УСТРОЙСТВО ДОСТАВКИ И АНАЛИЗА БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОБ И СПОСОБ ЕГО ИЗГОТОВЛЕНИЯ Российский патент 2008 года по МПК C12Q1/00 G01N33/48 

Описание патента на изобретение RU2323978C1

Изобретение относится к биотехнологиям, в частности к устройству и изготовлению матриц биочипов, а также устройств их заполнения, используемых для анализа биологических проб.

Известно устройство (United States Patent N US 6.458.584 BI, Oct., 2002) биочипа, которое представляет собой стеклянную пластинку, на которой нанесено множество площадок в виде ямок из геля, в которые вносят капельки проб. Затем биочип сканируют лазерным лучом и анализируют интенсивность спектров флуоресценции. При этом процесс заполнения биологическими пробами является трудоемким.

В устройстве по патенту US.6.656.725 B2, Dec.2, 2003 биочип реализован на основе миниатюрных гелей, которые физически разделены на стеклянной подложке, а пространство между ними заполнено гидрофобным веществом, уменьшающим взаимодействие между соседними микрогелями. Размеры могут варьировать от 10×10 мкм до 1×1 мм, что позволяет создавать чипы с различным числом проб. Однако процесс изготовления и использования данного устройства представляется технологически сложным.

Известны способ микродозирования водных растворов веществ на носитель и устройство для его осуществления (RU 2041263, С12Q 1/68 от 09.08.95). Для осуществления данного способа предложено устройство доставки в виде основания в форме пластины, на одной стороне которой закреплено одними концами множество транспортирующих стержневых элементов, торцевые поверхности свободных концов которых расположены в одной плоскости, и матрица-носитель в виде плоскопараллельной пластины.

Реализация данного способа заключается в том, что осуществляют смачивание торцевой поверхности транспортирующих стержневых элементов раствором вещества, образование на этих поверхностях дозы вещества, последующее перенесение и соприкосновение нанесенных доз вещества с поверхностью матрицы-носителя.

Данные устройство и способ позволяют образовать и расположить в определенном порядке на матрице-носителе анализируемые пробы, но возможность увеличения количества анализируемых проб в данном устройстве ограничена размерами стержней транспортирующих элементов, их размещением по отношению друг к другу, а также необходимостью удаления проб друг от друга для исключения взаимопроникновения анализируемых проб.

Наиболее близким к предлагаемому устройству для анализа биологических проб является многофункциональный микроканальный чип для биологических исследований (US 6.643.010 В2, 4 ноября, 2003 г.), выполненный в виде плоскопараллельной пластины из стекла с множеством сквозных капилляров от одного торца к другому. Поскольку диаметр отверстий капилляров составляет от 0,03 до 10 мкм, то это позволяет разместить достаточно большое число капилляров на малой площади. После заполнения капилляров пластину с анализируемыми пробами подвергают анализу в проходящем излучении. При этом точное однозначное расположение капилляров позволяет автоматизировать процесс анализа, а множественность анализируемых проб повышает достоверность проводимых анализов. За счет малого объема каналов ускоряется процесс проводимых анализов биопроб.

Данное техническое решение предполагает поочередное заполнение капилляров пластины с помощью одноканального устройства доставки, например шприцевого дозатора с иглой, управляемого роботизированным устройством. Это усложняет процесс заполнения капилляров.

Известен способ изготовления поликапиллярной жесткой волоконно-оптической структуры (RU 2096353 CI от 20.11.97 г.), включающий укладку исходного пакета заготовки из стеклотрубок и стержней, многократную перетяжку собранного пакета, формование конусообразной формы (в форме луковицы) из полученной заготовки жесткой поликапиллярной структуры с последующей ее разрезкой на параллельные пластины, используемые для различных оптических систем.

Данное техническое решение позволяет получать поликапиллярные структуры разнообразной формы, профиля и направления каналов в ней. Однако в данном техническом решении отсутствуют предложения по способу использования поликапиллярных структур для изготовления устройств доставки и анализа биологических проб.

Задачей изобретения является повышение технологичности изготовления и надежности использования матриц биочипа, увеличение плотности проб на матрице биочипа, обеспечение требуемых характеристик каналов.

