ГЕПАРИН СО СРЕДНЕЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССОЙ Российский патент 2008 года по МПК A61K31/727 A61P7/02 

Описание патента на изобретение RU2322245C2

Настоящее изобретение относится к новому гепарину со средней молекулярной массой, к способу его получения и к его применению.

Гепарин был открыт в 1916 г. Маклином (MacLean) и уже более 60 лет применяется в медицине. При этом основной областью его применения является профилактика и терапия тромбоза. В настоящее время гепарин применяется в медицине в двух различных формах. К одной из этих форм относится нефракционированный гепарин (НФГ), который в промышленном масштабе получают из легких, печени или слизистой оболочки кишечника крупного рогатого скота и свиней и выделяют путем протеолиза, отделения нежелательных примесей, таких как жир и протеины, и отбеливания. К другой форме относятся низкомолекулярные гепарины (НМГ), которые получают деполимеризацией НФГ.

Существенное различие между обеими этими формами гепарина при их введении в организм состоит в их различной биодоступности. Биодоступность НФГ после его подкожной инъекции составляет порядка 10-20% от введенной дозы, а биодоступность НМГ составляет порядка 90% (R.J.Kandotas, Heparin Pharmacokinetics and Pharmacodynamics, Clinical Pharmacokinetics, 22 (5), 1992, сс.359-374).

В приведенной ниже таблице 1 для сравнения представлены наиболее важные характеристики НФГ и НМГ (J.Hirsh и M.N.Levine, "Low molecular weight heparine". Blood 79(1), 1992, сс.1-17).

Таблица 1НФГНМГМолекулярная масса (в Да)3000-300002000-8000Средняя молекулярная масса (в Да)130005000Активность против фактора Ха/фактора IIa1:12:1-5:1Нейтрализация фактором ФТ 4*сильнаяслабаяСвязывание с протеинамивысокоенизкоеСвязывание с эндотелиальными клеткамидаслабоеЗависящий от дозы клиренсданетБиологическая доступность (подкожно)10-25%-90%Период полураспада (t1/2)1 ч (внутривенно)2 ч (внутривенно)1-2 ч (подкожно)3-6 ч (подкожно)Выделениебиофазноечерез почкиЛабораторный контрольтребуетсяне требуетсяПримечание:*ФТ 4 представляет собой белок плазмы, называемый фактором 4 тромбоцитов.

В клинической практике НФГ и НМГ применяются в основном для профилактики и терапии тромбоэмболических заболеваний, при этом НМГ стал использоваться более широко лишь сравнительно недавно. В целом применение подобных гепаринов позволяет снизить риск тромбоза в пери- и послеоперационный период с 50-60% до приблизительно 15-30% (J.Harenberg, S.Haas и К.Н.Breddin, "Prophylaxe der venosen Thrombose" в G.Miiller-Berghaus, Potsch (изд.), "Hämostaseologie", изд-во Springer Verlag, Berlin-Heidelberg, 1998, cc.564-580). Вместе с тем такое снижение риска тромбоза в пери- и послеоперационный период лишь до 15-30% свидетельствует о необходимости дальнейшего его снижения, в связи с чем и в настоящее время продолжаются исследования, целью которых является поиск более эффективных альтернативных решений этой проблемы.

Создание гирудина, представляющего собой непосредственный ингибитор тромбина, позволило достичь в этом отношении определенного прогресса, поскольку он обеспечивает возможность более эффективной защиты от тромбоза. Однако применение гирудина, поскольку для него не существует противоядия (антидота) и поэтому имеется опасность неконтролируемого кровотечения, ограничено особыми сложными случаями, когда использование гепарина невозможно, например при непереносимости гепарина и при лечении индуцированной гепарином тромбоцитопении (ИГТ).

Низкомолекулярные (НМ-) гепарины несмотря на все различия между их индивидуальными препаратами классифицируются как клинически эквивалентные и регулярно используются в метаанализах в обобщенном виде. Однако НМ-гепарины превосходят НФГ при использовании в ортопедии, соответственно при операциях по протезированию тазобедренного сустава только по эффективности, касательно же переносимости между ними не существует различий. НМГ и стандартный гепарин зарекомендовали себя в преобладающей области их применения, которой является общая хирургия, как абсолютно равноценные. Сказанное справедливо по меньшей мере в отношении таких основных критериев, как защита от тромбоза и кровоточивость.

Равноценность индивидуальных НМ-гепаринов в клинической медицине контрастирует с различиями в их средней молекулярной массе, спектре молекулярной массы, выраженном в процентах уровне активности против фактора Ха и фактора IIa, а также в их влиянии на активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), представляющее собой время свертывания, являющееся показателем ингибирования (гепарином) эндогенной активности тромбина. К числу подобных различий относятся далее профибринолитическая активность, высвобождение ИПТФ (ингибитор пути тканевого фактора), влияние на функцию тромбоцитов и иные различия.

Несмотря на большое разнообразие созданных на уровне медицинских лабораторий отдельных продуктов отсутствует возможность клинического контроля их эффективности на более высоком уровне, который мог бы служить определяющим фактором в разработке нового гепарина.

Поэтому все сказанное выше в целом свидетельствует об отсутствии каких-либо отправных точек, основываясь на которых можно было бы предложить подходы по оптимизации гепаринов с точки зрения соотношения между их эффективностью и переносимостью, расширив тем самым возможности их терапевтического применения.

Исходя из вышеизложенного в основу настоящего изобретения была положена задача предложить действующее вещество с противосвертывающим действием и тем самым расширить группу известных из уровня техники действующих веществ, добавив к ней по меньшей мере еще одно действующее вещество, которое позволило бы устранить по меньшей мере часть известных из уровня техники недостатков.

