СПОСОБ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БЕЛКА Российский патент 2008 года по МПК C12P21/00 C07K1/22 B01D15/38 

Изобретение относится к биохимии, биотехнологии и касается приемов по выделению и очистке белков.

Для выделения и очистки белков из многокомпонентных смесей широко применяются хроматографические приемы.

Известен способ хроматографического выделения и очистки металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27a (Zabolotskaya M.V, et al. A novel neutral protease from Thermoactinomyces species 27a: sequencing of the gene, purification and characterization of the enzyme. // The Protein Journal. 2004, vol. 23, №7, p.483-492) [1].

Однако этот известный способ сложен: он включает две стадии анионообменной хроматографии (в том числе одну стадию высокоэффективной), при этом выход очищенного белка низкий.

Известен способ хроматографического выделения и очистки рекомбинантной глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius, включающий две стадии хроматографической очистки: катионообменную хроматографию и высокоэффективную гель-проникающую хроматографию (Rebrikov D.V. et al. Bacillus intermedius glutamyl endopeptidase. Molecular cloning and nucleotide sequence of the structural gene. // Journal of Protein Chemistry. 1999. vol. 18, №18, p.21-27) [2].

Однако при использовании этого многостадийного способа выделенный и очищенный белок получают с низким выходом.

Известен способ хроматографического выделения и очистки субтилизина (Takagi H. et al. Random mutagenesis into the conserved Gly 154 of subtilisin E: isolation and characterization of the revertant enzymes. // Protein eng. 1998, vol. 11, №12, p.1205-1210) [3].

Данный известный способ включает две стадии катионообменной хроматографии (в том числе одну высокоэффективную), но при этом позволяет получить очищенный белок с низким выходом.

Известен способ хроматографического выделения и очистки белка с использованием сорбента в виде иммобилизованного пептидного соединения (Руденская Г.Н. Аффинная хроматография протеиназ. // Биохимия. 1994, том 20, №3, с.213-227) [4].

В качестве пептидного соединения в этом известном способе используют, например, антибиотики пептидной природы.

Однако данные известные иммобилизованные соединения пептидной природы не обеспечивают высокой избирательности при очистке конкретных белков.

Известен способ выделения и очистки белка, включающий двухэтапное приготовление комплекса, состоящего из выделяемого и очищаемого белка с иммобилизованным на сорбенте пропетидом этого белка, и последующее выделение белка элюцией из полученного комплекса (Wittlin S. et al. One-step purification of cathepsin D by affinity chromatography using immobilized propeptide sequences. // Eur. J. Biochem. 1998, vol. 252, №3, p.530-536) [5].

Согласно данному известному способу осуществляют двухэтапное приготовление комплекса, состоящего из выделяемого и очищаемого белка и иммобилизованного на сорбенте пропептида этого белка. На первом этапе готовят продукт взаимодействия выделяемого и очищаемого белка с пропептидом этого белка. На втором этапе готовят упомянутый комплекс путем осуществления контакта с сорбентом полученного продукта взаимодействия, выделение исходного белка из полученного комплекса осуществляют путем его элюции из этого комплекса.

Однако данный известный способ сложен и не позволяет получать выделяемый и очищаемый белок с высоким выходом. Согласно этому способу иммобилизованный на сорбенте пропептид не подлежит многократному использованию.

В информационном источнике [5] описано получение иммобилизованного на сорбенте пропептида белка, однако его использование для выделения и очистки этого белка не описано.

Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является упрощение, повышение эффективности очистки и выхода выделяемого и очищаемого белка, обеспечение возможности многократного использования иммобилизованного на сорбенте пропептида.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе хроматографического выделения и очистки белка, включающем двухэтапное приготовление комплекса, состоящего из выделяемого и очищаемого белка с иммобилизованным на сорбенте пропептидом этого белка, и последующее выделение белка элюцией из полученного комплекса, на первом этапе приготовления комплекса получают иммобилизованный на сорбенте пропептид выделяемого и очищаемого белка, который помещают в колонку с получением заполненной колонки, на втором этапе приготовления комплекса осуществляют контакт выделяемого и очищаемого белка с иммобилизованным на сорбенте его пропептидом путем пропускания раствора этого белка через заполненную колонку, а элюцию очищенного белка осуществляют из колонки.

Выделять и очищать можно природный рекомбинантный, мутантный или модифицированный белок.

Можно использовать природный рекомбинантный, мутантный или модифицированный пропептид выделяемого и очищаемого белка.

