КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВИТИЛИГО Российский патент 2008 года по МПК A61K31/401 A61P17/00 

Настоящее изобретение относится к области дерматологии, в частности к композициям, которые могут быть использованы в области косметологии, так же как в области медицины. Оно эффективно при поражениях, вызванных витилиго.

Уровень техники изобретения

Меланогенез представляет собой процесс, согласно которому репродукция клеток, продуцирующих кожный пигмент (меланоциты) и количество гранул темного пигмента, который синтезируют эти клетки, возрастает.

Существуют заболевания, такие как витилиго (Prcic S.Duran V. et al., 2002), Panuncio Al. et al., 2003), при которых имеет место прогрессирующая потеря кожей клеток, производящих темный пигмент, после того, как субъект перенес тяжелый стресс (Martin-Garcia RF. et al., 2003), (Hadad Al. et al., 2003), (Briganti S. et al., 2003).

Болезнь поражает около 1% мировой популяции и характеризуется появлением белых пятен, большей частью локализующихся на лице и конечностях, без связи с возрастом, полом и географической областью.

По современным данным известно, что некоторые химические вещества, которые стимулируют процесс меланогенеза, применяются для лечения этой болезни. Среди них есть таковые, которые называют псоралены (Kreuter A. et al., 2001), (Handa S. et al., 2001), (Hofer A. et al., 200), (Kwok YK. et al., 2002), синтетические производные из Египетского растения (Ammi-Majus). Тем не менее псоралены не свободны от токсических побочных эффектов, способны вызывать дерматиты и некрозы кожи после местного применения. Кроме того, в большинстве случаев, они обладают медленным обратимым эффектом после прерывания лечения.

Другое техническое решение, сходное с настоящим изобретением, описано в патенте FR № 8220746. В данном патенте раскрыто получение 50% спиртового экстракта человеческой плаценты, полученной от здоровых беременных женщин после родов в асептических условиях.

Из современных данных также известна Melagenina Plus®, публикация WO 00/06180 «Композиция для стимуляции синтеза меланина в коже, способ ее получения и применение», представляющая собой 50%-ный спиртовой экстракт с хлоридом кальция из человеческой плаценты, который до сих пор оставался наиболее эффективным и безвредным (Miyares Cao. Carlos, 1997).

Лечение препаратом Melagenina plus является местным, применяется один раз в день и без воздействия солнечного света. Его активным компонентом является альфа-липопротеин, полученный из котиледонов человеческой плаценты, обработкой их органическими растворителями и дальнейшим растворением в этаноле и растворе хлорида кальция.

L-пролин не является обычной аминокислотой, потому что его структура рассматривается как иминокислота, поскольку ее NH-группа скомпрометирована соседним углеродом. В результате он рассматривается как α-аминокислота с молекулярной массой 115,1.

До сих пор нет сообщений в данной области, что применение пролина связано с возрастанием продукции меланоцитов или вызывает репигментацию кожи у пациентов, страдающих от витилиго.

Раскрытие изобретения

L-пролин является активным веществом композиции по настоящему изобретению, который стимулирует синтез темного пигмента кожи и репродукцию меланоцитов, без серьезных побочных эффектов, как демонстрируют выполненные токсикологические и клинические исследования.

Настоящее исследование неожиданно продемонстрировало, что L-пролин имеет качественно больший эффект в отношении процесса меланогенеза, в сравнении с уже существующими в данной области средствами, упомянутыми выше. Данное средство стимулирует синтез темного пигмента кожи и репродукцию меланоцитов, что продемонстрировано в фармакологических испытаниях. Серьезные нежелательные реакции не были описаны, что продемонстрировано токсикологическими, тератологическими и клиническими исследованиями. Легкий для достижения и использования, репигментирующий эффект этого средства возникает быстро (от 15 до 20 дней от начала лечения) и является необратимым с момента прекращения приема препарата. После репигментации цвет обработанной кожи является идентичным таковому на нормальных участках кожи, интенсивность окраски которых не увеличивается со временем.

Согласно клиническим исследованиям, выполненным с композициями по изобретению, пролин продемонстрировал обнадеживающие результаты по лечению витилиго, и его применение показало замечательную, выдающуюся эффективность у всех пролеченных пациентов. Данный продукт вводят перорально, только 3 раза в неделю, что никогда не достигалось ранее в лечении этой болезни.

Способ получения композиции по изобретению осуществлялся с использованием раствора L-пролина (химически чистый реагент, Sigma) в концентрации от 0,5 до 2 мг/мл. Для этого использовался этанол, который хранился в бутылках из темного стекла объемом 120 мл при 22-28°С.