Поставленная задача достигается тем, что в устройстве для доставки и анализа биологических проб, состоящем из матрицы в виде плоскопараллельной пластины со сквозными отверстиями и устройства доставки с каналами транспортирования, устройство доставки выполнено в виде монолитного усеченного конуса с внутренними сквозными отверстиями от основания к вершине, при этом входы отверстий на пластине и выходы отверстий на вершине усеченного конуса устройства доставки совпадают при совмещении, причем отверстия на пластине и на устройстве доставки расположены отдельными группами, разделенными друг от друга по замкнутому периметру сплошными стенками с плоскими поверхностями на торцах пластины, а также на основании и вершине усеченного конуса устройства доставки, при этом плоские торцевые поверхности разделительных стенок вокруг групп выходных отверстий на вершине конуса и вокруг групп входных отверстий на пластине совпадают при совмещении отверстий и тем самым изолируют отдельные группы отверстий друг от друга, исключая взаимопроникновение анализируемых проб.

При этом в разделительных стенках пластины и устройства доставки могут быть выполнены дренажные каналы, объединенные между собой сетью канавок, расположенных на торцах разделительных стенок и охватывающих по периметру каждую группу входных и выходных отверстий, что повышает надежность изоляции групп отверстий друг от друга.

Точное совмещение каналов транспортирования устройства доставки и отверстий под пробы на пластине матрицы биочипа обеспечивается путем формирования исходного пакета-заготовки из стеклотрубок и стержней, многократной перетяжки исходной заготовки до образования жесткой поликапиллярной структуры конусообразной формы, имеющей плавный переход на сечение с постоянными геометрическими размерами и формой, из которой нарезают плоскопараллельные пластины - матрицы биочипа, а из конусообразной части структуры с участком перехода на постоянное сечение изготавливают устройство доставки, при этом изготовленные из одной и той же структуры устройство доставки и матрицы биочипа используют совместно.

Заполнение отверстий в пластине происходит под действием перепада давления, либо за счет разряжения, либо за счет избыточного давления.

На фиг.1 представлена матрица биочипа.

На фиг.2 показано сечение матрицы.

На фиг.3 фрагмент матрицы в увеличенном масштабе.

На фиг.4 изображено устройство доставки.

На фиг.5, 6 показаны виды торцевых поверхностей устройства доставки.

На фиг.7, 8 представлен процесс транспортировки биологических проб к матрице биочипа.

На фиг.9, 10, 11 представлена матрица биочипа с дренажными каналами.

На фиг.12, 13, 14 изображено устройство доставки с дренажными каналами.

На фиг.15 представлен процесс транспортирования биологических проб к матрице биочипа при наличии дренажных каналов.

На фиг.16, 17 представлена жесткая поликапиллярная структура, от которой механически отделяют конусообразную часть и переход на участок с постоянными геометрическими размерами от остального протяженного участка с постоянными геометрическими размерами.

Матрица биочипа представляет собой плоскопараллельную пластину 1 из стекла, внутри которой от торца 2 к торцу 3 выполнены сквозные отверстия 4. Отверстия 4 выполнены таким образом, что они образуют на торцах пластины множество отделенных друг от друга групп 5. В представленном на фиг.1 случае группы отверстий имеют форму шестигранников. При этом каждая группа отверстий отделена друг от друга по замкнутому периметру сплошными разделительными стенками 6, образующими на торцах пластины замкнутые по периметру вокруг каждой из групп отверстий плоские поверхности 7.

Изображенное на фиг.4 устройство доставки биологических проб представляет собой тело со сложной конусообразной (или асимметричной, параболической) формой боковых поверхностей 8 или плоскопараллельными торцевыми поверхностями 9, 10 соответственно на вершине (узкой части) и основании (широкой части) конуса.

Внутри тела устройства доставки выполнены каналы транспортирования биологических проб в виде сквозных отверстий 11 с переменной площадью поперечного сечения, а также переменным радиусом кривизны по отношению к продольной оси симметрии тела устройства доставки.

