СПОСОБ ИЗУЧЕНИЯ СУТОЧНОГО РИТМА ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ДРЕВЕСНЫХ РАСТЕНИЙ Российский патент 2009 года по МПК A01G7/00 

Изобретение относится к области цитогенетики и может быть применено для прогнозирования суточных ритмов цитогенетических показателей на основе полученных экспериментальных данных.

При проведении изучения суточных ритмов цитогенетических показателей семенного потомства дуба черешчатого и сосны обыкновенной обычно проводят фиксацию материала для цитологических исследований в течение суток с интервалом два часа, для березы повислой через каждые три часа, после чего по описанной ранее методике изготовляли давленные микропрепараты и анализировали на них с применением светового микроскопа цитогенетические показатели семенного потомства древесных растений. В результате получают значения цитогенетических показателей в каждый из исследованных часов, строят графики зависимости по экспериментальным данным и делают вывод об изменении в течение суток цитогенетической характеристики (Калаев В.Н. Цитогенетический мониторинг загрязнения окружающей среды с использованием растительных тест-объектов: Автореф. дис. … канд.биол.наук. - Воронеж, 2000. - 25 с.; Вострикова Т.В. Цитоэкология березы повислой (Betula pendula Roth): Автореф. дис. … канд.биол.наук. - Воронеж, 2002. - 24 с.; Дорошев С.А. Влияние антропогенных стрессов на изменчивость цитогенетических показателей у сосны обыкновенной: Автореф. дис. … канд.биол.наук. - Воронеж, 2004. - 23 с.; Butorina A.K., Kalaev V.N. Diversity of Cytological Characteristics in Oak Under Normal Conditions // Diversity and Adaptation in Oak Species. Proceedings of a conference of IUFRO Working Partu 2.08.05 held Oct.12-17, 1997, College of Agricultural Sciences, The Pennsylvania State University, University Park, Pennsylvania, U.S.A. - Pennsylvania, 1998. - P.46-48).

Данные способы изучения суточных ритмов цитогенетических показателей довольно трудоемки и высокозатратны, так как требуют получения большого числа экспериментальных показателей, большой расход времени и средств.

Заявляемое изобретение основано на возможности прогнозирования цитогенетических показателей по экспериментально полученным данным.

Технический результат заключается в упрощении способа, сокращении времени и расходов на проведение цитогенетического обследования.

Технический результат достигается тем, что в способе изучения суточного ритма цитогенетического показателя древесных растений, заключающемся в фиксации материала для цитологических исследований, изготовлении микропрепарата, получении значений цитогенетических показателей, построении графической зависимости показатель - время, по которой судят о суточном ритме данного показателя, согласно изобретению однократно по экспериментально полученным данным определяют в любом из исследуемых часов значение цитогенетического показателя, а другие значения этого показателя в любое время суток определяют по формуле

где N - степень полинома, j=1…M, где M - число точек наблюдения, а_i - коэффициенты полинома, полученные в рамках метода наименьших квадратов, y_j - значения экспериментально полученных цитогенетических показателей, x_j - моменты времени, в которые проводится наблюдение, y_n - значение прогнозируемого цитогенетического показателя, x_n - момент времени, в который проводится прогноз.

Значения коэффициентов определяются отдельно для каждого из цитогенетических показателей на основе метода наименьших квадратов (МНК).

В предложенном способе на основе одного полученного экспериментального значения цитогенетического показателя проводят расчет этого показателя на весь суточный промежуток времени в рамках метода наименьших квадратов.

Нами была проведена работа по исследованию суточного ритма цитогенетических показателей березы повислой и сосны обыкновенной.

На основе полученных экспериментальных данных проводилось построение теоретической модели для семенного потомства березы повислой и сосны обыкновенной. Строились зависимости значений цитогенетических показателей от времени в виде алгебраических степенных полиномов. Для этого сначала проводилось измерение показателей в заданном временном интервале (сутки), с заданной дискретизацией (одно измерение в 2 часа). Рассчитывались коэффициенты полиномов, используемые для описания суточных ритмов цитогенетических показателей семенного потомства деревьев березы повислой и сосны обыкновенной (таблицы на фиг.3, 4).