Пример 1

Меланогенная активность 80% водно-спиртового раствора, содержащего L-пролин в концентрации 1,5 мг/мл, была установлена, сопоставлена с Melagenina Plus в меланоцитах базального слоя эпидермиса ушей самцов черных мышей массой 18-22 г линии C57BL6, поставленных CENPALAB.

Все исследования средства были повторены три раза.

Гистохимические анализы эпидермиса ушей таких мышей подтвердили изменения количества меланоцитов, представленных в этих тканях (Nordlund et al, 1981).

Для выполнения этих исследований были сформированы группы, каждая из которых состояла из 5 животных. Изучаемыми образцами являлись:

А - контроль - 80%-ный спирт

В - Melagenina plus

С - водно-спиртовой раствор L-пролина

Исследование проводили при местном нанесении на поверхность тела мышей.

Средний вес животных, которые содержались для привыкания в виварии в течение 10 дней, составлял 20,15 г. Через 72 часа после завершения 5 нанесений на поверхность тела животные были умерщвлены скручиванием шейного отдела позвоночника.

После умерщвления на обоих ушах были удалены волосы с помощью крема-депилятора, который был удален через 10 минут после аппликации, и затем уши промыли большим количеством воды из-под крана. Первая стадия получения эпидермиса каждого уха и представления его для инкубации гистохимическим методом в L-допа состоит из ручного удаления кожи с хряща, после чего кожа каждого уха помещается на 1-2 часа в 1М раствор кальция хлорида при комнатной температуре, что облегчает разделение дермы и эпидермиса. По достижении этого эпидермис промывают дистиллированной водой в течение 10 минут и процесс начинается:

Эпидермис погружают в 85° спирт на 20 минут.

Осуществляют промывку дистиллированной водой.

Подвергают эпидермис воздействию раствора L-допа (1 мг/мл), растворенного в фосфатном буфере при 37°С.

Этот раствор обновляют, и эпидермис оставляют в нем на 12-15 часов. Затем его отмывают большим количеством воды из-под крана, устраняя излишки Допа с ткани.

Осуществляют повторную промывку в дистиллированной воде.

Эпидермис фиксируют в 10% нейтральном формалине в течение 20 минут.

Снова проводят промывку в дистиллированной воде.

В конце его заключают в полупрозрачную среду гистологического препарата.

Пять различных зон в ухе были выбраны для определения количества меланоцитов/мм². Были отобраны зоны с большим числом меланоцитов, и использовалась часть программы DIGIPAT, специализированная для подсчета клеток. Количество меланоцитов/мм² в каждом из них было определено, так что были получены 10 значений, и, следовательно, 50 значений для всей группы.

Выполняли анализы для определения меланогенного действия L-пролина в сравнении с Melagenina Plus. Как показано на фиг.1, было продемонстрировано, что L-пролин обладает заметно превосходящим меланогенным действием на меланоциты из уха черной мыши по сравнению с Melagenina Plus.

Результаты экспериментов показали, что аминокислота L-пролин стимулирует репродукцию меланоцитов и синтез темного пигмента кожи при местном применении в водно-спиртовом растворе. Так, была получена количественно большая величина в сравнении с Melagenina Plus и спиртом (80%).

Пример 2

Всего 21 пациент, страдающий витилиго, был отобран для клинического исследования на людях, по принципу информированного согласия. Все они были из клиники «Servicio clinico nacional del centro» и были распределены следующим образом:

Пол

Женщины: 10

Мужчины: 11

Раса

Белые: 16

Темнокожие: 4

Метисы: 1

Возраст

Моложе 15: 4

Старше 15: 17

Процент депигментации:

Менее 10%: 14

Между 10 и 20%: 3

Между 20 и 40%: 4

Важно отметить, что все выбранные пациенты были нечувствительны к лечению Melagenina Plus как минимум по меньшей мере в течение одного года.

Лечение включало нанесение 80% водно-спиртового раствора L-пролина в концентрации 1,5 мг/мл путем втирания пальцами в кожу депигментированной области 3 раза в неделю (понедельник, среда и пятница).

Безопасность продукта, используемого в исследовании, была продемонстрирована допустимым уровнем раздражающего действия на кожу и глаза.

Протокол клинического исследования был приготовлен для каждого пациента к началу эксперимента, и были получены цифровые рисунки депигментированной зоны, где были указаны участки нанесения водно-спиртового раствора L-пролина.