На поверхности основания конуса 10 (широкой части) устройства доставки каналы транспортирования имеют входные отверстия 12, а на торцевой поверхности 9 (вершине) конуса - соответствующие выходные отверстия 13. При этом площадь сечения выходных отверстий существенно меньше площади входных отверстий 12. Выходные отверстия 14 каналов транспортирования сформированы на торцевой поверхности 9 конуса в виде множества групп 14 (в представленном случае в форме шестигранника), отделенных друг от друга сплошными разделительными стенками 15, образующих на торце 9 вокруг каждой группы отверстий 14 замкнутые по периметру плоские поверхности 16. При этом форма, размеры, расположение каждого входного отверстия 13, групп отверстий 14, а также замкнутых торцевых поверхностей 16, разделительных стенок на вершине 9 конуса устройства доставки зеркально соответствуют форме, размерам и расположению входных отверстий 4, группам отверстий 5 и замкнутым вокруг групп отверстий поверхностям 7 разделительных стенок на торце пластины 1 матрицы биочипа.

Предлагаемое устройство может использоваться следующим образом.

Вначале (см. фиг.7) каналы транспортирования 11 устройства доставки заполняются необходимыми составами (растворами) биологических проб. При этом каждая группа 14 каналов транспортирования, заключенная внутри замкнутых по периметру сплошных стенок 16, заполняется одним и тем же составом. Заполнение может осуществляться, например, посредством шприцевых дозаторов во входные отверстия на торце 10 каналов транспортирования. Т.к. отверстия на входе каналов транспортирования имеют большое сечение, то это можно выполнять как в ручном, так и в автоматическом режиме.

После заполнения каналов 11 устройства доставки осуществляют взаимную ориентацию входных отверстий на пластине 1 матрицы биочипа и входных отверстий 13 на устройстве доставки. Взаимная ориентация может осуществляться, например, путем центровки наружных диаметров цилиндрической части устройства доставки и пластины матрицы биочипа с помощью обоймы 17 и одновременной их ориентацией по углу за счет установки штифтов 18 в специальные пазы 19, выполненные на наружных поверхностях пластинки и устройства доставки. Сориентированные устройства доставки и пластина матрицы биочипа поджимаются торцами друг к другу (см. фиг.8), на широкий торец устройства доставки устанавливается крышка 20. Между торцевой поверхностью широкой части устройства доставки и открытым торцом пластинки создается перепад давления путем подачи избыточного давления в полость 20 между крышкой 21 и торцом 10 устройства доставки либо созданием пониженного давления со стороны открытого торца 3 пластины 1.

Под действием перепада давления происходит заполнение отверстий в пластине 1 матрицы биочипа биологическими пробами из каналов транспортирования устройства доставки.

Поскольку выходные отверстия каналов транспортирования соответствуют входным отверстиям матрицы биочипа, то биологические пробы заполняют каналы матрицы биочипа в том же порядке, в каком они расположены в каналах транспортирования устройства доставки. Т.к. каждая группа каналов транспортирования на торце 9 устройства доставки отделена друг от друга замкнутыми по контуру плоскими поверхностями разделительных стенок 15, которые зеркально соответствуют замкнутым плоским поверхностям разделительных стенок 6 на пластине 1 биочипа, то при поджатии устройства доставки и пластины 1 биочипа плоские поверхности разделительных стенок образуют вокруг каждой группы отверстий охранные зоны попадания биологических проб из одной группы отверстий в другую. Это обеспечивает надежность последующего анализа биологических проб на матрице биочипа. После заполнения пластины 1 матрица биочипа отсоединяется от устройства доставки. На ее место устанавливается новая пластина матрицы, которая заполняется в аналогичном порядке.

Заполненные таким образом биопробами матрицы подвергаются анализу известными способами, например в проходящем излучении. При этом строгое соответствие расположения отверстий на матрицах биочипа позволяет автоматизировать процесс проведения анализа. Множество заполненных отверстий на пластине матрицы повышает надежность и достоверность проводимых анализов, а малые объемы каналов ускоряют процесс проведения анализа биопроб.

В представленном на фиг.9, 10, 11 устройстве матрицы биочипа, а на фиг.12, 13, 14 - устройстве доставки биологических проб предусмотрены на разделительных стенках 6, 15 дренажные каналы 22, 23 и объединяющие их канавки 24, 25, предназначенные для более надежного исключения проникновения в процессе транспортирования биологических проб из одной группы отверстий 5 в другую.

