Биопрепарат для защиты сельскохозяйственных и декоративных растений от листогрызущих насекомых и способ получения этого биопрепарата Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 A01N63/00 

Группа изобретений относится к сельскохозяйственной микробиологии и касается получения биопрепарата для защиты сельскохозяйственных и декоративных растений от листогрызущих насекомых на основе нового штамма энтомопатогенных бактерий Bacillus thuringiensis.

Одним из эффективных штаммов, являющихся основой энтомопатогенного биопрепарата является штамм Bacillus thuringiensis subsp. thurmgiensis 98 (BtH1 98), выделенный из погибшей куколки капустной совки, и хранящийся в коллекции «ВНИИгенетика» под № ЦМПЛ В-2452. На его основе получают биопрепарат Битоксибациллин. Штамм BtH1 98 культивируют на питательной среде, содержащей фосфорнокислый аммоний, сернокислый магний, хлористый кальций, крахмал кукурузный и кормовые дрожжи, зеленую патоку, при аэрации в течение 48 ч, титр спор в культуральной жидкости 3,5-3,75 млрд/мл, содержание экзотоксина 0,5 мг/мл. В полученную культуральную жидкость вносят 1% натрия хлористого и высушивают. Получают Битоксибациллин, в котором содержится спор 65-72 млрд/г и 1% экзотоксина (А.с. 1074138 (1982). Штамм Bacillus thuringiensis subps. thuringiensis 98 - продуцент битоксибациллина).

Недостатком штамма Bacillus thuringiensis subsp.thuringiensis 98 (BtH1 98) является то, что он быстро теряет энтомоцидную активность при хранении. Битоксибациллин на основе штамма BtH1 98 получают в сухой форме, в связи с чем его производство является энергоемким и затратным из-за проведения операции сушки. Кроме того, высокие температуры при сушке оказывают губительное влияние на кристаллы эндотоксина, разрушая их, что приводит к снижению энтомоцидной активности Битоксибациллина

Известен энтомопатогенный штамм Bacillus thuringiensis subsp. thurmgiensis 800, выделенный из гусениц кольчатого шелкопряда в Крыму и также использующийся в качестве агента для получения биопрепарата Битоксибациллин (А.с. SU 1791973 А1; МПК A01N 63/00, C12N 1/20; 01.10.1992). Недостатками данного штамма при культивировании является необходимость отдельно стерилизовать некоторые компоненты питательной среды (зеленая патока) и вводить их в ферментер перед засевом инокулюма, что ведет к затрате дополнительной электроэнергии и увеличению числа технологических операций.

Известен штамм Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 800/15, продуцент биопреперата Битоксин (патент RU 2514211 С1; МПК C12N 1/20, A01N 63/00; опубл. 27.04.2014, бюл. №12). Культурально-морфологические признаки штамма следующие. Грампозитивные подвижные палочки, перетрихи, вегетативные клетки одиночные или в виде коротких цепочек по 2-4 клетки в цепочке. Размеры клеток суточной культуры на рыбном агаре от 0,8-0,9 до 2,3-3,0 мкм на 3-4 сутки роста на рыбном агаре в клетках образуются споры бобовидной формы, расположенные субтерминально размером от 0,8-0,9 до 1,1-1,3 мкм и паросгюральные включения экзотоксина белкового кристалла - ромбовидной формы. На рыбном агаре через 48 часов роста при 24-28°С культура образует плоские колонии серовато-белого цвета округлой формы с неровным краем, поверхность мелкозернистая, диаметр колоний 22-24 мм. Штамм растет при температуре 20-34°С, оптимум роста при 26-32°С. И при рН 7,0-8,8 (оптимум 7,2-7,6). Биохимические свойтсва штамма ближайшего аналога следующие. Факультативный анаэроб, желатину разжижает на 5 сутки. Казеин разлагает, молоко иептонизирует через 24-28 часов. На среде Кларка образует ацетилметилкарбинол. Гидролизует крахмал, использует цитраты.

На средах, содержащих желток образует лецитиназу, пигмент и уреазу не образовывают. Индол и сероводород не используют. Отношение к источнику углерода выражено в активном усвоении сахарозы, глюкозы, маннозы, левулезы, мальтозы, целлобиозы, салицина. Отношение к источнику азота выражено в активном росте на средах с аммонийными солями, на рыбном агаре. Антигенные свойства: дает позитивную реакцию жгутикового антигена с типовой сывороткой Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis H-1 в разведении 1:6400. Штамм продуцирует энтомоцидный экзотоксин, который выделяется из клеток в процессе лизиса их оболочек, и экзотоксин, который выделяется в период вегетационного роста культуры.

