МНОГОКАНАЛЬНЫЙ НАКОНЕЧНИК ДЛЯ ЭКСТРАКЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ Российский патент 2015 года по МПК C12M3/00 C12Q1/68 C12N15/10 

Изобретение относится к области молекулярной биологии, к аналитической химии, фармакологической биотехнологии, а именно к многоканальным устройствам, модифицированным нанослоями анилинсодержащих полимеров, и к технологии твердофазной экстракции нуклеиновых кислот, белков, пептидов на основе многоканальных структур, модифицированных слоями полимеров, и может быть использовано в процедурах одностадийного разделения смесей, содержащих нуклеиновые кислоты, белки, пептиды при выделении указанных компонентов из биологических образцов для последующего проведения молекулярно-биологических исследований в лабораториях молекулярно-генетического профиля.

Известны различные микроколоночные методы биосепарации, основанные на использовании спин-колонок или картриджей, пропускание через которые мобильной фазы (т.е. элюента) осуществляют за счет воздействия центробежной силы в центрифуге. Такие микроколонки содержат немодифицированные кремнеземы, модифицированные кремнеземы (с использованием низкомолекулярных и высокомолекулярных модификаторов), синтетические мембраны, полимерные монолиты, полимерные или стеклянные капилляры и т.д.

Как правило, способы разделения и выделения биополимеров основаны на различной растворимости нуклеиновых кислот, белков и полисахаридов. Несмотря на их эффективность, большинство методов разделения многостадийны, трудоемки и часто сопровождаются потерями выделяемого компонента. Это является следствием того, что такие методы основываются на концепции «улавливания» и «удерживания» целевого биополимера сорбентом из смеси на первом этапе разделения с последующей отмывкой от примесей и элюцией целевого компонента из сорбционного материала на последующих этапах.

Известен способ и устройство для молекулярной сепарации и экстракции нуклеиновых кислот US 7.943.393 В2 и US 6.451.260 В1, в котором используют спин-колонки, в виде полипропиленовой трубки с одним или несколькими слоями адсорбента (стекловолокна, стеклянных шариков, полимерных гранул, частиц кремнезема, модифицированных силанами или полимерами и т.д.). В этом патенте представлена реализация классического многостадийного принципа сепарации биомолекул на основе спин-колонок (картриджей), содержащих сорбционный материал, обратимо удерживающий целевой сорбат. Пропускание образца и элюентов (буферных растворов) через спин-колонку (следующим за этапом инкубации) осуществляется путем ее раскручивания на центрифуге до определенной скорости или под действием пониженного или избыточного давления. Процесс выделения, очистки нуклеиновой кислоты в этих случаях основан на способности нуклеиновых кислот обратимо адсорбироваться на поверхности сорбента. Таким образом, спин-колонки имеют, по крайней мере, два существенных недостатка: необходимость использования центрифуги (или специального насоса) и дороговизна автоматизации процесса выделения (очистки) вследствие многостадийности процесса. Кроме того, следует отметить, что такой традиционный подход к выделению нуклеиновых кислот исключает возможность одновременного выделения суммарной белковой фракции (тем более отдельных фракций белков или пептидов) из образца (за счет низкой в этих случаях селективности поверхности адсорбента).