В этом случае в пластине матрицы биочипа на фиг.9, 10, 11 в разделительных стенках 6, вокруг каждой из групп отверстий 5 выполнены дренажные отверстия 22, которые по торцам 2, 3 объединены между собой сетью канавок 24.

На устройстве доставки (см. фиг.12, 13, 14) в разделительных стенках 15 вокруг каждой группы отверстий 14 выполнены дренажные каналы 22, которые по торцам 9, 10 объединены между собой сетью канавок 25.

При использовании данного устройства (см. фиг.15) в крышке 21 выполненные каналы 26, через которые создается перепад давления в полостях 20 между крышкой 21 и группами каналов транспортирования. При этом в крышке 21 дополнительно выполнена сеть каналов 27, объединяющая полости 28 над канавками 25 и дренажными каналами 23 со стороны входного торца 10 устройства доставки.

Со стороны выходного торца 9 устройства доставки при поджатии пластины 1 биочипа канавки 25 на устройстве доставки и канавки 24 на пластине 1 образуют полости 28, объединяющие между собой выходы дренажных каналов 23 устройства доставки с входами дренажных каналов 22 матрицы биочипа. При этом между пластиной 1 и обоймой 17 установлена дополнительная технологическая пластина 29, аналогичная пластине 1, между которыми также образуются полости 30, объединяющие между собой дренажные каналы на пластинах 1 и 29.

Данное устройство функционирует следующим образом. Под действием перепада давления в полостях 20 и на выходном торце пластины 29 биологические пробы из каналов транспортирования устройства доставки подаются в отверстия на пластине 1. При этом через дренажные каналы устройства доставки и пластины 1, 29 прокачивается либо газ (воздух), либо раствор. В случае, если через сопряженные поверхности разделительных стенок устройства доставки и пластины 1, а также пластины 1 и 29 имеет место проникновения биологических проб, то они попадают в полости 28, 30, откуда удаляется потоком газа (или раствора). В результате исключается попадание биологических проб из одной группы заполняемых отверстий в другую.

Работа предлагаемого устройства доставки и анализа биологических проб основана на соответствии каналов и разделительных стенок на выходном торце устройства доставки и входном торце пластины матрицы биочипа. Большое число каналов и их малый диаметр (5-10 мкм) ставит задачу о способе изготовления предлагаемого устройства.

Предлагаемый способ изготовления устройства доставки и анализа биологических проб основан на использовании в качестве исходных заготовок стеклянных поликапиллярных структур (фиг.16). Способы изготовления поликапиллярных структур включают сборку исходного пакета-заготовки путем укладки стеклянных трубок и стержней в пакет, затем закрепление одного конца пакета в захвате узла подачи, нагревание в печи другого конца с образованием конусообразной формы (луковицы) и формование стекломассы путем ее перетяжки.

В результате получают поликапиллярную структуру (см. фиг.16) конусообразной формы 31 с одного конца с переходом на протяженный участок 32 с постоянными геометрическими размерами и формой. Внутри данной структуры сформированы сплошные каналы 33 и разделительные стенки 34, причем на участке с постоянными геометрическими размерами расположение и размеры каналов постоянны в разных сечениях.

Затем в полученной структуре (см. фиг.17) механически отделяют конусообразную часть 31 с переходом на участок с геометрическими размерами от остального протяженного участка с постоянными геометрическими размерами и из нее изготавливают шлифовкой и полировкой торцов устройство доставки. Оставшийся участок с постоянными геометрическими размерами разрезают на ряд плоскопараллельных пластинок 35, из которых после шлифовки и полировки торцов получают матрицы биочипов. В последующем при использовании полученные устройство доставки и матрицы биочипов используются совместно, т.е. заполнение матриц биочипов осуществляют от устройства доставки, полученных из одной и той же поликапиллярной структуры. Это обеспечивает точное совпадение выходных отверстий и торцов разделительных стенок устройства доставки с входными отверстиями и торцами разделительных стенок пластин матриц биочипов.

Таким образом, предлагаемое техническое решение по устройству доставки и анализу биологических проб на основе жестких поликапиллярных структур и способу их изготовления позволяет упростить технологию изготовления матриц биочипа и устройства транспортирования биологических проб к ним. При этом упрощается процесс заполнения матриц биочипа биологическими пробами, т.к. для этого не используются сложные роботизированные системы. Одновременно за счет повышения числа анализируемых проб, расположенных на матрице биочипа, повышается надежность и достоверность проводимых анализов. Кроме того, однозначное соответствие формы и размеров матриц биочипа и расположенных на них проб позволяет автоматизировать процесс проводимых анализов.