Недостатки, препятствующие использованию Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 800/15 как эффективного штамма для создания на его основе биопрепарата: культивирование на сложных органоминеральных средах, штамм не продуцирует агрономически значимое количество стимулирующих рост растений веществ.

В основу предложенного изобретения поставлена задача получения эффективного штамма энтомопатогенных бактерий группы Bacillus thurmgiensis и создания на его основе биопрепарата для защиты сельскохозяйственных и декоративных растений от листогрызущих насекомых.

Поставленная задача решена в ФГБУН «Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Крыма» путем выделения из природных популяций насекомых Крыма нового эффективного штамма энтомопатогенных бактерий Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 0371 и создания на его основе биопрепарата для защиты сельскохозяйственных и декоративных растений от листогрызущих насекомых. Способ получения биопрепарата включает получение маточной культуры Bacillus thuringiensis var. thuringiensis RCAM05207 на кукурузно-мелассной среде в течение 13-15 часов с титром КОЕ не менее 1,5-2,0⋅10⁸ в 1 мл, которую в дальнейшем используют для получения жидкой споровой культуры с титром спор не менее 1,0-1,5 млрд. в 1 мл на той же среде при температуре 28-30°С, 220 об/мин., в течение 46-48 часов, после чего жидкую препаративную форму с титром спор не менее 2,4 млрд./мл нарабатывают в ферментере на стабилизированной по рН кукурузно-мелассно-соевой или кукурузно-мелассной среде при 28-30°С, давлении 0,4-0,6 атм., при перемешивании и аэрации 0,17-0,36 объемов/мин. в течение 72 часов, а по окончании культивирования к жидкой культуре добавляют стабилизатор, например, фенол, бензойную кислоту и карбоксиметилцеллюлозу, способствующий хранению биопрепарата в течение 6 месяцев.

Штамм 0371 имеет следующие свойства, совпадающие с известными штаммами. Бактерии штаммов 0371, 98, 800 и 800/15 подвижные, имеют перитрихиальное расположение жгутиков, кристалло- и спорообразующие, грампозитивные. В качестве источников азота штаммы используют минеральные и органические формы азота, как источник углерода - различные формы углеводов. Штаммы 0371 98, 800 и 800/15 способны синтезировать термостабильный экзотоксин. Штаммы 0371 и 800/15 имеют широкий спектр энтомопатогенного действия против листоедов.

Штамм 0371 имеет такие отличительные особенности.

Морфологические и физиолого-биохимические: размеры вегетативных клеток штамма 0371 на стадии суточной культуры от 0,6-1,0 до 3,0-6,0 мкм. Штамм 0371 слабо использует неорганические формы азота. По активности экзотоксинообразования штамм 0371 по LK50 для комнатной мухи составляет 5,4 мкл/г корма, штамм 800-5,0 мкл/г корма.

Технологические: экспоненциальная фаза роста штамма 0371 на стадии вегетативных клеток переходит к стационарной через 13-14 часов культивирования, тогда как у штамма 800 - через 16-17 часов. Культура нового штамма достигает технологической зрелости через 36 часов, а штамма 800 - через 40 часов. Штамм 0371 возможно культивировать на питательных средах, все компоненты которых стерилизуются одновременно с применением одного режима стерилизации. Штамм 0371 в отличие от штамма 800/15 возможно культивировать в ферментере с применением трех режимов подачи воздуха.

Энтомопатогенные: помимо высокой энтомоцидной активности против насекомых отряда Coleoptera (колорадского жука и ильмового листоеда) и Lepidoptera (плодовой моли, златогузки, американской белой бабочки) спектр действия штамма 0371 распространяется также на листоедов - вредителей капусты.

Штамм Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 0371 способен продуцировать индолилуксусную кислоту в концентрации 0,92 мг/мл, штамм 98 - в концентрации 0,86 мг/мл, в то время как штамм 800 - только 0,48 мг/мл.

Штамм Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 0371 имеет выраженное антифидантное и физиологическое действие.

Приведенная выше совокупность существенных признаков штамма Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 0371 подтверждает возможность получения на его основе эффективного биопреперата против листогрызущих вредителей сельскохозяйственных и декоративных растений.

Характеристика штамма бактерий Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 0371. Номенклатурные данные: род Bacillus, вид Bacillus thurmgiensis. Происхождение штамма: штамм получен в ФГБУН «Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Крыма» из насекомых природных популяций.