Далее на основе МНК была выведена аналитическая зависимость в виде формулы

где N - степень полинома, j=1…M, где M - число точек наблюдения, a_i - коэффициенты полинома, полученные в рамках метода наименьших квадратов, y_j - значения экспериментально полученных цитогенетических показателей, x_j - моменты времени, в которые проводится наблюдение, y_n - значение прогнозируемого цитогенетического показателя, x_n - момент времени, в который проводится прогноз.

Значения коэффициентов определяются отдельно для каждого из цитогенетических показателей на основе МНК.

Данные, полученные на основе теоретико-экспериментальной модели, сравнивались с результатами контрольного эксперимента. Сравнение результатов модели и контроля проводили с заданными требованиями по абсолютной и относительной ошибке и рассчитывались доверительные интервалы для каждого цитогенетического показателя.

На основе построенной экспериментально-теоретической модели возможно определение цитогенетических показателей при других значениях экспериментальных данных в заданные моменты времени.

На фиг.1 - суточные ритмы - митотическая активность, % (а); митотическая активность без профаз % (б); доля профаз, % (в); доля метафаз, % (г) для березы повислой, где кривая 1 - эксперимент, кривая 2 - прогноз.

На фиг.2 - суточные ритмы - митотический индекс, % (а); доля клеток на стадии профазы, % (б) сосны обыкновенной из Усманского бора, где кривая 1 - эксперимент, кривая 2 - прогноз.

На фиг.3 приведены коэффициенты полинома, использованного для описания суточных ритмов цитогенетических показателей семенного потомства деревьев березы повислой.

На фиг.4 приведены коэффициенты полинома, использованного для описания суточных ритмов цитогенетических показателей семенного потомства деревьев сосны обыкновенной.

На фиг.5 приведены доверительные интервалы для значений цитогенетических показателей березы повислой (min, max).

На фиг.6 приведены доверительные интервалы для значений ядрышковых характеристик сосны обыкновенной (min, max).

На фиг.7 - суточный ритм митотической активности семенного потомства сосны обыкновенной.

На фиг.8 - суточный ритм клеток с 5 ядрышками в ядре у семенного потомства сосны обыкновенной.

На фиг.9 - суточный ритм митотической активности, подсчитанной без учета профаз, семенного потомства березы повислой.

Были исследованы суточные ритмы для 19 цитогенетических показателей, характеризующих березу повислую: Митотическая активность, %, Митотическая активность без профаз, %, Доля профаз, %, Доля метафаз, %, Доля анафаз-телофаз, %, Патологии митоза, %, Патологии митоза без профаз, %, Остаточные ядрышки, %, Площадь одиночн. ядрышек, мкм, Площ. ядрыш. "кора-сердц.", мкм, Площ. ядрыш. "кора-сердц.вакуол.", мкм, Доля клеток с ядрышк. "кора-сердц.", %, Доля кл-к с ядрышк. "кора-сердц. вакуол.", %, Доля кл-к с ядрышк. "компактн.", %, Доля клеток с 2 ядрышками, %, Доля клеток с 3 ядрышками, %, Доля клеток с 4 ядрышками, %, Доля клеток с 5 ядрышками, %, Суммарн. доля многоядрышк. клеток, %.

Максимальная относительная ошибка при прогнозировании не превосходила 5%. Были рассчитаны доверительные интервалы значений для каждого показателя с интервалом в два часа (таблица на фиг.5).

Были исследованы суточные ритмы цитогенетических показателей, характеризующих семенное потомство сосны обыкновенной из Усманского бора: Митотический индекс, %, Доля клеток на стадии профазы, %, Доля клеток на стадии метафазы, %, Доля клеток на стадии анафазы-телофазы, %, Патология митоза, %, Частота встречаемости микроядер, %.

Максимальная относительная ошибка при прогнозировании не превосходила 5%. Были рассчитаны доверительные интервалы значений для ядрышковых характеристик с интервалом в один час (таблица на фиг.6).

Пример

В качестве материала для цитогенетических исследований были использованы корешки проростков семян березы повислой и сосны обыкновенной (один корешок - один препарат). Изготовлено по 10 микропрепаратов корешков проростков семян березы повислой и сосны обыкновенной.

По достижении корешками проростков длины 0,5 см их фиксировали в ацетоалкоголе (смесь 96%-ного этилового спирта и ледяной уксусной кислоты 3:1) и хранили при температуре +4 С.