Еще одна задача изобретения состояла в том, чтобы найти применение предлагаемому в изобретении действующему веществу.

Указанная задача решается с помощью гепарина, отличительные признаки которого указаны в п.1 формулы изобретения. Поставленная в изобретении задача решается также за счет применения подобного гепарина в соответствии с п.3 формулы изобретения.

При создании изобретения неожиданно было установлено, что гепарин со средней молекулярной массой, составляющей от 10 до 11,5 кДа, наиболее предпочтительно гепарин со средней молекулярной массой, составляющей 10,5 кДа, обладает таким спектром действия, который существенно отличается от спектра действия НФГ и НМГ.

В принципе исходя из пригодности к применению НМГ и НФГ следовало бы ожидать, что спектр действия предлагаемого в изобретении гепарина со средней молекулярной массой должен примерно соответствовать усредненному спектру действия НФГ и НМГ.

С учетом этого применение предлагаемого в настоящем изобретении гепарина позволяет благодаря, в частности, тому факту, что при более высокой его эффективности не наблюдается повышенной по сравнению с известными гепаринами кровоточивости, улучшить профилактику и лечение тромбоэмболических процессов, потребность в чем сохранялась уже в течение достаточного длительного времени.

Эффективность предлагаемого в изобретении гепарина оценивали его сравнением с эноксапарином, который получил международное признание как наиболее эффективный НМГ. Поскольку НМГ в целом рассматриваются как обладающие по меньшей мере такой же эффективностью и переносимостью, что и НФГ, полученные при сравнении предлагаемого в изобретении гепарина с эноксапарином результаты можно также в определенной степени распространить и на НФГ.

Ниже изобретение более подробно проиллюстрировано на примерах, в которых свойства предлагаемого в изобретении гепарина сравниваются со свойствами известных из уровня техники гепаринов, при этом рассмотренные в последующем описании варианты осуществления изобретения служат исключительно для пояснения его сущности и не ограничивают его объем.

На прилагаемых к описанию чертежах показано:

на фиг.1 - графическое представление молекулярно-массового распределения предлагаемого в изобретении гепарина (ГСМ), эноксапарина (НМГ) и Liquemin® (НФГ) в виде кривых элюирования при гельпроникающей хроматографии (ГПХ),

на фиг.2а - графическое представление данных об активности предлагаемого в изобретении гепарина (ГСМ), эноксапарина (НМГ) и Liquemin® (НФГ) соответственно в опыте по определению АЧТВ,

на фиг.2б - графическое представление данных об активности трех гепаринов против фактора Ха,

на фиг.2в - графическое представление данных об антитромбиновой активности трех гепаринов,

на фиг.3а - графическое представление значений AUC0-24ч для трех гепаринов,

на фиг.3б - соответствующее фиг.3а графическое представление данных об активности трех гепаринов против фактора Ха,

на фиг.3в - соответствующее фиг.3а и 3б графическое представление данных об активности трех гепаринов против фактора IIa,

на фиг.4а-4в - графическое представление данных о нормированной на дозу активности трех исследованных гепаринов в соответствии с фиг.3а-3в,

на фиг.5а - график, отражающий временное изменение концентрации общего антигена ИПТФ после введения каждого из гепаринов (сплошная линия соответствует ГСМ, пунктирная линия соответствует НМГ (эноксапарину), прерывистая линия соответствует НФГ (Liquemin®)),

на фиг.5б - аналогичный фиг.5а график, отражающий временное изменение концентрации свободного антигена ИПТФ,

на фиг.6а-6г - графическое представление значений AUC0-24ч для трех исследованных гепаринов, вычисленных исходя из высвобождения общего антигена ИПТФ и свободного антигена ИПТФ,

на фиг.7 - сравнение данных об антитромботическом действии эноксапарина и предлагаемого в изобретении гепарина средней молекулярной массы по результатам опыта на животных (кроликах) и

на фиг.8 - сравнение данных о продолжительности кровотечения после введения эноксапарина и предлагаемого в изобретении гепарина средней молекулярной массы по результатам опыта на животных (кроликах).

Предлагаемый в изобретении гепарин получали путем контролируемой деполимеризации и последующего выделения методами молекулярной фильтрации. Полученный таким путем гепарин имел следующие характеристики по данным ЖХВР-анализа:

среднечисленная молекулярная масса10513средневзвешенная молекулярная масса10819Z-средняя молекулярная масса11233средневязкостная молекулярная масса10819(Z+1 )-средняя молекулярная масса11815внутренняя вязкость0,0000пиковая молекулярная масса10236дисперсность1,029066Z-средняя/средневзвешенная мол. масса1,038271(Z+1)-средняя/средневзвешенная мол. масса 1,092039

Предлагаемый в изобретении гепарин для определения других его характеристик и с целью продемонстрировать у него наличие свойств, превосходящих свойства гепаринов иных типов, сравнивали с нефракционированным гепарином Liquemin® и низкомолекулярным гепарином эноксапарином.

В последующем описании гепарин со средней молекулярной массой обозначается также как "ГСМ", эноксапарин в качестве представителя низкомолекулярных гепаринов обозначается как "НМГ", a Liquemin® в качестве представителя нефракционированных гепаринов обозначается как "НФГ".