Способ выделения: штамм Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 0371 выделен микробиологическим методом (Бурцева Л.И. Методы выделения и биотестирования энтомопатогенных бактерий // Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты / под ред. В.В. Глупова. - М.: Круглый год, 2001. - 736 с.) из гусениц кольчатого шелкопряда Malacosoma neustris L., идентифицирован по определителю Берджи (1974), Barjac, Bonnefoi (1968), Lusenco (1963) и сравнен с типовым штаммом бактерий Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 800.

Штамм депонирован 5.12.2019 г. в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM05207.

Штамм имеет следующие культурально-морфологические признаки. Клетки суточной культуры палочкоподобные с закругленными концами, размер клеток от 0,6-1,0 до 3,0-6,0 мкм. Подвижные благодаря жгутикам (перитрихи), грамположительные. Образуют споры, белковый кристаллический эндотоксин и термостабильный экзотоксин. На РПА образовывают серовато-белые округлые, плоские, слабо жесткие колонии со слегка зубчатым краем. Диаметр колоний 2,0-3,5 мм.

Физиолого-биохимические признаки штамма. Хорошо развивается на средах с органическим азотом, например, РПА, солями аммония. Штамм 0371 активно усваивает сахарозу, маннозу, целлобиозу, глюкозу, салицин, эскулин. Гидролизует крахмал, использует цитраты. На средах, содержащих желток образует лецитиназу, пигмента и уреазы не образует.

На плотных и жидких средах штамм 0371 растет в пределах 20-35°С, температурный оптимум составляет 25-32°С. Рост бактерий наблюдается в диапазоне рН 7,0-8,3, а оптимальной является реакция среды 7,2-7,6. Признаки штамма стойкие. Антигенные свойства штамма: дает положительную реакцию жгутикового антигена с типовой сывороткой Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis H-1. Культуру сохраняют на скошенном РПА при температуре 3-5°С, пересевая 2 раза в год. Состав питательной среды для долгосрочного сохранения штамма (г/л): панкреатический гидролизат рыбной муки - 8,0, пептон ферментативный 8,0, NaCl - 4,0, агар - 20, вода - 1 л. рН - 7,2-7,4.

Энтомопатогенные свойства штамма: штамм Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 0371 обладает энтомоцидной активностью для насекомых отряда Coleoptera и Lepidoptera (таблица 1). Рекомендован для борьбы с личинками и гусеницами младших возрастов, в особенности колорадского жука, плодовой моли, ильмового листоеда, златогузки и капустной совки. Штамм не патогенен для теплокровных животных и человека.

Штамм Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 0371 способен продуцировать индолилуксусную кислоту в концентрации 0,92 мг/мл, в то время как штамм 800 - только 0,48 мг/мл (таблица 2). Штамм обладает высокой целлюлозолитической активностью (до 87,7% к контролю) и активно продуцирует целлюлазы - до 0,24 мкМ в мин.

Заявляемый штамм способен продуцировать несколько типов энтомоцидных кристаллических белков, принадлежащих к группам cry 1, cry 1А, cry 9 и cry 11, в то время как штамм 800 продуцирует белки cry 1 и cry 7-8, а штамм 98 - только cry 1.

Биотехнологическая характеристика: штамм 0371 продуцирует энтомоцидный эндотоксин, освобождающийся из клеток в процессе лизиса их оболочек и экзотоксин, продуцирующийся в процессе вегетативного роста культуры. LD₅₀ штамма (млн. спор/мл) по отношению к гусеницам американской белой бабочки и капустной совки составляет 8,9-17,2 для личинок колорадского жука - 12,3.

Жидкая культура штамма Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 0371 является основой для разработки биопрепарата. Маточную культуру бактерий выращивают в колбах Эрленмейера на жидкой питательной среде, которая состоит из 2,0% кукурузного экстракта и 1,5% мелассы, воды водопроводной, рН 7,3-7,7. Маточную среду засевают суспензией спор, выращенных на РПА и инкубируют на термостабильной качалке при 28-32°С, 220 об/мин., в течение 13-15 часов. Титр колониеобразующих единиц (КУО) маточной культуры должен быть не менее 1,5-2,0⋅10⁸ в 1 мл. Маточную культуру используют для засева питательной среды для получения жидкой споровой культуры. Как питательную среду используют среду того же состава, как и при получении маточного материала. Среду засевают в объеме 1% от объема среды. Культивирование проводят в стеклянных бутылях объемом 3 л с 0,5 л среды на технологичных качалках при температуре 28-30°С, 220 об/мин., в течение 46-48 часов. После окончания культивирования жидкая культура содержит в основной своей массе свободные споры, титр которых составляет 1,0-1,5 млрд. в 1 мл, включения эндотоксина и 0,4 мг/мл экзотоксина.

Для получения жидкой препаративной формы бактерии выращивают на средах следующего состава:

Среда №1: 1,5% кукурузного экстракта, 2,0% мелассы и 1,5% соевой муки.

