Питательная среда для культивирования бактерий родов Paenibacillus и Bacillus Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение может использоваться в области микробиологии и биотехнологии для наращивания биомассы микроорганизмов - антагонистов фитопатогенных грибов рода Fusarium с возможностью дальнейшего использования бесклеточных суспензий для создания биопрепаратов для борьбы с фузариозом сельскохозяйственных растений.

Грибы рода Fusarium, вызывающие фузариозы у сельскохозяйственных культур снижают урожайность и приводят к гибели растений, что негативно сказывается на всей отрасли АПК [1]. Разработка препаратов на основе бактерий - естественных антагонистов грибов является наиболее безопасным и эффективным методом борьбы. Препараты на основе бактерий родов Bacillus и Paenibacillus рассматриваются как альтернатива применению искусственно синтезированных фунгицидов, нарушающих природных баланс экосистем и приводящих к развитию резистентности у патогенов [2,3].

Разработка оптимального состава питательных сред для культивирования микроорганизмов с последующим получением целевых метаболитов, использующихся в биотехнологических процессах, является актуальной задачей при создании биопрепаратов на основе бактерий [4].

Для быстрого наращивания биомассы микроорганизмов необходима питательная среда, содержащая все необходимые компоненты для их роста и развития. В основном известны питательные среды для культивирования бактерий рода Bacillus. Например, питательная среда для культивирования бактерий Bacillus subtilis содержащая пептон ферментативный, дрожжевой экстракт, натрий хлористый, 40%-ный спиртовой экстракт кровохлебки лекарственной (Sanguisorba officinalis L.) и дистиллированную воду [5].

Однако кровохлебка лекарственная в ряде регионов РФ занесена в красную книгу, что затрудняет получение подобного экстракта.

Известна питательная среда для культивирования бактерии Paenibacillus alvei [6], содержащая гидролизат казеина, полученный путем разбавления дистиллированной водой до содержания аминного азота 140-150 мг%, кипячения при перемешивании 5 минут; добавления 5% NaOH и доведения рН 7,8-8,0; добавления агара "Дифко" - 15 г/л или агар-агара (одесского) - 20 г/л; смесь кипятят при перемешивании 5 минут; доводят рН 7,2-7,4 20% HCl; среду фильтруют и стерилизуют при 121°С 20 минут.

Поскольку данная среда является агаризованной, то она не удобна для последующего получения бесклеточной культуральной жидкости, а также бактериальная биомасса достигает лимита по концентрации клеток гораздо быстрее, чем в жидкой фазе, что лимитировано количеством доступных для всех клеток питательных компонентов

Известен ряд сред, предложенных для культивирования Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11443 [7]:

1. Состав среды NBY, мас.%: Nutrient broth "Difco" (питательный бульон) - 0,8; Yeast extract "Difco" (дрожжевой экстракт) - 0,3; вода - остальное. pH 6,8-7,2

2. Состав среды ДПС, мас.%: Гидролизные дрожжи - 3,0; кукурузная мука - 1,5; вода - остальное. pH 6,8-7,2

3. Состав среды YM, мас.%: гидролизные дрожжи - 4,5; вода - остальное. pH 6,8-7,2

Однако данные среды являются селективными, что затрудняет дальнейшее получение метаболитов от нескольких штаммов, и их смешивание для получения широкого спектра композиций.

Ближайшим решением к заявленному является жидкая среда, раскрытая в патенте на изобретение «Способ приготовления жидкой питательной среды и способ получения жидкого микробиологического препарата на основе смеси штаммов спорообразующих бактерий-антагонистов фитопатогенных грибов р. Fusarium» [8]. Однако заявленное изобретение является развитием предыдущей группы изобретений, созданной на основе результатов исследований тех же авторов, и отличается составом и способом приготовления питательной среды.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническим результатом, достигаемым использованием заявляемой питательной среды является получение биомассы бактерий родов Bacillus и Paenibacillus, для дальнейшего получения клеточного фунгицидного препарата и последующего изготовления биопрепарата на основе бесклеточной культуральной жидкости, содержащий метаболиты бактерий, обладающих противогрибковой активностью.

Указанный технический результат достигается тем, что питательная среда для культивирования бактерий родов Bacillus и Paenibacillus содержит полный набор солей и аминокислот, необходимый для полноценного роста и развития микроорганизмов.