Между предлагаемым в изобретении гепарином, НФГ и НМГ существуют значительные различия касательно их молекулярной массы и молекулярно-массового распределения, как это видно из данных, представленных на фиг.1. Из приведенных на фиг.1 кривых элюирования, полученных при ГПХ трех указанных гепаринов, однозначно следует, что НФГ имеет среднюю молекулярную массу, равную 13,0 кДа, и одновременно с этим характеризуется исключительно широким молекулярно-массовым распределением. НМГ имеет среднюю молекулярную массу, равную 4,5 кДа, и значительно более узкое молекулярно-массовое распределение. Предлагаемый же в изобретении гепарин имеет среднюю молекулярную массу, равную 10,5 кДа, и наиболее узкое среди всех трех различных гепаринов молекулярно-массовое распределение.

При этом узкому молекулярно-массовому распределению предлагаемого в изобретении гепарина придается особое значение, поскольку именно подобным молекулярно-массовым распределением обусловлено наличие у предлагаемого в изобретении гепарина уникального и неожиданного спектра фармакологического действия.

Наиболее значимые и неожиданные различия между тремя гепаринами обнаруживаются при сравнении их активности in vitro. При этом для проведения такого сравнительного анализа используется принятая в качестве международного стандарта система определения или измерения активности против фактора Ха, в соответствии с которой активность против фактора Ха определяют в пересчете на 1 мг действующего вещества. В сравнительных целях определяли также активность против фактора IIa. Результаты этих исследований представлены ниже в таблице 2.

Таблица 2Активность против фактора Ха, МЕ/мгАктивность против фактора IIa, МЕ/мгСоотношение между активностью против фактора Ха и активностью против фактора IIaСоотношение между активностью против фактора IIa и активностью против фактора ХаГСМ174,91170,011,030,97Liquemin® (НФГ)159,02159,021,001,00эноксапарин (НМГ)100,0226,323,800,26Примечание:1определяли согласно 1-му международному стандарту для НМГ,2определяли согласно 4-му международному стандарту для НФГ.

При этом следует отметить прежде всего тот неожиданный факт, что предлагаемый в изобретении гепарин ГСМ обладает при его сопоставлении с обоими сравнительными действующими веществами, каждое из которых является представителем НФГ и НМГ соответственно, значительно более высокой активностью и против фактора Ха, и против фактора IIa. Подобный эффект превзошел даже самые смелые ожидания. В лучшем случае можно было бы предположить, что предлагаемый в изобретении гепарин займет по показателем его активности против фактора Ха и антитромбиновой активности среднее положение между активностями НФГ и НМГ.

Для сравнения фармакокинетических и гемостазиологических характеристик предлагаемого в изобретении гепарина (ГСМ) с характеристиками Liquemin® (НФГ) и эноксапарина (НМГ) проводили рандомизированное множественное перекрестное исследование двойным слепым методом с участием 16 здоровых мужчин (возрастом от 18 до 32 лет и весом от 64 до 98 кг). Каждый из участников эксперимента получал с интервалом в одну неделю один из трех гепаринов в разовой дозе с активностью против фактора Ха, эквивалентной 9000 ME. Перед каждой инъекцией и через 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 8, 10 и 24 ч после каждой инъекции брали пробы крови, к которым добавляли цитратный буфер. Первые два миллилитра крови отбрасывали, а плазму остальной крови получали в соответствии с общепринятыми рекомендациями (I.Witt, H.Beeser и G.Muller-Berghaus, "Minimalanfbrderungen zur Gewinnung von Citratplasma fur hamostasiologische Analysen", Lab. Med., 1995, cc.143-145). Полученные образцы разделяли на аликвотные количества, после этого чего их сразу же замораживали жидким азотом и хранили при -70°С до проведения анализов. Последующие исследования ex vivo на этих образцах крови проводили в соответствии с описанными ниже условиями.

При этом следует отметить, что представленные ниже данные представляют собой результаты, полученные при исследовании действия предлагаемого в изобретении гепарина (ГСМ) in vivo, в сравнении с действием НФГ и НМГ, которое исследовали ех vivo.

Противосвертывающую активность в образцах плазмы анализировали определением времени свертывания в опыте по определению АЧТВ (активированное парциальное тромбопластиновое время) (набор APTT-Micro Kieselgur, фирма Instrumentation Laboratory), при этом ингибирование фактора Ха, а также тромбиновой активности определяли с использованием анализатора ACL 3000 (фирма Instrumentation Laboratory). Это исследование заключается в определении параметра свертывания, который традиционно используется для определения противосвертывающего действия. В целом для каждого образца плазмы определяли два значения. При расхождении между этими значениями более 3% измерения повторяли. Достоверность исследований определяли параллельным проведением контрольных опытов со сравнительными образцами плазмы, проводя эксперименты в соответствии с 4-ым международным стандартом для НФГ и 1-ым международным стандартом для НМГ.

Для определения активности против факторов Ха и IIa образцы плазмы разбавляли буферами для определения гепарина (фирма Chromogenix) и дополняли человеческим антитромбином (фирма Chromogenix). После инкубации в присутствии фактора Ха или тромбина (фирма Chromogenix) остаточную активность определяли по реакции хромогенных субстратов S2222 и S2238 соответственно.

Концентрацию общего и свободного антигена ИПТФ в образцах плазмы измеряли с помощью специального набора для ELISA-анализа (твердофазный иммуноферментный анализ) "Asserachrom® Free TPFI" и "Asserachrom® Total TPFI" (фирма Diagnostica Stago). Для анализа ИПТФ использовали планшеты для ELISA-анализа, покрытые фрагментами F(ab′)2 ИПТФ-специфического антитела (ТТ4Е2). Моноклональные связанные с пероксидазой маркерные антитела обладали специфичностью в отношении либо общего ИПТФ (2С6), либо свободного ИПТФ (Н65).