Изготовление многоканальных структур реализуется по волоконной технологии, классические моменты которой описаны в ряде книг [В.Б. Вайнберг, Д.К. Саттаров «Волоконная оптика», Москва, 1965; Н.С. Капани «Волоконная оптика, принципы и применения», Лондон, 1967]. Известные способы волоконной технологии включают изготовление многоканальных структур за счет вытяжек стеклянных трубок, укладки и вновь перетяжки до уменьшения диаметров каналов с последующим спеканием, например GB-PS 1.064.072. В устройстве по патенту US-PS 4.127.398 изложен способ изготовления многоканальных трубчатых структур, где описывается сборка трубок в пакет определенного поперечного сечения, многократная перетяжка в гексагональную структуру до требуемых геометрических размеров, заполнение газом с одновременной запайкой торцов и спекания в трубке. В US-PS 4.010.019, US-PS 4.127.398 описываются сборка трубок, нагрев, перетяжка и формование гексагональной структуры. Известен способ изготовления патент РФ RU№2096353 и DE 4.411.330 А1, в котором изложен способ изготовления многоканальной жесткой структуры или элемента. Способ включает сборку стеклотрубок в пакет-заготовку, закрепление одного конца в захвате узла подачи, нагревание в печи другого конца с образованием луковицы, и формование, отличающийся тем, что в процессе формования осуществляется образование цилиндрической части структуры или элемента путем герметизации пакета стеклотрубок с последующей усадкой при разрежении, а затем вытягивание стекломассы вверх или вниз в зависимости от заданной формы боковой поверхности.

Недостатками известных технических решений являются: технологические проблемы в получении однородных структур с высокой степенью регулярности укладки. Не решены проблемы пограничной деформации капилляров в пакете. При перетяжках возникают разрывы структуры, что недопустимо для многих применений. Технология изготовления, описанная выше, не позволяет получать структуры с диаметрами каналов менее 1 мкм из-за проблем с укладкой шестигранных элементов, сторона которых

становится рифленой, и укладывать такие структуры с соблюдением условий регулярности невозможно, поскольку появляется сдвиг укладываемых структур.

В патенте US 7.118.671 В2 описана поликапиллярная хроматографическая колонка и способ ее изготовления. Согласно этому патенту, поликапиллярная хроматографическая колонка содержит множество изолированных друг от друга параллельных каналов, стенки которых с внутренней стороны покрыты сорбентом, а наружными сторонами сплавлены со стенками соседних каналов. Особенностью колонки является то, что она выполнена в виде совокупности модулей различного уровня, при этом модуль самого низкого уровня представляет собой гексагонально упакованную и имеющую в поперечном сечении вид правильного шестиугольника совокупность каналов, являющуюся результатом совместного вытягивания пучка капилляров в размягченном состоянии. Модуль каждого более высокого уровня представляет собой гексагонально упакованную и имеющую в поперечном сечении вид правильного шестиугольника совокупность модулей предыдущего уровня, являющуюся результатом их совместного вытягивания в размягченном состоянии. Способ изготовления колонок заключается в осуществлении нескольких стадий вытягивания пакетов заготовок, каждая из которых является результатом вытягивания на предыдущей стадии и разрезания получаемого при вытягивании изделия на части определенной длины - заготовки. Недостатком этой конструкции и технологии являются низкие пористость и прочность структуры.

Вышеизложенные способы не позволяют получать однородные структуры с хорошими границами спекания, в структурах наблюдаются деформации каналов, сдвиг укладки, низкая пористость из-за наличия множества обрамлений единичных блоков и отсутствие гарантированной защитной оболочки структуры в целом.

В патенте РФ RU№2300024 описано устройство, которое может быть использовано в средствах для перекачивания малых количеств жидкости, без движущихся механических частей, использующих электрокинетический эффект. Микронасос содержит

поликапиллярную структуру из неэлектропроводного материала со сквозными микроканалами, входы и выходы которых образуют входной и выходной торцы структуры. Такая структура, может быть изготовлена, например, по технологии, описанной в патентах RU №2096353, DE 4.411.330, US 3.923.426, RU №31859.

Наиболее близкими к предлагаемому решению является United States Patent Application Publication US 2007/0017870 A1 и US 2011/0092686 A1, в которых представлены наиболее эффективные методы разделения/выделения/очистки биополимеров, основанные на применении мультикапиллярных систем, модифицированных нанопокрытиями специфических полимеров или низкомолекулярных модификаторов.