Среда №2: 3,0% кукурузного экстракта, 1,0% мелассы.

Для стабилизации рН питательные среды обогащают 0,5 г/л K₂HPO₄, 0,5 г/л KH₂PO₄ и 1 г/л мела.

В ферментер емкостью 50 л заливают 30 л воды и вносят компоненты среды, перемешивают с 40% гидроксидом натрия, при необходимости, доводят уровень рН до 7,2-7,4, стерилизуют при 1,5 атм. 2 часа. Среду охлаждают до 27-30°С и засевают посевным материалом (100-120 мл споровой культуры с титром спор не менее 1 млрд./мл). Культивирование ведут при 28-30°С, давлении 0,4-0,6 атм., при перемешивании и аэрации 0,17-0,36 объемов/мин. в течение 72 часов.

Титр спор в среднем после ферментации должен составлять не менее 2,4 млрд./мл.

Вносят 0,2-0,3% по объему пеногасителя (растительное масло). Пеногаситель стерилизуют при 1 атмосфере 40 минут.

Режим подачи воздуха.

С 0 часов до 12 часов 0,15-0,2 объема воздуха (объем среды)/мин.

С 12 часов до 24 часов 0,5 объема воздуха (объем среды)/мин.

С 24 часов до 42 часов 0,6-0,7 объема воздуха (объем среды)/мин.

Через 36-42 часа при наличии пенообразования прекращают подачу воздуха, температуру в ферментере поднимают до 35°С для ускорения выхода спор.

Пробоотбор ведут через 18, 36, 42 и 70 часов объемом 100-150 мл.

К жидкой культуре добавляют стабилизатор, в качестве которого может быть использовано 0,4% фенола, 0,4% бензойной кислоты и 4% карбоксиметилцеллюлозы. Полученная жидкая препаративная форма сохраняет титр спор не менее 2,4 млрд./мл в течение 6 месяцев.

Лабораторное определение энтомоцидной активности жидкой препаративной формы штамма 0371 проводили на личинках колорадского жука, гусеницах американской белой бабочки и капустной совки. Корм (листья картофеля, клена, капусты) обрабатывали водяной суспензией бактерий, потом подсаживали по 25 насекомых (в 3-кратной повторности). Для сравнения исследовали также штаммы 98 и 800. Результаты исследований приведены в таблице 2.

Энтомоцидная активность штамма Bacillus thuringiensis 800 (LD₅₀, млн. спор/мл) по отношению к личинкам листоедов младшего возраста составляет соответственно: колорадского жука 9,2, американской белой бабочки 10,9, капустной совки 14,3 (таблица 3). Для гусениц американской белой бабочки и капустной совки LD₅₀ штамма Bacillus thuringiensis 0371 составляет соответственно 8,3 и 9,2, что в 1,3 и 1,5 раза соответственно превышает эффективность штамма 800. Для колорадского жука штамм Bacillus thuringiensis 0371 проявляет энтомоцидность практически равную таковой для штамма 800 и превышает эффективность штамма 98 в 2,4 раза.

Определение энтомопатогенного действия биопрепарата на основе штамма В. thuringiensis 0371 проводили в полевом опыте по летальности относительно наиболее активного и распространенного вредителя картофеля - колорадского жука. Площадь участка - 36 м², повторность - 3-кратная, по 25 учетных кустов в повторе.

Опрыскивание растений картофеля осуществляли жидкими препаративными формами В. thuringiensis (400 л/га). Для сравнения использовали вариант с опрыскиванием растений химическим инсектицидом Денис (1 мл на 5 л/га). Контрольные участки обрабатывали водой. Обработку растений картофеля проводили в вечернее время, в безветренную погоду при температуре 24-25°С в период массового появления личинок I-II возраста.

Учет вредителя проводили непосредственно перед обработкой и в дальнейшем на 3, 5, 7-е и 10-е сутки. Эффективность штаммов В. thurmgiensis и химического инсектицида определяли в % снижения численности вредителя с учетом изменения численности в контроле.

Жидкая препаративная форма на основе штамма В. thuringiensis 0371 является эффективным средством против личинок вредителя, особенно младшего возраста (таблица 4). Основное количество личинок младшего возраста (до 81,5%) погибали в течение 5 суток, старшего возраста (до 74,0%) - в течение 10 суток. В целом, в течение 10 суток под воздействием патогена количество погибших насекомых достигало 86,2%. При обработке жидкой препаративной формой на основе штамма В. thuringiensis 800 в течение первых 3 суток погибало до 40,0% личинок младшего возраста, однако на 10-е сутки их гибель достигала 88,7%. Основное количество личинок старшого возраста погибало на 10-й день учета (до 83,4%).