Перед приготовлением микропрепаратов материал обрабатывали по следующей схеме:

- для мацерации тканей кончики корешков помещали в 18%-ную соляную кислоту и подогревали (несколько раз до температуры 60°С);

- материал ополаскивали 45%-ной уксусной кислотой;

- заливали красителем ацетогематоксилином апикальные части корня проростков при комнатной температуре. Время нахождения в красителе - 40 минут;

- отдифференцировали от избыточного красителя дистиллированной водой.

Отрезали кончик корешка и помещали на предметное стекло в каплю жидкости Гойера. Слегка раздавливали корешок препаравальной иглой и накрывали покровным стеклом. Препарат подогревали (но не сильно) над пламенем горелки и раздавливали спичкой поверх покровного стекла, добиваясь равномерного распределения клеток на микропрепарате.

Просмотр микропрепаратов осуществляли на микроскопах LABOVAL-4, JENOVAL (Карл Цейс, Йена) при общем увеличении 40×2,5×10 и 100×2,5×10.

При исследовании препаратов учитывали общее количество просмотренных клеток (не менее 700 клеток на каждом препарате).

На основании результатов экспериментов нами было получено значение митотической активности семенного потомства березы повислой в 12 часов, равное 8,3%. Т.к. полученное значение этого показателя попадает в доверительный интервал значений для нашего времени (см. таблицу на фиг.5), то рассчитав значения коэффициентов полинома a_i для этого показателя и используя полученную зависимость для

мы построили кривую для суточного ритма указанного показателя (фиг.7).

Также было получено значение митотической активности, подсчитанной без учета профаз, семенного потомства березы повислой в 8 часов утра, равное 4,2%. Полученное значение этого показателя не попадает в интервал допустимых значений для нашего времени (см. таблицу на фиг.5), рассчитав значения коэффициентов полинома a_i для этого показателя и используя полученную зависимость для

мы построили кривую для суточного ритма указанного показателя (фиг.9), которая не позволяет точно описать суточный ритм для данного показателя.

Для изучения ядрышковых характеристик в клетках корневой меристемы семенного потомства сосны обыкновенной производили измерение диаметра ядрышек с помощью окулярмикрометра (анализировали по 200 клеток на каждом микропрепарате).

На основании результатов экспериментов нами было получено значение процента клеток с 5 ядрышками в ядре у семенного потомства сосны обыкновенной в 15 часов, равное 21,1%. Т.к. полученное значение этого показателя попадает в интервал допустимых значений для нашего времени (см. таблицу на фиг.6), то рассчитав значения коэффициентов полинома a_i для этого показателя и используя полученную зависимость для

мы построили кривую для суточного ритма указанного показателя (фиг.8).

Изобретение относится к области цитогенетики. В способе фиксируют материал для цитологических исследований, изготавливают микропрепарат, получают значения цитогенетических показателей. Строят графическую зависимость показатель - время, по которой судят о суточном ритме данного показателя. При этом однократно получают экспериментальное значение изучаемого показателя в любом из исследуемых часов, а другие значения этого показателя определяют в любое время суток по формуле:

где N - степень полинома, j=1…M, где M - число точек наблюдения, а_i - коэффициенты полинома, полученные в рамках метода наименьших квадратов, y_j - значения экспериментально полученных цитогенетических показателей, x_j - моменты времени, в которые проводится наблюдение, y_n - значение прогнозируемого цитогенетического показателя, x_n - момент времени, в который проводится прогноз. Способ позволяет сократить время проведения цитогенетического обследования. 9 ил.

Способ изучения суточного ритма цитогенетического показателя древесных растений, заключающийся в фиксации материала для цитологических исследований, изготовлении микропрепарата, получении значений цитогенетических показателей, построении графической зависимости показатель - время, по которой судят о суточном ритме данного показателя, отличающийся тем, что однократно получают экспериментальное значение изучаемого показателя в любом из исследуемых часов, а другие значения этого показателя определяют в любое время суток по формуле:

где N - степень полинома, j=1…M, где M - число точек наблюдения, а_i - коэффициенты полинома, полученные в рамках метода наименьших квадратов, y_j - значения экспериментально полученных цитогенетических показателей, x_j - моменты времени, в которые проводится наблюдение, y_n - значение прогнозируемого цитогенетического показателя, x_n - момент времени, в который проводится прогноз.