Построенные по результатам исследования графики для увеличения времени свертывания, для ингибирования фактора Ха и тромбина (фактора IIa) и для концентрации общего и свободного ИПТФ в организме каждого из участников эксперимента использовали для определения на их основе следующих фармакокинетических параметров:

- auc0-24ч [s×4,% инг.×ч или (нг/мл)×ч]площадь под кривой (от англ."area under curve")- cmax [c,% инг, или нг/мл]максимум активности(увеличение временисвертывания, ингибированиеили концентрация)- tmax [мин]время достижениямаксимальной активности- t1/2, всасывания [мин]период полувсасывания- t1/2, выведения [мин]период полувыведения

Значения Сmax и tmax определяли непосредственно по отдельным кривым. AUC рассчитывали по формуле трапеций для интервала времени между t=0 ч и t=24 ч.

Для определения значений t1/2, всасывания и t1/2, выведения исходно предполагается, что процессы всасывания и выведения начинаются с базового значения, равного 0, и протекают во времени экспоненциально. Для проверки этих предположений экспериментально полученные данные аппроксимировали биэкспоненциальной функцией (функция Бейтмена, дополненная логарифмическим выражением). При сравнении между собой аппроксимированных и экспериментально полученных кривых в большинстве случаев была выявлена высокая степень их взаимного совпадения, и поэтому кинетику гепарина и ИПТФ можно с достаточно высокой точностью описать функцией Бейтмена. Значения t1/2,засасывания и t1/2,выведения вычисляли на основе констант функции Бейтмена для всасывания и выведения (Квсас, Квывед). Все значения определяли в виде средних значений ± стандартное отклонение.

Попарное сравнение всех параметров для трех гепаринов проводили их сопоставлением между собой с использованием уровня значимости (а), равного 0,05. Различия рассматривались как статистически значимые при р<0,05. После этого средние значения фармакокинетических параметров подвергали дисперсионному анализу с использованием обычной линейной модели (за нулевую гипотезу принималось отсутствие различий между предлагаемым в изобретении гепарином и Liquemin® и между предлагаемым в изобретении гепарином и эноксапарином).

По результатам анализа было установлено, что полученные при проведении различных исследований кривые, описывающие воздействие трех разных гепаринов, имеют явно выраженные и четкие отличия, как это следует из приведенных на фиг.2а-2в графиков.

При этом очевидно, что предлагаемый в изобретении гепарин проявляет наибольшую активность в опыте по определению АЧТВ и в опыте по определению активности против фактора IIa, причем предлагаемый в изобретении гепарин именно по показателям его активности против фактора IIa значительно отличается от двух других гепаринов, что является неожиданным. Ожидаемый результат был получен только при анализе активности против фактора Ха. В этом случае предлагаемый в изобретении гепарин занимает примерно среднее положение между эноксапарином и Liquemin®, которые являются представителями НМГ и НФГ соответственно.

Данные о AUC0-24ч, полученные в опыте по определению АЧТВ и при анализе активности против фактора Ха и против фактора IIa и приведенные на фиг.3а-3в для каждого из трех исследованных гепаринов, свидетельствуют о наличии у них различной противосвертывающей активности. При этом такие значения характеризуют действие каждого из гепаринов в отдельных экспериментах, т.е. увеличение времени свертывания, а также ингибирование фактора Ха и тромбина соответственно. Из полученных данных следует, что три гепарина значительно различаются между собой не только их фармакокинетическими, но и их фармакодинамическими характеристиками (например, показателями активности против фактора Ха по сравнению с активностью против фактора IIa).

При этом особое внимание обращает на себя тот факт, что активность предлагаемого в изобретении гепарина во всех трех опытах примерно в два раза превышает активность Liquemin®. Отсюда можно сделать вывод, что после подкожного введения предлагаемый в изобретении гепарин, который не содержит типичных для нефракционированных гепаринов молекул с большой молекулярной массой, обладает существенно более высокой биодоступностью. С другой стороны, сравнение предлагаемого в изобретении гепарина с эноксапарином свидетельствует о том, что предлагаемый в изобретении гепарин не относится к гепаринам с низкой молекулярной массой. Хотя активность эноксапарина против фактора Ха более чем в два раза превышает активность предлагаемого в изобретении гепарина, тем не менее антитромбиновая активность эноксапарина составляет лишь приблизительно 66% от активности предлагаемого в изобретении гепарина. Отсюда можно сделать вывод, что эноксапарин действительно обладает более высокой по сравнению с предлагаемым в изобретении гепарином биодоступностью, однако его ингибирующее тромбин действие, которым в первую очередь определяется противосвертывающая эффективность, проявляется в существенно меньшей степени, чем у предлагаемого в изобретении гепарина.

Появление описанных непосредственно выше различий в действии эноксапарина и предлагаемого в изобретении гепарина in vivo и причину таких различий, состоящую в различной биодоступности, можно подтвердить сравнением уже рассмотренных выше и представленных в таблице 1 показателей активности трех гепаринов in vitro. В этом случае ситуация выглядит абсолютно по-иному, при этом предлагаемый в изобретении гепарин обладает наиболее высоким действим и против фактора Ха, и против тромбина. Это различие позволяет сделать вывод лишь о том, что влияние на результаты исследований, в которых все три гепарина вводили различным испытуемым подкожно, основано в отличие от показателей активности in vitro на изменении доступности действующих веществ в биологической системе, т.е. биодоступности.