Если выделяют и очищают металлопротеиназу Thermoactinomyces species 27a, то используют ее природный пропептид, иммобилизованный на агарозе, а элюируют ее с колонки 10%-ным раствором изопропанола в 50 мМ трис-(гидроксиметил)аминометан-HCl (ТРИС-HCl) буферном растворе pH 7,5.

Если выделяют и очищают металлопротеиназу Thermoactinomyces species 27a, то можно также использовать иммобилизованный на агарозе ее модифицированный пропептид, несущий дополнительную последовательность из 6 остатков гистидина на амино-конце молекулы, а элюируют ее с колонки 10%-ным раствором изопропанола в 50 мМ ТРИС-HCl буферном растворе pH 8,0.

Если выделяют и очищают глутамилэндопептидазу, продуцируемую Bacillus intermedius, то используют ее иммобилизованный на микрокристаллической целлюлозе модифицированный пропептид, несущий на амино-конце молекулы целлюлозосвязывающий домен CelD эндоглюканазы, продуцируемой Anaerocellum thermophilum, а элюируют глутамилэндопептидазу с колонки 0,5 М раствором NaCl в 50 мМ ТРИС-HCl буферном растворе pH 8,5.

Если выделяют и очищают субтилизин, то используют иммобилизованный на агарозе его пропептид с мутацией Glu⁵³-Asp, а элюируют субтилизин с колонки раствором его пропептида с мутацией Glu⁵³-Asp в 50 мМ ТРИС-HCl буферном растворе pH 8,3.

Собственные исследования показали, что процесс выделения и очистки белка можно упростить и в одну стадию получить с высоким выходом выделяемый и очищаемый белок, если очистку осуществлять колоночной хроматографией, используя для заполнения колонки иммобилизованный на сорбенте пропептид выделяемого и очищаемого белка.

В тех случаях, когда получение природного пропептида связано с трудностями, можно использовать иммобилизованный рекомбинантный пропептид. Для повышения эффективности хроматографического выделения и очистки белка можно прибегать к использованию модифицированного пропептида. Модификации могут быть направлены на изменение сродства пропептида к целевому белку или на введение дополнительных структурных элементов, облегчающих иммобилизацию пропептида.

Ниже приведены примеры реализации изобретения.

Пример 1. Очистка природной металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27а с использованием пропептида металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27a. Суспендировали 2 г CNBr-активированной агарозы в 10 мл холодной (4°C) 1 мМ HCl. Сорбент промыли на стеклянном фильтре 400 мл холодной (4°C) 1 мМ HCl и затем перенесли в 8 мл раствора природного пропептида металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27a (1 мг/мл) в 0,2 М NaHCO₃, 0,5 М NaCl (pH 8,3). Для получения иммобилизованного пропептида (сорбента) полученную смесь инкубировали при перемешивании 16 ч при 4°C, после чего полученный сорбент переносили в 0,2 М раствор глицина (pH 8,0) и выдерживали 2 ч при 20°C. Сорбент промыли 5 раз попеременно 50 мл 0,2 М NaHCO₃, 0,5 М NaCl (pH 8,3) и 50 мл 0,1 М уксусной кислоты, 0,5 М NaCl (pH 4), а затем 100 мл 50 мМ трис-(гидроксиметил)аминометан-HCl (ТРИС-HCl) буферного раствора (pH 7,5). Полученную агарозу с иммобилизованным пропептидом металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27a (2 мг/мл сорбента) использовали для очистки металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27a. Для этого через колонку (1,5×2 см) с иммобилизованным пропептидом металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27a с объемной скоростью 2 мл/мин пропускали 300 мл культуральной жидкости штамма Thermoactinomyces species 27a. Затем колонку промывали 50 мл 50 мМ ТРИС-HCl буферного раствором (pH 7,5), содержащего 300 мМ NaCl. Очищенный белок элюировали 10% раствором изопропанола в том же буфере.

Выход очищенной металлопротеиназы в 3,5 раза превышал ее выход при использовании известного способа [1]. При этом процесс проходит в одну стадию.

