АНТИКОАГУЛЯНТНОЕ СРЕДСТВО Российский патент 2010 года по МПК A61K36/185 A61P7/02 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для создания эффективного средства для профилактики и лечения тромботических состояний (инфаркты, инсульты различной локализации).

Применяемый в нашей стране антикоагулянт прямого типа действия нефракционированный гепарин (НФГ) является полисахаридом с молекулярной массой 2-40 кД, в среднем 15 кД, и обладает рядом побочных нежелательных эффектов (остеопорозы, тромбоцитопении, повышение функциональной активности тромбоцитов, геморрагические осложнения). С целью разработки новых антикоагулянтных средств, лишенных побочных эффектов гепаринов, разрабатывают сульфатированные полисахариды (СП) растительного происхождения (выделенные из водорослей, лишайников, грибов, высших растений), а также выделенные из тканей морских беспозвоночных, членистоногих или млекопитающих [1-3]. Для придания молекулам полисахаридов необходимых свойств их деполимеризуют [4], в них встраивают функциональные группы [5], объединяют [конъюгируют] с молекулами других полисахаридов [6]. Структура макромолекулы СП играет важную роль при проявлении антикоагулянтной активности (АА). Так, под действием модифицированного аргинином хитозана (конъюгат хитозан-аргинин) происходят конформационные изменения молекулы тромбина [7]. Введение функциональных групп для получения химически модифицированного N-propanoyl-, N-hexanoyl- и N,O-quaternary substituted сульфата хитозана приводит к увеличению АА [8]. При изменении положительного заряда поверхности полимерного биоматериала на основе хитозана с боковыми цепями из полиэтиленгликоля и гексанала на нейтральный или отрицательный, при добавлении SO₃ ^- групп, снижается адгезия тромбоцитов и возрастает биосовместимость с кровью, которая положительно коррелирует с содержанием полиэтиленгликоля внутри полимера [9]. Известно использование коры кедра для получения биологически активного соединения резвератрола [10]. Известен способ получения препарата Pycnogenol из коры сосны приморской, который является эффективным антиоксидантом, антикоагулянтом, капилляропротектором, а также проявляет противовирусный эффект и противовоспалительную активность [11].

Наиболее близким к заявляемому антикоагулянтному средству, по сути, является нефракционированный гепарин. Так, композиция, содержащая гепарин со средней величиной молекулярной массы, представляющая собой смесь сульфированных олигосахаридов, имеющих молекулярные массы от ~ 6000 до ~ 12000 Да, ингибирует тромбин, связанный с фибрином, и тромбин, находящийся в жидкой фазе, катализируя антитромбин, и ингибирует образование тромбина, катализируя инактивацию фактора Ха антитромбином [12].

Недостатком гепарина является то, что он обладает рядом побочных эффектов и то, что его выделяют из тканей млекопитающих [13].

Задачи изобретения:

1. Расширение сырьевой базы для получения растительных антикоагулянтов, свободных от вирусов и прионов.

2. Частичная утилизации коры березы.

Технический результат изобретения достигается тем, что предлагаемое антикоагулянтное средство, обладающее ингибиторной активностью по отношению к тромбину и фактору Ха, согласно изобретению, представляет собой раствор биологически активного комплекса из коры березы, полученный экстракцией измельченной коры березы водой при кипячении, концентрированием водного экстракта и насыщением его хлоридом натрия, удалением образующегося осадка, экстракцией фильтрата этилацетатом, концентрированием фильтрата, разбавлением его хлороформом, отделением выпавшего осадка фильтрованием и его растворением с получением конечной концентрации 1,0-251,2 мкг/мл, эффективной для ингибирования активности тромбина, и конечной концентрации 0,1-851,0 мкг/мл, эффективной для ингибирования активности фактора свертываемости крови Ха.

Исследовали влияние биологически активного комплекса из коры березы на изменение времени свертывания плазмы крови человека в коагулологических тестах активированного частичного тромбопластинового времени (аЧТВ, влияние на внутренний путь свертывания крови), РеаКлот НПО "Ренам" (влияние на активность фактора Ха) [14]. Лиофильно высушенную плазму человека приобретали в НПО «Ренам». Ингибирование амидолитической активности тромбина и фактора Ха исследуемыми образцами изучали по изменению скорости расщепления хромогенных субстратов S-2238 или S-2222 при λ=405 нм. Для расчета специфических антитромбиновой (анти-фактор IIa, aIIa) и анти-фактор Ха (аХа) активностей использовали калибровочные кривые 5-го Международного стандарта нефракционированного гепарина (NIBSC).

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами.

Пример 1. В колбу объемом 2 л, снабженную мешалкой и обратным холодильником, загружают 100 г измельченной березовой коры, заливают 1 л дистиллированной воды и кипятят в течение 1,5 часов. Затем горячий водный раствор отделяют фильтрованием, концентрируют на роторном испарителе до объема 350 мл, насыщают хлоридом натрия и отделяют образующийся осадок. Выделенный фильтрат трижды экстрагируют, используя по 250 мл этилацетата, сушат над безводным сульфатом натрия, затем этилацетатный раствор концентрируют под вакуумом до объема 50 мл и разбавляют хлороформом, при этом в осадок выпадают светло-кремовые хлопья биологически активного комплекса, которые отделяют фильтрованием.