Согласно изобретению питательная среда содержит, г/л:

глюкоза – 20;

глутаминовая кислота – 5;

дрожжевой экстракт - 1;

KH2PO4 – 1;

MgSO4 * 7H2O - 0,5;

KCl - 0,5;

MnSO4 - 0,005;

CuSO4 * 5H2O - 0,00016;

Fe2(SO4)3 * 7H2O - 0,00015;

фенилаланин - 0,002;

триптофан - 0,016.

Глюкоза и дрожжевой экстракт являются основными источниками углерода. Аминокислоты, входящие в состав среды служат основным материалом для синтеза белков, и поскольку глутамин главный источник энергии, необходимой для внутриклеточного обмена веществ, в среде увеличена концентрация глутаминовой кислоты. Неорганические соли - это источник металлов, участвующих в различных процессах метаболизма, а также способствуют поддержанию нормальной работы транспортной системы клетки.

ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ

Для апробации заявленной питательной среды использовали штаммы бактерий, обладающих фунгицидной активностью, представленные в таблице 1.

Таблица 1. Штаммы бактерий, используемых для получения бесклеточной культуральной жидкости и их целевые метаболиты.

Штамм Целевые метаболиты Paenibacillus jamilae P4 Сурфактин, микосубтилин, фенгицин Paenibacillus peoriae P27 Сурфактин, микосубтилин, фенгицин Paenibacillus peoriae P11 Сурфактин, микосубтилин, фенгицина Paenibacillus peoriae P13 Сурфактин, микосубтилин, фенгицина Paenibacillus polymyxa P31 Сурфактин, микосубтилин, фенгицина Bacillus amyloliquefaciens AB1 Макролактин, бациллотетрин, сурфактин, фенгицин Bacillus amyloliquefaciens AB2 Макролактин, бациллотетрин, сурфактин, фенгицин Bacillus subtilis SB3 Макролактин, бациллотетрин, сурфактин, фенгицин

Штаммы бактерий были пересеяны перед началом эксперимента за 6 часов для получения активно-растущей бесспоровой культуры.

После чего культуральную массу бактерий вносили в жидкую среду для наработки инокулятов, следующего состава: 10г/л пептона, 10 г/л хлорида натрия, 5г/л дрожжевого экстракта, 5г/л глюкозы и 8,5 г/л MaltExtract Broth (Merck). Культивацию бактерий в данной среде проводили в течение 18-24 часов в шейкере инкубаторе при 180rpm и 30°C.

Полученный инокулят вносили в количестве 5% от объема в питательную среду следующего состава: 20 г/л глюкозы, 5 г/л глутаминовой кислоты, 1 г/л дрожжевого экстракта, MgSO4 * 7H2O 0,5 г/л, KCl 0,5 г/л, MnSO4 0,005 г/л, CuSO4 * 5H2O 0,00016 г/л, Fe2(SO4)3 * 7H2O 0,00015 г/л, KH2PO4 1 г/л, фенилаланина 0,002 г/л, триптофана 0,016 г/л. Культивацию бактерий для наработки целевых метаболитов проводили в течение 3 суток в шейкере инкубаторе при 180rpm и 30°C.

По истечению 72 часов получали бесклеточную культуральную жидкость с помощью центрифугирования при 6000g в течение 30 минут. Бесклеточную культуральную жидкость фильтровали с помощью систем ультрафильтрации Stericup (Millipore). Небольшой объем стерильной культуральной жидкости отставляли для последующих луночных тестов для определения подавления роста грибов. В оставшемся объеме культуральной жидкости доводили pH до 2.0 до выпадения осадка пептидов. Культуральные жидкости оставляли на ночную преципитацию в холодильнике.

Полученную смесь метаболитов тестировали на фунгицидную активность в сравнении с бактериями, выращенными в аналогичных условиях на стандартной среде Landy (среда 1), которая по составу и концентрации солей, приближена к заявленной среде (среда 3) и среды на основе свекловичной мелассы (среда 2). Эффективность противогрибковой активности фракций оценивалась луночным методом. Для данного теста на чашку Петри со средой Сабуро был посеян фузариум крючком. Затем в толще агара вырезали лунки с помощью стерильного наконечника на 1 мл. В получившиеся лунки вносили 100 мкл фракций каждого штамма. Результаты теста представлены в таблице 2.