В них для разделения и очистки нуклеиновых кислот на внутренние поверхности стенок каждого капилляра наносят нерастворимый сорбционный материал, а затем монолитный капиллярный элемент устанавливают в соответствующий корпус полимерного наконечника. Для работы мультикапиллярное устройство используют со стандартными пипетками, шприцами или аналогичными аналитическими инструментами.

Однако в указанных патентах представлены конструкции мультикапиллярных устройств и методы выделения, основанные на классической концепции связывания, т.е. на первой стадии нуклеиновые кислоты сорбируются на поверхности сорбента (в данном случае на внутренней поверхности капилляров), модифицированной различными стационарными фазами (в основном, неполимерными), затем проводится отмывка (элюция) нуклеиновых кислот. Согласно приведенным примерам пептиды, белки и другие биологические компоненты смеси удаляются на первой стадии, а нуклеиновые кислоты, которые осаждены на стенки капилляров, смываются соответствующим буфером на второй стадии.

Задачей данного изобретения является получение многоканального биосепарирующего элемента на основе стеклянной многоканальной системы, впаянной в наконечник для

механического дозатора, шприца или другого устройства, причем внутренние поверхности капилляров в указанной системе модифицированы нанопокрытием на основе полианилина или сополимера анилина с замещенным анилином, что обеспечивает разделение и очистку смесей нуклеиновых кислот и белков в одну стадию. Сорбционный слой состоит от одного до трех полимерных нанослоев, образующихся в результате проведения осадительной окислительной полимеризации анилина или его сополимеризации с 3-аминобензойной кислотой и имеющих толщину от 3 до 10 нм, а многоканальный элемент выполнен с защитным обрамлением из нескольких рядов стеклянных стержней, при этом единичный стеклянный шестигранный стержень имеет оболочку из легкоплавкого стекла, а стеклянный гексагональный многоканальный массив состоит из уложенных многократно вытянутых единичных многоканальных элементов с диаметром капилляров от 1 мкм и более, рабочей поверхностью до 500 см², объемом до 500 мкл и дополнительных поверхностей в виде межканальных отверстий меньшего диаметра, при этом защитное обрамление может быть также выполнено в виде трубки, внутренняя геометрия которой выполнена под размеры и форму многоканального элемента.

Для получения полимермодифицированных многоканальных систем для одностадийного разделения биополимеров в качестве носителей изготавливают стеклянные многоканальные структуры с диаметрами каналов от 1 до 100 мкм, путем перетяжки гексагонального пакета многоканальных капилляров, по периметру которого укладывают один-три ряда стеклянных стержней обрамления, причем диаметр стержней сопоставим с размером по двойной апофеме многоканальных капилляров, единичный стеклянный стержень имеет оболочку из легкоплавкого стекла.

Заявляемая технология позволяет осуществлять укладку и перетяжку элементов с микроразмерами в структуре и наружными макроразмерами, что отличает ее от всех известных технологий, которые позволяют производить лишь две перетяжки, причем укладку

последней осуществляют из элементов с размером по двойной апофеме 0.4-0.6 мм. Для изготовления многоканальных структур с диаметрами каналов порядка и меньших 1 микрона основные трудности возникают именно из-за проблем с укладкой шестигранных элементов, сторона которых из-за многочисленных перетяжек становится рифленой, укладывать такие структуры с соблюдением условий регулярности очень сложно, обязательно появляется сдвиг структур в общем многоканальном массиве, а размер укладываемых многоканальных заготовок, меньших 1 мм, приводит к проблемам прямолинейности и закрутки элементов в пакете.

Поэтому, учитывая вышеизложенные трудности, разработана принципиально новая технология изготовления многоканальных заготовок с микро- и наноразмерами каналов, изложенная в заявке. Главное отличие состоит в том, что она позволяет изготавливать промежуточные многоканальные элементы с наружными размерами, позволяющими без проблем сдвига и закрутки собирать пакеты с соблюдением всех требований укладки для следующих перетяжек. Многоканальные элементы получают укладкой элементов шестигранной формы, граничащих друг с другом диагональю, в углах которых располагают трехгранные заготовки

Техническим результатом изобретения является биосепарирующий элемент, содержащий модифицированную анилинсодержащим полимером стеклянный многоканальный массив, впаянный в наконечник для механического дозатора, шприц или другое устройство.