Пример 2. К смеси 0,06 мл плазмы и 0,06 мл аЧТВ-реагента (НПО "Ренам") добавляли 0,02 мл раствора биологически активного комплекса из коры березы в конечных концентрациях 1,0-251,2 мкг/мл. Через 3 мин инкубации при 37°С добавляли 0,06 мл 0,025 М раствора CaCl₂ и фиксировали время (сек) появления фибринового сгустка. Отмечали достоверное удлинение времени свертывания плазмы с ростом концентрации биологически активного комплекса из коры березы (табл.1). Концентрация, при которой время свертывания плазмы увеличивалось в 2 раза (2аЧТВ), в сравнении с контрольным (40,3±3,3) составила 507±113 мкг/мл (табл.2). Для нефракционированного гепарина, выбранного в качестве стандарта, подобная величина составила 0,51±0,12 мкг/мл. Антитромбиновая активность (aIIa), рассчитанная по 5-ому Международному стандарту нефракционированного гепарина, составила 0,22±0,09 ЕД/мг и коррелировала с величиной 2аЧТВ.

Пример 3. К смеси 0,069 мл плазмы и 0,035 мл раствора фактора Ха (РеаКлот, НПО "Ренам" - определение влияния исследуемых веществ на активность фактора Ха в коагулологическом тесте) добавляли 0,01 мл раствора биологически активного комплекса из коры березы в конечных концентрациях 0,1-851,0 мкг/мл. Через 2 мин инкубации при 37°С добавляли 0,06 мл 0,035 М раствора CaCl₂ и фиксировали время (сек) появления фибринового сгустка. Отмечали достоверное удлинение времени свертывания плазмы с ростом концентрации образца (табл.1). Концентрация, при которой время свертывания плазмы увеличивалось в 2 раза (2РеаКлот), в сравнении с контрольным (13,4±1,5 сек) составила 891±71 мкг/мл (табл.2). Активность против фактор Ха (аХа) для образца, рассчитанная по 5-ому Международному стандарту нефракционированного гепарина, составила 0,15±0,05 ЕД/мг и коррелировала с величиной 2РеаКлот.

Таблица 1 Влияние биологически активного комплекса коры березы (мкг/мл) на внутренний путь свертывания крови в тесте активированного частичного тромбопластинового времени (аЧТВ, сек) и на активность фактора Ха в тесте РеаКлот (сек). аЧТВ мкг/мл 0 1,0 20,0 39,8 60,1 100,0 199,5 251,2 сек 40,3±3,3 40,2±2,9 40,2±3,4 41,8±3,2 50,0±3,9* 56,2±4,3** 61,3±4,8*** 65,2±3,9*** Реа-Клот мкг/мл 0 0,1 1,0 10,0 85,0 427,0 708,0 851,0 сек 13,4±1.5 13,6±1,6 13,5±1,5 15,0±1,7 16,0±1,7 19,4±1,6* 27,8±1,9 35,0±2,2*** * - р<0.05, ** - р<0.01 и *** - р<0.001 достоверность различий с показаниями при конечной концентрации биологически активного комплекса из коры березы 0 мкг/мл.

Таблица 2 Специфическая антикоагулянтная активность биологически активного комплекса коры березы образцы аЧТВ РеаКлот 2аЧТВ, мкг/мл aIIa, ЕД/мг 2РеаКлот, мкг/мг аХа, ЕД/мг Биологически активный комплекс из коры березы 507,00±113,00 0,22±0,09 891±71 0,15±0,05 НФГ 0,51±0,12 203,1 0,21±0,09 220 НФГ - 5-ый Международный стандарт нефракционированного гепарина.

Таким образом, исследованный биологически активный комплекс из коры березы обладает антикоагулянтной активностью in vitro. Двойные эффективные концентрации коррелируют с антитромбиновой и анти-факторХа активностями. В сравнении со стандартом нефракционированного гепарина антитромбиновая активность много меньше, но для биологически активного комплекса из коры березы, который предполагают использовать per os, такая величина оптимальна.

Изобретение относится к области медицины. Антикоагулянтное средство, обладающее ингибиторной активностью по отношению к тромбину и фактору Ха, представляет собой раствор биологически активного комплекса из коры березы, полученный экстракцией измельченной коры березы водой при кипячении, концентрированием водного экстракта и насыщением его хлоридом натрия, удалением образующегося осадка, экстракцией фильтрата этилацетатом, концентрированием фильтрата, разбавлением его хлороформом, отделением выпавшего осадка фильтрованием и его растворением с получением конечной концентрации 1,0-251,2 мкг/мл, эффективной для ингибирования активности тромбина, и конечной концентрации 0,1-851,0 мкг/мл, эффективной для ингибирования активности фактора свертываемости крови Ха. Изобретение позволяет реализовать указанное назначение. 2 табл.

Антикоагулянтное средство, обладающее ингибиторной активностью по отношению к тромбину и фактору Ха, отличающееся тем, что представляет собой раствор биологически активного комплекса из коры березы, полученный экстракцией измельченной коры березы водой при кипячении, концентрированием водного экстракта и насыщением его хлоридом натрия, удалением образующегося осадка, экстракцией фильтрата этилацетатом, концентрированием фильтрата, разбавлением его хлороформом, отделением выпавшего осадка фильтрованием и его растворением с получением конечной концентрации 1,0-251,2 мкг/мл, эффективной для ингибирования активности тромбина, и конечной концентрации 0,1-851,0 мкг/мл, эффективной для ингибирования активности фактора свертываемости крови Ха.