Вместе с тем приведенные на фиг.3а-3б данные не несут сведений об отнесенной к единице массы удельной активности каждого из отдельных гепаринов, поскольку показатели удельной активности трех этих гепаринов отличаются друг от друга, а каждому испытуемому предлагаемый в изобретении гепарин, Liquemin® и эноксапарин инъецировали каждый в дозе с активностью против фактора Ха, эквивалентной 9000 ME. Поэтому рассчитывали также нормированные на дозу значения AUC0-24ч, т.е. значения AUC0-24ч на мг соответствующего введенного гепарина. Предлагаемый в изобретении гепарин испытуемым вводили в дозе 51,5 мг, Liquemin® вводили в дозе 56,5 мг, а эноксапарин вводили в дозе 90 мг. Сравнение отнесенных к единице массы удельных значений AUC, представленных на фиг.4а-4в, убедительно свидетельствует о том, что предлагаемый в изобретении гепарин обладает не только более высокой биодоступностью в сравнении с Liquemin®, но и существенно более высоким потенциалом в сравнении с эноксапарином.

Сравнение между собой значений сmax для трех исследованных гепаринов, рассчитанных на основе увеличения времени свертывания и показателях ингибирования, позволяет констатировать, что эти значения у предлагаемого в изобретении гепарина, равно как и полученные для него значения AUC0-24ч,превышают соответствующие значения, полученные для Liquemin®. Однако такие значения были выше максимум на 50% (активность против фактора Ха), тогда как соответствующее значение AUC0-24ч было выше в два раза. Подобное расхождение обусловлено различиями между предлагаемым в изобретении гепарином и Liquemin® в некоторых их фармакокинетических параметрах. Помимо этого превосходство предлагаемого в изобретении гепарина перед Liquemin®, которое более ярко проявляется в значениях AUC0-24ч нежели в значениях сmax, может оказаться предпочтительным, поскольку в противном случае может возрасти риск кровотечений. Значение сmax можно уменьшить за счет снижения дозы при сохранении более высокого по сравнению с Liquemin® значения AUC0-24ч.

Аналогичным образом разница между значениями сmax у эноксапарина и у Liquemin®, выявленная при анализе активности против фактора Ха и антитромбиновой активности, также меньше разницы между значениями AUC0-24ч. Несмотря на более высокое значение AUC0-24ч значение сmax у эноксапарина в опыте по определению АЧТВ даже на 25% меньше, чем у Liquemin®. Сравнение фармакокинетических параметров сmax, t1/2,всасывания [мин] и t1/2,выведения [мин] свидетельствует о том, что предлагаемый в изобретении гепарин не сопоставим ни с НФГ, ни с НМГ. В зависимости от конкретного параметра предлагаемый в изобретении гепарин значительно отличается либо от Liquemin® и эноксапарина (например, по параметру t1/2,всасывания), либо только от Liquemin® (например, по параметру tmax), либо только от эноксапарина (например, по параметру t1/2, выведения).

Касательно времени достижения максимума активности следует лишь отметить, что значение tmax у предлагаемого в изобретении гепарина примерно соответствует значению tmax у эноксапарина и только незначительно отличается от соответствующего значения у Liquemin®. Во всех трех различных опытах каких-либо значимых различий между тремя исследованными гепаринами выявлено не было.

Значение t1/2,всасывания у предлагаемого в изобретении гепарина в опыте по определению АЧТВ и в опыте по определению активности против фактора Ха значительно превышает соответствующее значение, полученное для Liquemin®, однако лишь несущественно больше в опыте по определению активности против фактора IIa. Кроме того, в обоих этих опытах указанный период времени превышает тот же показатель, полученный для эноксапарина. Однако в опыте по определению активности против фактора IIa эноксапарин обладает наибольшим значением t1/2 всасывания, что имеет существенное значение. В отличие от других относящихся ко времени параметров между предлагаемым в изобретении гепарином и Liquemin® отсутствуют значимые различия в их значениях t1/2, выведения. В опыте по определению АЧТВ и в опыте по определению активности против фактора Ха значение t1/2выведения у эноксапарина в два раза превышает тот же показатель, полученный для предлагаемого в изобретении гепарина и Liquemin®. Однако в опыте по определению активности против фактора IIa эноксапарин имеет наименьшее значение t1/2,выведения. В соответствии с этим активность предлагаемого в изобретении гепарина против фактора IIa снижается наиболее медленно, что с учетом того важного значения, которое антитромбиновая активность имеет для противосвертывающей эффективности, следует отнести к преимуществу перед двумя другими гепаринами.

Описанные выше значения, полученные в трех опытах для трех иссследованных гепаринов, обобщены ниже в таблице 3.