Похожие патенты RU2323978C1

название год авторы номер документа
МНОГОКАНАЛЬНЫЙ НАКОНЕЧНИК ДЛЯ ЭКСТРАКЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ 2013
  • Скибина Юлия Сергеевна
  • Белоглазов Валентин Иванович
  • Тучин Валерий Викторович
  • Капустин Дмитрий Валерьевич
  • Простякова Анна Игоревна
RU2547597C1
Мультифотонное сенсорное устройство 2021
  • Глухов Дмитрий Евгеньевич
  • Скибина Юлия Сергеевна
  • Грязнов Алексей Юрьевич
  • Скибина Нина Борисовна
  • Чайников Михаил Валерьевич
RU2768228C1
Способ изготовления зонных пластин 2022
  • Скибина Юлия Сергеевна
  • Скибина Нина Борисовна
  • Шувалов Андрей Александрович
  • Чайников Михаил Валерьевич
  • Силохин Игорь Юрьевич
  • Асадчиков Виктор Евгеньевич
  • Бузмаков Алексей Владимирович
RU2793078C1
ФЛЮОРЕСЦЕНТНЫЙ СЕНСОР НА ОСНОВЕ МНОГОКАНАЛЬНЫХ СТРУКТУР 2004
  • Хамизов Р.Х.
  • Кумахов М.А.
  • Никитина С.В.
  • Михин В.А.
  • Жигулева Т.И.
  • Авотынш Н.О.
RU2252411C1
Суперконденсаторная ячейка 2016
  • Гороховский Александр Владиленович
  • Гоффман Владимир Георгиевич
  • Жуков Николай Дмитриевич
  • Митрохин Валерий Викторович
  • Скибина Юлия Сергеевна
RU2646531C1
МЕТАЛЛОДИЭЛЕКТРИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА И СПОСОБ ЕЕ ИЗГОТОВЛЕНИЯ 2013
  • Осьмаков Михаил Иванович
  • Ермакова Анна Михайловна
  • Скибина Юлия Сергеевна
  • Малинин Антон Владимирович
  • Белоглазова Елена Валентиновна
  • Карпова Елена Петровна
  • Чайников Михаил Валерьевич
  • Силохин Игорь Юрьевич
RU2558156C2
Способ изготовления стеклометалли-чЕСКОгО эКРАНА, пРЕиМущЕСТВЕННО MAT-РичНыХ РЕшЕТОК 1979
  • Семина Надежда Петровна
  • Скибина Нина Борисовна
  • Малышев Дмитрий Степанович
  • Лебедев Николай Федорович
  • Пшенцов Юрий Анатольевич
  • Белоглазов Валентин Иванович
  • Добров Геннадий Сергеевич
  • Решетаров Владимир Алексеевич
  • Немоляева Надежда Ивановна
SU834799A1
ФОТОННО-КРИСТАЛЛИЧЕСКОЕ ХАЛЬКОГЕНИДНОЕ ВОЛОКНО И СПОСОБ ЕГО ИЗГОТОВЛЕНИЯ 2014
  • Скибина Юлия Сергеевна
  • Шувалов Андрей Александрович
  • Чайников Михаил Валерьевич
  • Силохин Игорь Юрьевич
  • Занишевская Анастасия Андреевна
  • Тучин Валерий Викторович
  • Гюнтер Штейнмаер
RU2552590C1
СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ МИКРОУСТРОЙСТВ ИЗ ПЛАСТИЧЕСКИ ДЕФОРМИРУЕМЫХ МАТЕРИАЛОВ 1995
  • Белоглазов Валентин Иванович
  • Суховеев Сергей Петрович
RU2085523C1
Способ изготовления плоских капилляров 1980
  • Добров Геннадий Сергеевич
  • Белоглазов Валентин Иванович
  • Пшенцов Юрий Анатольевич
  • Малышев Дмитрий Степанович
  • Лебедев Николай Федорович
  • Скибина Нина Борисовна
  • Горчаков Лев Григорьевич
  • Горчаков Юрий Львович
SU967970A1