Поставленная задача решается, а технический результат достигается тем, что стеклянный многоканальный элемент, состоящий из регулярного гексагонального многокапиллярного массива, по периметру которого уложены от одного до нескольких рядов стеклянных стержней обрамления, а в углах гексагонального массива вместо многоканальных капилляров размещены стержни обрамления, перетягивают до требуемых параметров каналов и наружного размера наконечника.

Такое решение обрамления позволяет гарантированно получать защитное покрытие структуры без разрывов и обеспечивать герметичное впаивание стеклянного многоканального элемента без его перегрева и деформации в стандартный полипропиленовый наконечник или шприц. Таким образом, получают герметично впаянную в полипропиленовый наконечник многоканальный массив с воспроизводимыми геометрическими параметрами (длиной от 10 мм и более, диаметром канала от 1 мкм и более, объемом до 500 мкл и площадью поверхности до 500 см²).

Также технический результат достигается способом получения структур с диаметром канала до 1 мкм, который включает многократные перетяжки структур, предварительно сформированных укладкой элементов шестигранной формы, граничащих друг с другом диагональю, в углах которых располагают трехгранные заготовки, а количество элементов на стороне трехгранника m=(n-1)/2, где n - количество элементов на диагонали шестигранника, причем все пакеты первой или многократной перетяжки с изоляцией торца силиконовым герметиком или клеем. Заданный профиль поперечного сечения многоканального элемента определяется профилем вытягиваемого пакета. При этом сначала вытягивают капилляры необходимого профиля и необходимой пористости. Затем из них формируют пакеты трехгранной и шестигранной формы. Геометрическое подобие профиля сохраняется в процессе вытягивания пакета, чему способствует гексагональная в сечении укладка капилляров. Многоканальный элемент представляет собой множество отверстий, причем как форма отверстий, так и наружная геометрия могут быть цилиндрическими, гексагональными, прямоугольными, треугольными и т.д. Из многоканальных элементов, полученных в результате вытягивания пакета, может быть сформирован новый пакет трехгранной и шестигранной формы, и этот процесс повторяется. В результате формируют необходимые по размеру и форме каналы, например структуру со следующими характеристиками: длиной от 10 мм и более,

диаметром канала от 1 мкм и более, объемом до 500 мкл и площадью поверхности до 500 см²).

Также технический результат достигается способом нанесения полимерного нанопокрытия на внутреннюю поверхность капилляров в многоканальном элементе, заключающимся в нанесении от одного до трех полимерных нанослоев, образующихся в результате проведения осадительной окислительной полимеризации анилина или его сополимеризации с 3-аминобензойной кислотой, и имеющих толщину от 3 до 10 нм соответственно. В результате проведения указанной процедуры изменяют сорбционные свойства поверхности капилляров за счет образования устойчивого равномерного бездефектного биосовместимого полимерного покрытия на внутренней поверхности стенок капилляров, обеспечивающего высокую селективность в процессах разделения компонентов смесей биополимеров (нуклеиновых кислот, белков и пептидов) в одну стадию с одновременной их очисткой от примесей.

Указанные отличительные признаки существенны.

Применение анилинсодержащего полимерного модификатора позволяет проводить быстрое одностадийное выделение и очистку нуклеиновых кислот (ДНК, РНК), а также разделять компоненты белковой природы в зависимости от значения их пьезоэлектрической точки (pi) без добавления дополнительных органических компонентов в подвижную фазу и без использования дополнительного оборудования (насосы, центрифуги и т.д.). Нанослои биосепарирующего полимера обратимо удерживают белки, пептиды или другие органические молекулы, а выделяются лишь нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК), при этом нуклеиновые кислоты не удерживаются поверхностью материала (исключается стадия элюции при выделении нуклеиновых кислот) за счет изменения структуры макромолекулы полимера при изменении pH среды. Более того, белки и пептиды затем могут быть последовательно десорбированы в

результате элюции буфером с повышенным значением pH без добавления дополнительных органических компонент в подвижную фазу.