Таблица 3Активность в опыте по определению АЧТВАктивность против фактора ХаАктивность против фактора IIaСреднее значениеСтандартное отклонениеОтносительная величинаЗначение рСреднее значениеСтандартное отклонениеОтносительная величинаЗначение
р
Среднее
значение
Стандартное
отклонение
Относительная
величина
Значение
р
AUC0-24, [s×4]2AUC0-24ч [% ингибирования×ч]3AUC0-24ч [% ингибирования×ч]ГСМ154661,454391092,005441191,77НФГ104651,000,0001219801,000,00013081151,000,0001НМГ126551,210,021610281144,690,0001358901,160,0001AUC/доза [s×4/мг]3AUC/доза [% ингибирование×ч/мг]AUC/доза [% ингибирования×ч/мг]3ГСМ2,991,281,638,522,212,2010,562,311,94НФГ1,841,431,00не опред.3,871,421,00не опред.5,442,041,00не опред.НМГ1,400,6160,76не опред.11,421,272,95не опред.3,971,000,73не опред.Сmax [с]2Cmax[% ингибирования]Cmax [% ингибирования]ГСМ22,710,71,3046,711,51,4955,514,31,36НФГ17,412,71,000,000131,412,21,000,000141,014,81,000,0001НМГ13,04,50,750,021677,27,92,460,000141,312,51,010,0001tmax[мин]tmax[мин]tmax[мин]ГСМ233821,31218431,28221461,20НФГ178731,000,0175171461,000,0036184461,000,0081НМГ240491,350,7353221361,300,8070248371,350,0588t1/2,всасывания [мин]t1/2,всасывания [мин]t1/2,всасывания [мин]ГСМ105171,57116241,2999361,18НФГ67371,000,000391261,000,005784341,000,0637НМГ82281,230,022489240,980,0037122221,450,0082t1/2,выведения [мин]t1/2,выведения [мин]t1/2,выведения [мин]ГСМ129680,84137281,19171591,22НФГ1531071,000,7753115401,000,2378140641,000,0572НМГ2251262,180,0187252832,190,0001134290,960,0239ПРИМЕЧАНИЕ:1 Р<0,05: СТАТИСТИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫЕ РАЗЛИЧИЯ;2 ОСНОВАНИЕМ ДЛЯ РАСЧЕТА СЛУЖИТ УВЕЛИЧЕНИЕ ВРЕМЕНИ СВЕРТЫВАНИЯ;3 ДОЗЫ, В КОТОРЫХ ВВОДИЛИ ДЕЙСТВУЮЩИЕ ВЕЩЕСТВА: 5,5 мг ГСМ, 56,5 мг LIQUEMIN® (НФГ), 90,0 мг ЭНОКСАПАРИНА (НМГ).

Анализ и сравнение между собой данных о концентрации общего антигена ИПТФ и концентрации свободного антигена ИПТФ после введения трех различных гепаринов позволяет констатировать, что концентрация общего антигена ИПТФ через 1 ч увеличивалась в 2,0-2,5 раза от исходного значения, а концентрация свободного антигена ИПТФ увеличивалась в 6,7-7,9 раз от исходной концентрации. При этом из приведенных на фиг.5а и 56 графиков следует, что концентрация общего и свободного антигена ИПТФ достигала максимума по истечении 1,5-2 ч, и поэтому значение tmax оказалось значительно меньше того же показателя, полученного в трех проводившихся ранее опытах. Сказанное свидетельствует о том, что индуцируемое гепарином высвобождение ИПТФ не коррелирует с указанными традиционными параметрами, характеризующими свертывание.

Из приведенных на фиг.5а и 5б графиков следует далее, что действие предлагаемого в изобретении гепарина значительно отличается от действия Liquemin® и эноксапарина. После введения предлагаемого в изобретении гепарина значения обоих исследованных в этом отношении параметров сохранялись на высоком уровне значительно дольше, чем после введения каждого из сравнительных гепаринов.

Подобное действие предлагаемого в изобретении гепарина также является совершенно неожиданным и имеет особо важное значение для настоящего изобретения, поскольку исходно предполагается, что именно свободный антиген ИПТФ играет важную роль в свертывании.

При сравнении между собой соответствующих значений AUC0-24ч, полученных на основе кривых концентраций высвободившегося ИПТФ (общего антигена ИПТФ и свободного антигена ИПТФ), становится очевидным, что предлагаемый в изобретении гепарин и эноксапарин примерно в одинаковой степени повышают концентрацию общего антигена ИПТФ в плазме и явно превосходят по этому показателю Liquemin®, как это следует из приведенной на фиг.6а диаграммы.

Поскольку, однако, концентрация свободного антигена ИПТФ является имеющим важное значение для свертывания параметром, когда речь идет о степени влияния ИПТФ на активность гепарина, следует сравнить между собой значения AUC0-24ч, относящиеся к концентрации свободного антигена ИПТФ. Из приведенной на фиг.6б диаграммы следует, что предлагаемый в изобретении гепарин обладает наибольшей эффективностью.

На фиг.6в и 6г в графическом виде представлены результаты сопоставления между собой нормированных на дозу значений AUC0-24ч, полученных на основе кривых концентрации высвободившегося ИПТФ. При использовании предлагаемого в изобретении гепарина и концентрация общего антигена ИПТФ, и концентрация свободного антигена ИПТФ являются наивысшими. В соответствии с этим можно констатировать, что предлагаемый в изобретении гепарин по двум таким имеющим решающее значение для свертывания параметрам, как антитромбиновая активность и высвобождение свободного антигена ИПТФ, однозначно и при этом в неожиданно высокой степени превосходит известные гепарины.

Следует также отметить, что подобные результаты подтверждаются результатами, полученными при сравнении предлагаемого в изобретении гепарина с эноксапарином в эксперименте на животных. Результаты этого эксперимента, в котором в качестве подопытных животных использовали кроликов, однозначно свидетельствуют о наличии у предлагаемого в изобретении гепарина более высокого терапевтического действия касательно предупреждения и лечения тромбоэмболических процессов по сравнению с низкомолекулярными гепаринами. Помимо этого было установлено, что введение предлагаемого в изобретении гепарина сопровождается меньшим по сравнению с эноксапарином риском кровотечений.

С учетом описанных выше экспериментально полученных результатов предлагаемый в изобретении гепарин со средней молекулярной массой предпочтительно далее применять и для терапии острого инфаркта миокарда и нестабильной стенокардии, а также для ингибирования свертывания при экстракорпоральном кровообращении.