Пример 2. Очистка рекомбинантной металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27a с использованием модифицированого пропептида металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27a, несущего дополнительную последовательность из шести остатков гистидина на амино-конце молекулы. К 5 мл Ni²⁺-(нитрилтриуксусная кислота)-агарозы, уравновешенной 50 мМ ТРИС-HCl буферным раствором (pH 8,0), содержащим 300 мМ NaCl, добавляли 25 мл раствора модифицированного пропептида металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27a, несущего дополнительную последовательность из шести остатков гистидина на амино-конце молекулы, в том же буфере (концентрация пропептида 1 мг/мл). Суспензию выдерживали, периодически перемешивая, 2 ч при 4°C, а затем переносили в колонку и промывали 50 мл 50 мМ ТРИС-HCl буферного раствора (pH 8,0), содержащего 300 мМ NaCl. Полученную Ni²⁺-(нитрилтриуксусная кислота)-агарозу с иммобилизованным модифицированным пропептидом металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27a, несущим дополнительную последовательность из шести остатков гистидина на амино-конце молекулы (4 мг/мл сорбента), использовали в качестве сорбента для очистки рекомбинантной металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27a. Для этого через колонку (1,5×2,5 см) с полученным иммобилизованным пропептидом металлопротеиназы Thermoactinomyces species 27a, несущим дополнительную последовательность из шести остатков гистидина на амино-конце молекулы, с объемной скоростью 2 мл/мин пропускали 300 мл культуральной жидкости штамма Bacillus subtilis AJ73 (р31), pH которой предварительно доводили до 8 добавлением 1М NaOH. Затем колонку промывали 50 мл 50 мМ ТРИС-HCl буферного раствора (pH 8,0), содержащего 300 мМ NaCl. Очищенный белок элюировали 10% раствором изопропанола в том же буфере.

Выход целевого продукта - рекомбинантной металлопротеиназы был в 4 раза выше, чем выход этого же белка при использовании известного способа [1]. При этом процесс проходит в одну стадию.

Пример 3. Очистка рекомбинантной глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius с использованием иммобилизованного модифицированного пропептида глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius, несущего целлюлозосвязывающий домен CelD эндоглюканазы Anaerocellum thermophilum на амино-конце молекулы. К 5 мл микрокристаллической целлюлозы для колоночной хроматографии, уравновешенной 50 мМ ТРИС-HCl буферным раствором (pH 8,5), добавляли 20 мл раствора (в том же буфере) модифицированного пропептида глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius, несущего целлюлозосвязывающий домен CelD эндоглюканазы Anaerocellum thermophilum на амино-конце молекулы. Концентрация пропептида 0,5 мг/мл. Суспензию выдерживали, периодически перемешивая, 2 ч при 4°С, а затем переносили в колонку и промывали 50 мл 50 мМ ТРИС-HCl буферного раствора (pH 8,5). Полученную целлюлозу с иммобилизованным модифицированным пропептидом глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius, несущим целлюлозосвязывающий домен CelD эндоглюканазы Anaerocellum thermophilum на амино-конце молекулы (2 мг/мл сорбента), использовали для очистки глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius. Для этого через колонку (1,5×2,5 см) с иммобилизованным модифицированным пропептидом глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius, несущим целлюлозосвязывающий домен CelD эндоглюканазы Anaerocellum thermophilum на амино-конце молекулы, с объемной скоростью 2 мл/мин пропускали 300 мл культуральной жидкости штамма Bacillus subtilis AJ73 (р58.21), pH которой предварительно доводили до 8,5 добавлением 1М NaOH. Затем колонку промывали 50 мл 50 мМ ТРИС-HCl буферного раствора (pH 8,5). Очищенный белок элюировали 0,5 М раствором NaCl в том же буфере. Выход целевого продукта в 2 раза выше, чем при использовании известного способа [2] выделения и очистки этого же белка. При этом процесс проводится в одну стадию.

Пример 4. Очистка субтилизина с использованием модифицированного пропептида субтилизина.