Таким образом, предлагаемый биосепарирующий элемент является простым, экономически эффективным устройством, позволяющим проводить экспресс-выделение и очистку как нуклеиновых кислот, так и белков и пептидов, не требующим использования дорогих материалов или специального оборудования, а также обеспечивающим высокую воспроизводимость результатов, единообразие, согласованность и практически идентичные пути прохождения образца.

Таким образом, указанные отличительные признаки находятся в единой неразрывной связи, обеспечивая наличие причинно-следственной связи с техническим результатом, который достигается сочетанием указанных признаков.

Изобретение иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1

1. Изготавливаем круглые стеклянные капилляры с наружным диаметром 1,2 мм и внутренним диаметром 1 мм в количестве 2107 штук и запаиваем один торец.

2. Укладываем стеклянные капилляры с наружным диаметром 1,2 мм и внутренним диаметром 1 мм в пакет гексагональной формы. На стороне шестигранника располагаем 27 капилляров, на диагонали 53 капилляра, размер стороны 32,4 мм, размер диагонали 63,5 мм, размер по двойной апофеме 55,2 мм (выбирают такие размеры исходя из размеров нагреваемого пространства печи <75 мм), количество капилляров в пакете 2107 штук.

3. Нагреваем до температуры размягчения стекла и перетягиваем пакет в 10 раз в шестигранные заготовки с размером диагонали 6,4 мм, размером стороны 3,2 мм, размером по двойной апофеме 5,5 мм, количество каналов 2107 диаметром 100 мкм.

4. Запаиваем один торец 91 шестигранной заготовки.

5. Укладываем полученные шестигранные заготовки в шестигранный пакет, количество шестигранников на диагонали 11, на стороне 6. Размер полученного пакета по диагонали 60,5 мм, по двойной апофеме 52,6 мм, количество шестигранников в пакете 91.

6. Нагреваем до температуры размягчения стекла и перетягиваем пакет 10 раз в шестигранные заготовки с размером диагонали 6,0 мм, размером стороны 3 мм, размером по двойной апофеме 5,3 мм, количеством каналов (2107×91=191737), диаметром 10 мкм.

7. Укладываем полученные (в пункте 3) шестигранные заготовки в трехгранный пакет, общее количество шестигранников в пакете 15, на стороне трехгранника 5 шестигранников, рассчитывается исходя из укладки предыдущего (пункт 5) шестигранного пакета, у которого на диагонали 11 шестигранников, тогда на стороне трехгранного пакета будет (11-1)/2=5 шестигранников, размер стороны 27,5 мм, размер высоты трехгранного пакета 23,8 мм.

8. Нагреваем до температуры размягчения стекла и перетягиваем пакет 10 раз в трехгранные заготовки с размером стороны 2,7 мм и высоты 2,4 мм, количеством каналов 31605, диаметром 10 мкм.

9. 3апаиваем один торец 91 шестигранника, полученного в пункте 6, и 180 трехгранников, полученных в пункте 8.

10. Укладываем окончательный пакет: 11 шестигранников на диагонали выстроены диагоналями друг к другу, 6 шестигранников на стороне, всего в пакете 91 шестигранник и 180 трехгранников, которые уложены в углы шестигранников, образуя укладку в виде «звезды Давида», шестиконечной звезды, или гексаграммы. Таким образом, получен шестигранный пакет с размером по диагонали 6×11=66 мм, размером по двойной апофеме 57,2 мм, количеством каналов (191737×91=17448067) в шестигранниках (31605×180=5688900), общим количеством 23136967, диаметром 10 мкм. Собранный пакет помещают в стеклянную трубку наружным диаметром 70 мм и внутренним 67 мм.