Следует подчеркнуть, что неожиданные свойства предлагаемого в изобретении гепарина со средней молекулярной массой наиболее ярко проявляются прежде всего в опыте по определению АЧТВ, который при гепариновой терапии принят за критерий оценки эффективности лекарственных средств. При использовании предлагаемого в изобретении гепарина время свертывания в опыте по определению АЧТВ значительно увеличивается по сравнению с применением других исследованных гепаринов - эноксапарином и Liquemin®. При этом важное значение имеет также особо высокая активность предлагаемого в изобретении гепарина из расчета на один миллиграмм, что также является абсолютно неожиданным фактом. В сочетании с существенным снижением риска кровотечения, что в опыте на животных является убедительным подтверждением превосходства предлагаемого в изобретении гепарина со средней молекулярной массой, настоящее изобретение открывает абсолютно новые перспективы в терапии заболеваний, при которых показано применение гепарина.

В эксперименте на животных исследовали также действие и переносимость предлагаемого в изобретении гепарина со средней молекулярной массой в сравнении с низкомолекулярным гепарином - эноксапарином. Подобное исследование проводили по описанному у S. Wessler модифицированному методу моделирования тромбоза ("моделирование стаза на кроликах", "Thrombosis in the presence of vascular stasis". Am.J.Med., 33, 1959, с.649), в соответствии с которым вызванный искусственным путем тромбоз обусловлен повышенной свертываемостью в сочетании с венозным застоем.

Кровоточивость оценивали в соответствии с двумя многократно проверенными на практике и хорошо зарекомендовавшими себя методами, один из которых основан на моделировании кровопотери на кроликах ("rabbit blood loss model", заключается в подсчете эритроцитов в промывной жидкости после определенного повреждения), а другой основан на определении стандартного времени кровотечения у кроликов ("rabbit template bleeding time") (J.Fareed, J.M.Walenga и др. Studies on the antithrombotic effects and pharmacokinetics of heparin fractions and fragments, Sem. Thromb. Hemost. 11, 1985, сс.56-74).

Представленные на фиг.7 и 8 данные подтверждают ярко выраженное достоверное увеличение "терапевтического индекса" у предлагаемого в изобретении гепарина со средней молекулярной массой по сравнению с НМГ, что основано не только на более высокой антитромботической активности предлагаемого в изобретении гепарина, но и прежде всего на существенном уменьшении кровоточивости при его применении.

На фиг.7 в графическом виде представлены сравнительные данные об антитромботической эффективности при внутривенном введении эноксапарина, представляющего собой НМГ, и предлагаемого в изобретении ГСМ. При этом из приведенных на этом чертеже данных следует, что показатель свертывания, являющийся мерой количества и размера образовавшихся сгустков крови, у предлагаемого в изобретении гепарина значительно ниже, чем у эноксапарина. В каждом случае в качестве контрольного вещества, полученные для которого значения при сравнительном анализе принимали за нулевой уровень, использовали солевой раствор. Из приведенных на чертеже данных следует также, что свертывание крови полностью подавляется и при использовании эноксапарина, но лишь при его применении в более высокой дозе, которая в данном случае составляет 50 единиц на кг веса тела.

На фиг.8 в графическом виде представлены сравнительные данные о времени кровотечения после внутривенного введения эноксапарина, ГСМ и солевого раствора, который использовали в качестве контрольного вещества, полученные для которого значения при сравнительном анализе принимали за нулевой уровень или стандарт. При этом очевидно, что именно в диапазоне более высоких доз предлагаемый в изобретении гепарин со средней молекулярной массой обладает значительно более высоким по сравнению с эноксапарином потенциалом, поскольку результаты, полученные в эксперименте на животных, свидетельствуют об исключительно малой кровоточивости.

Обобщив эти результаты, для предлагаемого в изобретении ГСМ можно определить так называемый терапевтический индекс по отношению к НМГ эноксапарину. С этой целью данные об эффективности, т.е. об антитромботическом действии, и данные о кровоточивости подвергают обработке и сопоставлению путем дисперсионного анализа и методом линейной регрессии. Полученный в результате для предлагаемого в изобретении гепарина со средней молекулярной массой терапевтический индекс по отношению к эноксапарину составляет 2,24. Иными словами, показатель терапевтического применения у предлагаемого в изобретении гепарина со средней молекулярной массой в 2,24 раза выше, чем у эноксапарина. Для специалиста в данной области подобные результаты являются абсолютно неожиданными и свидетельствуют о возможности значительного повышения эффективности гепариновой терапии по истечении примерно 60-ти лет после первого применения нефракционированного гепарина и примерно 20-ти лет после первого применения низкомолекулярных гепаринов. В соответствии с этим настоящее изобретение позволяет найти решение проблемы, сохранявшейся в данной области в течение достаточного длительного времени.

В настоящем изобретении предлагается гепарин, который обладает значительно более высокой эффективностью по сравнению с известными из уровня техники гепаринами и который отличается более высоким терапевтическим индексом, основанным на более благоприятном соотношении между его действием и переносимостью. С точки зрения клинической практики сказанное при этом позволяет спрогнозировать расширение области применения такого гепарина в профилактических и терапевтических целях, т.е. указывает на возможность применения предлагаемого в изобретении гепарина со средней молекулярной массой в относительно высокой дозировке по сравнению с известными гепаринами, что тем самым должно способствовать дальнейшему, пока еще не поддающемуся точному прогнозу улучшению в лечении тромбоэмболических заболеваний.

Подобный эффект является неожиданным прежде всего постольку, поскольку его не представляется возможным предсказать на основе клинических параметров.