На участке, обработанном химическим инсектицидом, 100% гибель личинок отмечали в течение 3 суток.

Урожай картофеля при обработке жидкой препаративной формой В. thurmgiensis 0371 оказался на 38,28% выше, чем в контроле, и на 7,4%, чем при обработке В. thuringiensis 800. Прибавка к урожаю составила 22,84 ц/га относительно контроля. При обработке раствором Децис урожай уменьшился на 6,42%. Потеря урожая составила 3,83 ц/га.

Жидкая препаративная форма штамма 0371 имеет антифидантное действие: поврежденность корма после обработки не превышало 5%, контрольные (без обработки) 7 растений были повреждены на 80-95%. Физиологическое действие препаративной формы штамма 0371 проявлялось также в снижении веса на 25-82% и размеров на 25-60% исследуемых насекомых, в сравнении с контрольными после 10 суток опыта.

Оценка жидкой препаративной формы проведена на поливном участке капусты сорта Колобок ООО «Биовитерра» (Республика Крым). Площадь участка под каждым вариантом 3 га, повторность опыта 2-кратная. Расход рабочей жидкости 300 л/га. Проводили две обработки против гусениц 1-2 возрастов капустной моли, белянок и совок. Биологическая эффективность препарата оценивалась на 3, 5, 7 и 10-е сутки после обработки и составила 72,3-82,6%.

Таким образом, предлагаемый новый штамм бактерий Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 0371 является эффективным и технологичным, обладает высокой энтомоцидной активностью в отношении широкого спектра вредителей, имеет выраженное антифидантное и физиологическое действие. Разработанный на основе заявляемого штамма биопрепарат может быть использован для защиты сельскохозяйственных и декоративных растений от листогрызущих насекомых.

Группа изобретений относится к области биотехнологии и касается получения биопрепарата для защиты сельскохозяйственных и декоративных растений от листогрызущих насекомых на основе нового штамма энтомопатогенных бактерий Bacillus thuringiensis. Предлагается биопрепарат на его основе для защиты сельскохозяйственных и декоративных растений от листогрызущих насекомых. Способ получения биопрепарата включает получение маточной культуры Bacillus thuringiensis var. thuringiensis RCAM05207 на кукурузно-мелассной среде в течение 13-15 часов с титром КОЕ не менее 1,5-2,0⋅10⁸ в 1 мл, которую в дальнейшем используют для получения жидкой споровой культуры с титром спор не менее 1,0-1,5 млрд. в 1 мл на той же среде при температуре 28-30°С, 220 об/мин, в течение 46-48 часов, после чего жидкую препаративную форму с титром спор не менее 2,4 млрд./мл нарабатывают в ферментере на стабилизированной по рН кукурузно-мелассно-соевой или кукурузно-мелассной среде при 28-30°С, давлении 0,4-0,6 атм, при перемешивании и аэрации 0,17-0,36 объемов/мин в течение 72 часов, а по окончании культивирования к жидкой культуре добавляют стабилизатор, например фенол, бензойную кислоту и карбоксиметилцеллюлозу, способствующий хранению биопрепарата в течение 6 месяцев. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Способ получения биопрепарата для защиты сельскохозяйственных и декоративных растений от листогрызущих насекомых, включающий получение маточной культуры Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 0371 на кукурузно-мелассной среде в течение 13-15 часов с титром 1,5-2,0⋅10⁸ КОЕ в 1 мл, которую в дальнейшем используют для получения жидкой споровой культуры с титром спор 1,0-1,5 млрд. в 1 мл на той же среде при температуре 28-30°С, 220 об/мин, в течение 46-48 часов, после чего жидкую препаративную форму с титром спор не менее 2,4 млрд./мл нарабатывают в ферментере на стабилизированной по pН кукурузно-мелассно-соевой или кукурузно-мелассной среде при 28-30°С, давлении 0,4-0,6 атм, при перемешивании и аэрации 0,17-0,36 объемов/мин в течение 72 часов.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что по окончании культивирования к жидкой препаративной форме дополнительно добавляют стабилизатор, в качестве которого используют 0,4% фенола, 0,4% бензойной кислоты и 4% карбоксиметилцеллюлозы.

3. Биопрепарат для защиты сельскохозяйственных и декоративных растений от листогрызущих насекомых на основе штамма энтомопатогенных бактерий Bacillus thuringiensis var. thuringiensis 0371, депонированного в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM05207, с титром спор не менее 2,4 млрд./мл, получаемый способом по п. 1.