11. Перетягиваем собранный пакет, например 10 раз, получая структуру для МК наконечника, наружным диаметром 7 мм, диаметром каналов 1 мкм, количеством 25602157. Если необходимо получить, например диаметр канала 500 нм, структуру перетягивают 20 раз - наружный диаметр при этом становится 3,5 мм. Для получения 100 нм диаметра канала пакет перетягивают 100 раз, наружный диаметр при этом будет составлять 700 мкм.

Пример 2

Стеклянную многоканальную структуру с размером по двойной апофеме 50 мм и диаметром каналов 650 мкм, обложенную одним рядом обрамления, причем в углах капиллярной структуры вместо многоканальных капилляров вставлены три стеклянных стержня обрамления, перетягивают до диаметра каналов 40 мкм и наружного размера 3.35 мм. В регулярной гексагональной капиллярной структуре три угловых капилляра заменены на стеклянные стрежни, что позволяет предельно предохранить структуру от деформации при перетяжке. Получают многоканальный наконечник, содержащий 4417 капилляров с диаметром 40 мкм, толщина многоканальной системы при этом составляет 3.35 мм, длина 50 мм.

Пример 3

Блок стекла обертывают термостойкой тканью, устанавливают на фильерный узел, который находится в печи. Далее блок разогревают до температуры размягчения. Затем через фильерный узел размягченное стекло продавливается под собственным весом и направляется вниз, где изделие зажимают в механизм вытяжки. Таким образом, производится вытягивание трубки (причем внутренние размеры трубки соответствуют геометрии и размерам многоканального элемента). Форма поперечного сечения изделия и его размеры определяются геометрией фильерного узла, скоростью вытягивания и температурой размягчения стекла. Стабильность и точность поддержания температуры в печи и скорости вращения привода вытяжки во многом определяют стабильность и точность геометрических размеров, поперечного сечения получаемого изделия.

Пример 4

Для модификации капилляров длиной 30 мм с диаметром капилляров 30 мкм полианилиновым покрытием 1.3 моля анилина растворяли в 8 мл 1М HCl. Отбирали 200 мкл полученного раствора и охлаждали до 10-11°C. Добавляли 60 мкл водного раствора окислителя (персульфата аммония, 5% мас). В многоканальный наконечник набирали реакционную смесь и инкубировали 20 мин при комнатной температуре. По окончании полимеризации наконечник промывали водой, этанолом и сразу же высушивали в сушильном шкафу при 80°C в течение 4 ч.

Пример 5

Проводили модификацию как в примере 2. После промывки водой процедуру нанесения полимерного покрытия повторяли еще дважды. По окончании полимеризации многоканальные наконечники промывали водой, этанолом и сразу же высушивали в сушильном шкафу при 80°C в течение 4 ч.

Пример 6

Для модификации капилляров покрытием сополимера анилина с 3-аминобензойной кислотой мономеры (0.975 моль и 0.325 моль, соответственно) растворяли в 8 мл 1М HCl. Раствор охлаждали до 10-11°C и добавляли 60 мкл водного раствора окислителя (персульфата аммония, 5% мас). В каждый многоканальный наконечник набирали реакционную смесь и инкубировали 20 мин при комнатной температуре. По окончании полимеризации многоканальные наконечники промывали водой, этанолом и сразу же высушивали в сушильном шкафу при 80°C в течение 4 ч.