Таблица 2. Результаты луночного тестирования фракций метаболитов

Зона подавления роста (мм) Штамм Среда 1 Среда 2 Среда 3 Paenibacillus jamilae P4 4 5 7 Paenibacillus peoriae P27 2 4 5 Paenibacillus peoriae P11 3 4 6 Paenibacillus peoriae P13 4 6 8 Paenibacillus polymyxa P31 6 7 11 Bacillus amyloliquefaciens AB1 5 8 10 Bacillus amyloliquefaciens AB2 3 6 7

Таким образом, заявленная среда наиболее эффективна для выращивания бактерий рода Bacillus и Paenibacillus с целью получения фунгицидных метаболитов.

Полученную смесь пептидов также подвергали масс-спектрометрическому анализу на приборе MALDI-TOF (Bruker Daltonics) с использованием HCAA (α-циано-4-гидроксикоричная кислота) в качестве матрицы.

В ходе МС-анализа полученных метаболитов были получены спектры ионизации целевых метаболитов, что является доказательством накопления значительной клеточной массы бактерий на предложенной питательной среде.

MС анализ метаболитов штаммов представлен на фиг. 1-7.

Литература

1. Монастырский О.А. Современное состояние и проблемы исследования токсиногенных грибов, поражающих злаковые культуры //Актуальные вопросы биологизации защиты растений. - Пущино. - 2000. - С. 79-89.

2. Авдеева Л. В. и др. Антагонистическая активность штаммов Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum IМВ В-7404 и БИМ В-439Д по отношению к фитопатогенным бактериям и микромицетам //Мікробіологічний журнал. - 2014. - №. 76,№ 6. - С. 27-33.

3. Beatty P. H., Jensen S. E. Paenibacillus polymyxa produces fusaricidin-type antifungal antibiotics active against Leptosphaeria maculans, the causative agent of blackleg disease of canola //Canadian Journal of Microbiology. - 2002. - Т. 48. - №. 2. - С. 159-169.

4. Jayme D. W. Nutrient optimization for high density biological production applications //Cytotechnology. - 1991. - Т. 5. - С. 15-30.

5. Патент РФ на изобретение № 2668178 Питательная среда для культивирования Bacillus subtilis /Рыженков Н.С., Яценко Е.С., Микушина И. В., Ширманов М.В., Евдокимов И.Ю. - опубл. 26.09.2018 Бюл. № 27

6. Патент РФ на изобретение № 2303059 Питательная среда для культивирования и сохранения возбудителей гнильцовых болезней пчел /Леонтьева И.А., Гробов О.Ф. - опубл. 20.07.2007 Бюл. № 20

7. Патент РФ на изобретение № 2701500 Штамм спорообразующих бактерий Bacillus amyloliquefaciens, обладающий фунгицидным действием против фитопатогенных грибов, вызывающих заболевания овощных растений, биологический препарат на его основе /Кузнецова Н.И., Азизбекян Р.Р., Кузин А.И., Николаенко М.А., Сунь Ч., Лю Ц., Сюн Р., Цзо Ц. - опубл. 26.09.2019 Бюл. № 27

8. Патент РФ на изобретение № 2751487 Способ приготовления жидкой питательной среды и способ получения жидкого микробиологического препарата на основе смеси штаммов спорообразующих бактерий-антагонистов фитопатогенных грибов р. Fusarium /Чистяков В.А., Горовцов А.В., Усатов А.В., Празднова Е.В., Мазанко М.С., Брень А.Б., Усатова О.А., Васильченко Н.Г. - опубл. 14.07.2021 Бюл. № 20.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой питательную среду, содержащую 20 г/л глюкозы, 5 г/л глутаминовой кислоты, 1 г/л дрожжевого экстракта, MgSO₄⋅7H₂O 0,5 г/л, KCl 0,5 г/л, MnSO₄ 0,005 г/л, CuSO₄⋅5H₂O 0,00016 г/л, Fe₂(SO₄)₃⋅7H₂O 0,00015 г/л, KH₂PO₄ 1 г/л, фенилаланина 0,002 г/л, триптофана 0,016 г/л. Изобретение позволяет получить биомассу бактерий родов Bacillus и Paenibacillus. 7 ил., 2 табл.

Питательная среда для культивирования бактерий pодов Paenibacillus и Bacillus, содержащая 20 г/л глюкозы, 5 г/л глутаминовой кислоты, 1 г/л дрожжевого экстракта, MgSO₄⋅7H₂O 0,5 г/л, KCl 0,5 г/л, MnSO₄ 0,005 г/л, CuSO₄⋅5H₂O 0,00016 г/л, Fe₂(SO₄)₃⋅7H₂O 0,00015 г/л, KH₂PO₄ 1 г/л, фенилаланина 0,002 г/л, триптофана 0,016 г/л.