Иллюстрации к изобретению RU 2 323 978 C1

Реферат патента 2008 года УСТРОЙСТВО ДОСТАВКИ И АНАЛИЗА БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОБ И СПОСОБ ЕГО ИЗГОТОВЛЕНИЯ

Изобретение относится к биотехнологии. Устройство анализа биологических проб выполнено в виде плоскопараллельной пластины с отверстиями. Устройство доставки имеет конусообразную форму с каналами транспортирования. Отверстия на пластине и устройстве доставки выполнены в виде отдельных групп, разделенных друг от друга стенками, совпадающими при их совмещении. Способ изготовления устройства доставки и анализа включает их изготовление из единой поликапиллярной структуры конусообразной формы с плавным переходом у вершины конуса на протяженный участок с постоянным сечением. Из этого участка нарезают плоскопараллельные пластины. Из пластин изготавливают матрицы. Из конусообразной части структуры с оставшимся участком перехода на постоянное сечение изготавливают устройство доставки. Изобретения позволяют упростить технологию изготовления матриц биочипа и устройства доставки биологических проб к ним. При использовании устройства упрощается процесс заполнения матриц, повышается количество одновременно анализируемых проб. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 17 ил.

Формула изобретения RU 2 323 978 C1

1. Устройство доставки и анализа биологических проб, состоящее из матрицы в виде плоскопараллельной пластины со сквозными отверстиями и устройство доставки с каналами транспортирования, отличающееся тем, что устройство доставки выполнено в виде монолитного усеченного конуса с внутренними сквозными отверстиями от основания к вершине, при этом входы отверстий на пластине и выходы отверстий на вершине усеченного конуса устройства доставки совпадают при совмещении, причем отверстия на пластине и на устройстве доставки расположены отдельными группами, разделенными друг от друга по замкнутому периметру сплошными стенками с плоскими поверхностями на торцах пластины, а также на основании и вершине усеченного конуса устройства доставки, при этом плоские торцевые поверхности разделительных стенок вокруг групп выходных отверстий на вершине конуса и вокруг групп входных отверстий на пластине совпадают при совмещении отверстий и тем самым изолируют отдельные группы отверстий друг от друга.2. Устройство доставки и анализа биологических проб по п.1, отличающееся тем, что в разделительных стенках пластины и устройства доставки выполнены дренажные каналы, объединенные между собой сетью канавок, расположенных на торцах разделительных стенок и охватывающих по периметру каждую группу входных и выходных отверстий.3. Способ изготовления устройства доставки и анализа биологических проб по п.1, включающий сборку стеклотрубок и стержней в пакет-заготовку, закрепление одного конца заготовки в захвате узла подачи, нагревание в печи другого конца и формование до образования жесткой поликапиллярной структуры конусообразной формы, отличающийся тем, что формование проводят путем перетяжки до образования жесткой поликапиллярной структуры конусообразной формы с плавным переходом у вершины конуса на протяженный участок с постоянным сечением, из этого участка структуры нарезают плоскопараллельные пластины, из которых изготавливают матрицы биочипа, а из конусообразной части структуры с оставшимся участком перехода на постоянное сечение изготавливают устройство доставки.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2008 года RU2323978C1

US 6643010, 07.02.2002
СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ПОЛИКАПИЛЛЯРНОЙ ЖЕСТКОЙ ВОЛОКОННО-ОПТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ ИЛИ ЭЛЕМЕНТА И УСТРОЙСТВО ДЛЯ УПРАВЛЕНИЯ РЕНТГЕНОВСКИМ И ДРУГИМИ ВИДАМИ ИЗЛУЧЕНИЯ 1994
  • Кумахов Мурадин Абубекирович
RU2096353C1
Кювета для исследования эякулята 1991
  • Еськов Андрей Павлович
  • Лебедев Николай Федорович
  • Белоглазов Валентин Иванович
SU1812964A3

RU 2 323 978 C1

Авторы

Белоглазов Валентин Иванович

Скибина Нина Борисовна

Тучин Валерий Викторович

Скибина Юлия Сергеевна

Даты

2008-05-10Публикация

2006-07-10Подача