Пример 7

Модифицированные полимерами многоканальные наконечники использовали для одностадийной очистки и выделения ДНК из клинического образца крови. 100 мкл крови с ЭДТА (100 мкл) вносили в микропробирку типа Eppendorf. Добавляли 100 мкл лизирующего буфера, перемешивали и инкубировали 15 мин при 95°C. Лизат центрифугировали 10 мин при 10000 об/мин (3.584 kg), затем в многоканальный наконечник отбирали супернатант и инкубировали 2 мин при комнатной температуре. Элюат из многоканального наконечника переносили в чистую пробирку и затем анализировали методом ПЦР в реальном времени. Лизис пробы, процедуры очистки ДНК с помощью коммерческих колонок и наборов для ПЦР проводили как в [D.V. Kapustin, A.I. Prostyakova, D.Yu. Ryazantcev, V.P. Zubov. Novel composite matrices modified with nanolayers of fluoropolymers as perspective materials for separation of biomolecules and bioanalysis. Nanomedicine. Vol. 6(2), (2011). P. 241-255.].

Результаты ПЦР представлены в таблице 1.

Пример 8

100 мкл модельной смеси, содержащей ДНК тимуса теленка (10 мкг) и бычий сывороточный альбумин (550 мкг) вносили в пластиковую микропробирку объемом 1.5 мл. Многоканальный наконечник промывали несколько раз аликвотой модельной смеси (100 мкл в пробирке Eppendorf), затем набирали аликвоту в носик и инкубировали при комнатной температуре 3 мин. Элюат из многоканального наконечника переносили в чистую пробирку и анализировали электрофоретически. Результаты электрофореза представлены на фиг. 1 (фиг. 1 - электрофорез в 0.8% агарозном геле. 1 - маркер, 2 - исходная смесь ДНК-белок, 3 - элюат из многоканального наконечника без инкубирования (только двухкратное промывание), 4 - элюат из многоканального наконечника после промывания и инкубации (3 мин). Полученные элюаты также анализировали спектрофотометрически, определяя поглощение при 260 и 280 нм. Полученные данные приведены в таблице 2. Видно, что очищенная от белка ДНК практически полностью содержится в элюате.

Пример 9

Предварительно определяли емкость капиллярного наконечника по белку (БСА), которая составила 400±10 мкг. Для демонстрации эффекта обратимого удерживания белков в многоканальный наконечник длиной 5 см с капиллярами с диаметром 30 мкм с помощью механического дозатора втягивали 100 мкл раствора БСА (550 мкг) в ТЭ-буфере (pH 7.2). Затем аликвоту переносили в пластиковую пробирку и анализировали спектрофотометрически, определяя по калибровочной кривой содержание белка в пробе. После этого в многоканальный наконечник втягивали 100 мкл ТЭ-буфера (pH 10.0) и снова переносили полученный элюат и анализировали спектрофотометрически. Полученные результаты представлены в таблице 3. Анализ полученных данных свидетельствует о том, что удерживаемый при нейтральных значения pH среды белок практически полностью десорбируется с поверхности капилляра при повышении pH.

При использовании модифицированного наконечника от 48% до 71% ДНК сохраняется. Препарат существенно очищается от примесей по сравнению с исходным образцом. Значение 260 нм/280 нм равно в среднем 1,64 (у исходного препарата - 1,38). Препарат выделенной ДНК очень чистый. Требуется увеличить время экспозиции в наконечнике для большей очистки.

При использовании традиционной методики при высокой чистоте препарата выделенной ДНК (в среднем значение 260 нм/280 нм равно 1,83) наблюдались большие потери препарата в результате двух отмывок - в среднем сохраняется 33%-43% ДНК. Кроме того, процедура выделения более длительная и требует дополнительного оборудования и ресурсов (реактивов из набора) по сравнению с использованием модифицированных МК-наконечников.

Изобретение проиллюстрировано следующими чертежами.

На фигуре 1 изображен электрофорез в 0.8% агарозном геле. 1 - маркер, 2 - исходная смесь ДНК-белок, 3 - элюат из многоканального наконечника без инкубирования (только 2-х кратное промывание), 4 - элюат из многоканального наконечника после промывания и инкубации (3 мин).

На фигуре 2 изображен многоканальный массив, имеющий защитное обрамление из нескольких рядов стеклянных стержней.

На фигуре 3 изображен многоканальный массив, в котором защитное обрамление может быть выполнено в виде трубки.