Похожие патенты RU2322245C2

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕПАРИНА С НИЗКОЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССОЙ И АНТИКОАГУЛЯНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ 2009
  • Банникова Галина Евгеньевна
  • Дрозд Наталья Николаевна
  • Варламов Валерий Петрович
  • Макаров Владимир Александрович
  • Толстенков Александр Сергеевич
  • Лапикова Елена Сергеевна
  • Мифтахова Наджия Таировна
  • Ильина Алла Викторовна
  • Лопатин Сергей Александрович
  • Скрябин Константин Георгиевич
RU2396282C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ГЕПАРИНА 2007
  • Банникова Галина Евгеньевна
  • Дрозд Наталья Николаевна
  • Варламов Валерий Петрович
  • Макаров Владимир Александрович
  • Толстенков Александр Сергеевич
  • Лапикова Елена Сергеевна
  • Мифтахова Наджия Таировна
  • Ильина Алла Викторовна
  • Лопатин Сергей Александрович
  • Скрябин Константин Георгиевич
RU2377993C2
АНТИТРОМБОТИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО ИЗ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ ПИХТЫ СИБИРСКОЙ 2014
  • Кузнецова Светлана Алексеевна
  • Дрозд Наталья Николаевна
  • Савчик Елена Юрьевна
  • Мифтахова Наджия Таировна
  • Васильева Наталья Юрьевна
  • Макаров Владимир Александрович
  • Кузнецов Борис Николаевич
RU2571555C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ГЕПАРИНА 2012
  • Фрумин Леонид Ерухимович
  • Костакова Галина Аркадиевна
  • Мочалова Кристина Романовна
  • Колдышев Анатолий Евгениевич
  • Сдобнова Марина Юрьевна
  • Журавлёва Елена Евгениевна
RU2512768C1
АНТИКОАГУЛЯНТНОЕ СРЕДСТВО 2009
  • Кузнецова Светлана Алексеевна
  • Дрозд Наталья Николаевна
  • Кузнецов Борис Николаевич
  • Макаров Владимир Александрович
  • Левданский Владимир Александрович
  • Мифтахова Наджия Таировна
RU2399377C1
СРЕДСТВО С АНТИТРОМБОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ 2016
  • Дрозд Наталья Николаевна
  • Калинина Татьяна Сергеевна
  • Кузнецова Светлана Алексеевна
  • Васильева Наталья Юрьевна
  • Кузнецов Борис Николаевич
  • Макаров Владимир Александрович
RU2627435C1
СПОСОБ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ДЕСУЛЬФАТИРОВАНИЯ И ПОВЫШЕНИЯ БИОДОСТУПНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СУЛЬФАТИРОВАННЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ ПРИ ИХ ПЕРОРАЛЬНОМ ПРИМЕНЕНИИ 2009
  • Бекарев Андрей Александрович
  • Артамонов Андрей Владимирович
  • Верещагин Евгений Иванович
RU2421230C2
Средство, обладающее антикоагулирующим действием, и способ его применения 2021
  • Александров Алексей Георгиевич
  • Гурьев Артём Михайлович
  • Аракелов Сергей Александрович
  • Меркулов Илья Вадимович
  • Александров Георгий Васильевич
  • Сорокин Олег Владимирович
  • Трухин Виктор Павлович
  • Начарова Елена Петровна
RU2799028C2
АНТИКОАГУЛЯНТНОЕ СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО КОМПЛЕКСА ИЗ КОРЫ КЕДРА СИБИРСКОГО 2007
  • Дрозд Наталья Николаевна
  • Кузнецова Светлана Алексеевна
  • Макаров Владимир Александрович
  • Толстенков Александр Сергеевич
  • Кузнецов Борис Николаевич
  • Бутылкина Анна Ильинична
RU2366441C2
Способ получения надропарина кальция 2020
  • Александров Алексей Георгиевич
  • Александров Георгий Васильевич
  • Аракелов Сергей Александрович
  • Сорокин Олег Владимирович
  • Трухин Виктор Павлович
  • Начарова Елена Петровна
  • Меркулов Илья Вадимович
RU2753678C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 322 245 C2

Реферат патента 2008 года ГЕПАРИН СО СРЕДНЕЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССОЙ

Предложен гепарин со средней молекулярной массой от 10 до 11,5 кДа, прежде всего 10,5 кДа. Такой гепарин получали путем контролируемой деполимеризации нефракционированного гепарина и последующего выделения методами молекулярной фильтрации. Он предназначен для получения лекарственного средства для профилактики и терапии тромбоэмболических процессов и, в частности, для торможения свертывания крови при экстракорпоральном кровообращении. Заявленный гепарин отличает отсутствие по сравнению с известными гепаринами кровоточивости при наибольшей активности против фактора IIa, что достоверно повышает его терапевтический индекс. 1 з.п. ф-лы, 8 ил., 3 табл.

Формула изобретения RU 2 322 245 C2

1. Применение гепарина со средней молекулярной массой, составляющей от 10 до 11,5 кДа, для получения лекарственного средства, предназначенного для профилактики и терапии тромботических процессов.2. Применение по п.1, при котором используют гепарин со средней молекулярной массой, составляющей 10,5 кДа.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2008 года RU2322245C2

Приспособление в пере для письма с целью увеличения на нем запаса чернил и уменьшения скорости их высыхания 1917
  • Латышев И.И.
SU96A1
Ekkre Н-Р Т
Inhibition of human and guinea pig complement by heparin fractionsdiffering in affinity for antithrombin III or in average molecular weight
Int J Immunopharmacol
Приспособление для установки двигателя в топках с получающими возвратно-поступательное перемещение колосниками 1917
  • Р.К. Каблиц
SU1985A1
RU 2070879 C1, 27.12.1996.

RU 2 322 245 C2

Авторы

Вельцель Дитер

Даты

2008-04-20Публикация

2000-12-22Подача