амбулаторное лечение.

Пример 2.

Ребенок Ш-ко, родился 14.10.2006 (история родов №7466) у женщины с отягощенным акушерско-гинекологически анамнезом (две неразвивающиеся беременности). Данная беременность протекала с угрозой прерывания, с нарушением маточно-плацентарной гемодинамики в сроке 21, 30, 34 недели.

Роды вторые, в сроке 34 недели. Масса тела ребенка при рождении 2450, длина - 48 см. Оценка по шкале Апгар 7-8 баллов. Состояние ребенка при рождении средней тяжести. Отмечались петехиальные кровоизлияния в кожу лица, иктеричность кожи. В легких ослабленное дыхание. Со стороны центральной нервной системы отмечалась гипотония мышц, угнетение рефлексов новорожденного. В первые сутки жизни ребенку была проведена ПЦР-диагностика мочи на герпес-вирусы и выделены вирусы герпеса и цитомегалии. Методом иммуноферментного анализа определялся повышенный уровень IgG к цитомегаловирусу, в то время как антитела IgM к цитомегаловирусу не определялись.

При исследовании субпопуляций В-лимфоцитов с рецепторами СД20+ СД40, уровень составил 14,9%. По нашим данным у ребенка должна развиться генерализованная форма герпес-вирусной инфекции.

На 8 сутки жизни состояние ребенка ухудшилось. Нарастала иктеричность кожи, отмечалось ослабленное дыхание в легких. В общем анализе крови отмечался лейкоцитоз, лимфоцитоз, моноцитоз, в иммунограмме - повышение иммуноглобулинов класса А. При биохимическом исследовании крови определялся повышенный уровень билирубина за счет непрямой фракции. При УЗИ печени выявлены умеренные изменения паренхимы печени. При осмотре окулиста отмечалось сужение сосудов на глазном дне, петехиальные кровоизлияния в нижнем отделе сетчатки правого глаза.

На нейросонограмме выявлено эхопозитивное образование размерами 1,7-1,4 мм в области хвостатого ядра. При проведении ЭКГ диагностирована гипертрофия миокарда правых отделов сердца. Ребенку был выставлен диагноз: внутриутробная генерализованная инфекция (герпетическая, цитомегаловирусная): перинатальное поражение ЦНС, синдром угнетения, синдром дыхательных расстройств, ателектазы легких; ребенок с низкой массой тела при рождении при сроке гестации 34 недели, дисбактериоз кишечника.

Назначена антибактериальная, иммунозаместительная, противовирусная терапия, интерферонотерапия.

Ребенок находился в стационаре в течение 25 дней, выписан домой с улучшением на амбулаторное лечение.

Пример 3.

Ребенок С-ин, родился 21.04.2006 (история болезни №2157). Ребенок родился от первой беременности, протекавшей с угрозой прерывания, гестозом в первом триместре, первых родов в срок, с массой при рождении 3400, длиной 52 см. На первые сутки жизни ребенку была проведена ПЦР-диагностика мочи и выделена ДНК цитомегаловируса. Методом иммуноферментного анализа определялся повышенный уровень IgG к цитомегаловирусу, в то время как антитела IgM к цитомегаловирусу не определялись.

На 6 сутки ребенку проведено исследование субпопуляций В-лимфоцитов с рецепторами СД20+ СД40. Уровень субпопуляции В-лимфоцитов с рецепторами СД20+ СД40 составил 14,8%. По нашим данным у ребенка не должна развиться генерализованная герпес-вирусная инфекция. При наблюдении за ребенком в течение двух месяцев симптомов генерализованной герпес-вирусной инфекции не отмечалось.

Таким образом, нами было обследовано 37 детей, которые были разделены на две группы:

I группа (18 человек) - дети первых месяцев жизни, матери которых имели хронические воспалительные гинекологические заболевания в виде хронического аднексита, кольпита, неблагоприятно протекающую беременность (угроза прерывания, ОРВИ во время беременности, фетоплацентарную недостаточность). Методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) определяли инфицирование герпес-вирусами детей, родившихся у этих матерей. Материалом исследования служила моча. Установлено, что фрагмент генома указанных возбудителей определялся у всех обследованных детей. По уровню субпопуляции В-лимфоцитов СД20+ СД40 в сыворотке крови было возможно прогнозировать развитие генерализованных форм герпес-вирусной инфекции. У всех детей, имевших значение СД20+ СД40 выше 14,8%, в последующем на первых месяцах жизни, развилась генерализованная форма герпес-вирусной инфекции, проявляющаяся симптомами интоксикации, желтухой, дисбактериозом кишечника, пневмонией, гипотрофией, анемией, поражением ЦНС.

II группа (19 человек) - дети, инфицированные герпес-вирусами, имевшие значение СД20+ СД40 14,8% и ниже, у которых не было проявлений генерализованной герпес-вирусной инфекции в первые месяцы жизни.

Таким образом, используемый нами показатель дает возможность прогноза генерализации инфекции у новорожденных, инфицированных герпес-вирусами.

Предложенный нами способ достаточно прост, позволяет прогнозировать развитие генерализованных форм герпес-вирусной инфекции и, на основании этого, своевременно назначать иммунозаместительную, противовирусную и интерферонотерапию.

Апробирован в отделении патологии новорожденных, детском реабилитационном отделении РНИИАП.

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано для прогнозирования генерализованной формы герпес-вирусной инфекции у детей первых месяцев жизни, инфицированных герпес-вирусами, для назначения адекватной терапии. Сущность способа: в сыворотке периферической крови определяют уровень субпопуляции В-лимфоцитов с рецепторами СД20+ СД40 и при выявлении повышения субпопуляции В-лимфоцитов с рецепторами СД20+ СД40 выше 14,8% прогнозируют развитие генерализованной формы герпес-вирусной инфекции у детей первых месяцев жизни, инфицированных герпес-вирусами.

Способ прогнозирования генерализованной формы герпес-вирусной инфекции у детей первых месяцев жизни, инфицированных герпес-вирусами, путем исследования крови, отличающийся тем, что в сыворотке периферической крови определяют уровень субпопуляции В-лимфоцитов с рецепторами СД20+ СД40 и при выявлении повышения субпопуляции В-лимфоцитов с рецепторами СД20+ СД40 выше 14,8% прогнозируют развитие генерализованной формы герпес-вирусной инфекции у детей первых месяцев жизни.