Через один месяц пациенты были вызваны для оценки эффектов лечения. Оценка повторялась через 3 и 6 месяцев лечения исследуемым средством.

Полученный эффект репигментации был определен на каждом участке нанесения и оценивался следующим образом:

Значительно:

Уменьшение % депигментации туловища

Появление пигментации похожей на веснушки в пределах или на краю поражения

Уменьшение размера поражения

Умеренно:

Помутнение цвета пораженного участка без исчезновения или уменьшения

Плохо:

Без изменений

В заключение были снова сделаны цифровые изображения обработанных областей в тех случаях, когда имели место выдающиеся заметные изменения в репигментации.

Это было 6-месячное клиническое исследование.

Результаты клинического исследования

В приведенной ниже таблице 1 и на чертежах (фигуры 2-13) показаны результаты исследования.

Таблица 1№Общая репигментацияЧастичная репигментацияБез
репигментацииУвеличение
пораженияОценка эффекта1-Х--Выраженный2-Х--Выраженный3-Х--Выраженный4-Х--Выраженный5-Х--Выраженный6-Х--Выраженный7-Х--Выраженный8-Х--Выраженный9-Х--Выраженный10-Х--Выраженный11-Х--Умеренный12-Х--Умеренный13-Х--Умеренный14-Х--Умеренный15-Х--Умеренный16-Х--Умеренный17-Х--Умеренный18-Х--Умеренный19-Х--Плохой20ВыбылХ--Плохой21 Х-- 

Как показано выше в таблице, только 2 пациента из 21 не продемонстрировали ответа на лечение, и 18 из них продемонстрировали ответ от выраженного до умеренного. Только один пациент выбыл, поэтому его результаты не могли быть оценены. С другой стороны, должно быть отмечено, что ни в одном случае не были описаны увеличение поражения или местный или системный побочный эффект. Полученные результаты свидетельствовали о терапевтической эффективности, так же как и о безопасности водно-спиртового раствора L-пролина. Тот факт, что у большинства пациентов наблюдается положительный ответ при 3-разовом применении данного средства в неделю, показывает его превосходство в сравнении с Melagenina Plus, которое представляется еще большим ввиду того факта, что все они оказались невосприимчивы к известному средству при его ежедневном применении.

Другим преимуществом этого состава над Melagenina Plus является его синтетическое происхождение, которое позволяет избежать сложных и дорогостоящих тестов, обычно выполняемых с плацентой, используемой в процессе получения Melagenina Plus, для предотвращения загрязнения.

Пример 3

Спектрофотометрическое определение и анализ аминокислот в свежеприготовленном водно-спиртовом растворе L-пролина и на 12 и 24 дни после приготовления было выполнено для доведения до конца исследований стабильности. При помощи известных методик было продемонстрировано, что L-пролин остается стабильным в течение 2 лет после приготовления раствора (таблицы 2,3)

Таблица 2
Результаты спектрофотометрического исследования стабильности (фотометрия)ПродуктОпределение спектра (нм)свежий12 месяца24 месяцаL-пролин200-2050,051 UA0,072 UA0,071 UA

Таблица 3ПродуктОпределение спектра свежий12 месяца24 месяцаL-пролин1,01 мг/мл1,00 мг/мл1,00 мг/мл

Изобретение относится к области дерматологии, более подробно к композициям, которые могут быть использованы в области косметологии и медицины, являясь полезными в лечении поражений, вызванных витилиго. Композиция по изобретению содержит в качестве активного ингредиента аминокислоту L-пролин в спиртовом растворителе, которая стимулирует синтез темного пигмента кожи, так же как и репродукцию меланоцитов, и не имеет серьезных побочных эффектов, как показано в проведенных токсикологических и клинических испытаниях. Изобретение обеспечивает повышение эффективности и безопасности лечения. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 табл. 13 ил.

1. Композиция для лечения витилиго, характеризующаяся тем, что она содержит в качестве активного ингредиента эффективное количество L-пролина в спиртовом растворителе.2. Композиция по п.1, характеризующаяся тем, что концентрация L-пролина в спиртовом растворителе составляет 1,5 мг/мл.3. Композиция по п.1, характеризующаяся тем, что спиртовой растворитель представляет собой 70-90°-ный этанол.4. Применение L-пролина в спиртовом растворителе для лечения витилиго.5. Способ лечения витилиго, характеризующийся тем, что осуществляют местное нанесение композиции по любому из пп.1-3 посредством втирания пальцами в области поражения с частотой 3 раза в неделю.