Использовали пропептид субтилизина с мутацией Glu⁵³-Asp. Для его иммобилизации 2 г агарозы CNBr-активированной агарозы суспендировали в 10 мл холодной (4°С) 1 мМ HCl. Сорбент промывали на стеклянном фильтре 400 мл холодной (4°С) 1 мМ HCl и затем переносили в 8 мл раствора пропептида субтилизина с мутацией Glu⁵³-Asp (0,8 мг/мл) в 0,2 М NaHCO₃, 0,5 М NaCl (pH 8,3). Полученную смесь инкубировали при перемешивании 16 ч при 4°С, после чего сорбент переносили в 0,2 М раствор глицина (pH 8,0) и выдержали 2 ч при 20°С. Сорбент промывали 5 раз попеременно 50 мл 0,2 М NaHCO₃, 0,5 М NaCl (pH 8,3) и 50 мл 0,1 М уксусной кислоты, 0,5 М NaCI (pH 4), а затем 100 мл 50 мМ ТРИС-HCl буферного раствора (pH 8,3). Полученную агарозу с иммобилизованным пропептидом субтилизина с мутацией Glu⁵³-Asp (1,5 мг/мл сорбента) использовали для очистки субтилизина. Для этого через колонку (1,5×2 см) с иммобилизованным пропептидом субтилизина с мутацией Glu⁵³-Asp с объемной скоростью 2 мл/мин пропускали 300 мл культуральной жидкости штамма Bacillus subtilis 168, pH которой предварительно доводили до 8,3 добавлением 1М NaOH. Затем колонку промывали 50 мл 50 мМ ТРИС-HCl буферного раствором (pH 8,3). Очищенный белок элюировали раствором пропептида субтилизина с мутацией Glu⁵³-Asp (1,2 мг/мл) в том же буфере.

Выход целевого продукта в 3 раза превышал выход сублицина, получаемого известным способом [3]. При этом процесс проводится в одну стадию.

Таким образом, способ согласно изобретению расширяет ассортимент средств, применяемых для хроматографического выделения и очистки белков. Способ реализуется в одну стадию и обеспечивает высокий выход очищаемого белка.

Изобретение относится к биотехнологии. Способ включает двухэтапное приготовление комплекса, состоящего из выделяемого и очищаемого белка с иммобилизованным на сорбенте пропептидом этого белка, выделение белка элюцией из полученного комплекса. На первом этапе приготовления комплекса получают иммобилизованный на сорбенте пропептид выделяемого и очищаемого белка. На втором этапе приготовления комплекса осуществляют контакт выделяемого и очищаемого белка с иммобилизованным на сорбенте его пропептидом путем пропускания раствора этого белка через заполненную колонку. Способ позволяет расширить ассортимент средств, применяемых для выделения и очистки белков, упростить процесс, повысить его эффективность за счет повышения выхода целевого продукта. 6 з.п. ф-лы.

1. Способ хроматографического выделения и очистки белка, включающий двухэтапное приготовление комплекса, состоящего из выделяемого и очищаемого белка с иммобилизованным на сорбенте пропептидом этого белка, и последующее выделение белка элюцией из полученного комплекса, отличающийся тем, что на первом этапе приготовления комплекса получают иммобилизованный на сорбенте пропептид выделяемого и очищаемого белка, который помещают в колонку с получением заполненной колонки, на втором этапе приготовления комплекса осуществляют контакт выделяемого и очищаемого белка с иммобилизованным на сорбенте его пропептидом путем пропускания раствора этого белка через заполненную колонку, а элюцию очищенного белка осуществляют из колонки.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что выделяют и очищают природный, рекомбинантный, мутантный или модифицированный белок.3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что используют природный, рекомбинантный, мутантный или модифицированный пропептид выделяемого и очищаемого белка.4. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что выделяют и очищают металлопротеиназу Thermoactinomyces species 27a, используют ее природный пропептид, иммобилизованный на агарозе, а элюируют ее с колонки 10%-ным раствором изопропанола в 50 мМ ТРИС-HCl буферном растворе pH 7,5.5. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что выделяют и очищают металлопротеиназу Thermoactinomyces species 27a, используют иммобилизованный на агарозе ее модифицированный пропептид, несущий дополнительную последовательность из 6 остатков гистидина на амино-конце молекулы, а элюируют ее с колонки 10%-ным раствором изопропанола в 50 мМ ТРИС-HCl буферном растворе pH 8,0.6. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что выделяют и очищают глутамилэндопептидазу, продуцируемую Bacillus intermedius, используют ее иммобилизованный на микрокристаллической целлюлозе модифицированный пропептид, несущий на амино-конце молекулы целлюлозосвязывающий домен CelD эндоглюканазы, продуцируемой Anaerocellum thermophilum, а элюируют глутамилэндопептидазу с колонки 0,5 М раствором NaCl в 50 мМ ТРИС-HCl буферном растворе pH 8,5.7. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что выделяют и очищают субтилизин, используют иммобилизованный на агарозе его пропептид с мутацией Glu⁵³-Asp, а элюируют субтилизин с колонки раствором его пропептида с мутацией Glu⁵³-Asp в 50 мМ ТРИС-HCl буферном растворе pH 8,3.