На фигуре 4 изображен многоканальный массив, в защитном обрамлении которого три-шесть угловых мультикапиллярных элементов в массиве заменены на стеклянные стержни.

На фигуре 5 изображен многоканальный массив из предварительно сформированных укладкой элементов шестигранной формы, граничащих друг с другом диагональю, в углах которых располагают трехгранные заготовки.

На фигуре 6 представлен фрагмент многоканального массива, демонстрирующий расчет элементов на стороне трехгранных заготовок, связанных с количеством элементов на диагонали в шестигранных заготовках.

Изобретение проиллюстрировано следующими таблицами.

В таблице 1 приведена концентрация ДНК в элюатах после выделения на многоканальном наконечнике.

В таблице 2 приведено относительное содержание ДНК и белка в элюатах.

В таблице 3 приведено содержание белка в полученных элюатах.

Группа изобретений относится к многоканальным устройствам, модифицированным нанослоями анилинсодержащих полимеров. Предложен многоканальный наконечник для выделения нуклеиновых кислот, белков, пептидов и способ изготовления многоканального элемента, входящего в состав многоканального наконечника. Наконечник состоит из стеклянного гексагонального многоканального массива, включающего многоканальные элементы из множества параллельных капилляров. На внутренней поверхности капилляров нанесен сорбционный слой, который состоит из от одного до трех полимерных нанослоев. Многоканальный элемент выполнен с защитным обрамлением из нескольких рядов стеклянных стержней. Стеклянный гексагональный многоканальный массив состоит из уложенных многократно вытянутых единичных многоканальных элементов с диаметром капилляров от 1 мкм и более, рабочей поверхностью до 500 см², объемом до 500 мкл. Способ изготовления многоканального элемента включает сборку стеклянных трубок в многоканальный пакет, закрепление одного его конца в захвате узла подачи, нагревание в печи другого конца с образованием луковицы и вытяжку до требуемого размера. В процессе формования для получения структур с диаметром канала порядка и меньше 1 мкм осуществляют многократную вытяжку многоканальных элементов, предварительно сформированных укладкой элементов шестигранной формы. Изобретения обеспечивают проведение экспресс-выделения и очистки как нуклеиновых кислот, так и белков, пептидов, а также обеспечивают высокую воспроизводимость результатов. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 6 ил., 3 табл., 9 пр.

1. Многоканальный наконечник для выделения нуклеиновых кислот, белков, пептидов, расположенный в корпусе полипропиленового наконечника для пипеток, состоящий из стеклянного гексагонального многоканального массива, включающего многоканальные элементы из множества параллельных капилляров, на внутренней поверхности которых нанесен сорбционный слой, отличающийся тем, что сорбционный слой состоит из от одного до трех полимерных нанослоев, образующихся в результате проведения осадительной окислительной полимеризации анилина или его сополимеризации с 3-аминобензойной кислотой и имеющих толщину от 3 до 10 нм, а многоканальный элемент выполнен с защитным обрамлением из нескольких рядов стеклянных стержней, при этом единичный стеклянный шестигранный стержень имеет оболочку из легкоплавкого стекла, а стеклянный гексагональный многоканальный массив состоит из уложенных многократно вытянутых единичных многоканальных элементов с диаметром капилляров от 1 мкм и более, рабочей поверхностью до 500 см², объемом до 500 мкл и дополнительных поверхностей в виде межканальных отверстий меньшего диаметра, при этом защитное обрамление выполнено в виде трубки, внутренняя геометрия которой выполнена под размеры и форму многоканального элемента.

2. Многоканальный наконечник по п. 1, отличающийся тем, что в гексагональном многоканальном массиве от трех до шести угловых многоканальных элементов заменены на стеклянные шестигранные стержни.

3. Многоканальный наконечник по п. 1, отличающийся тем, что трубка, внутренняя геометрия которой соответствует размерам и форме многоканального элемента, получена вытяжкой из расплава из более легкоплавкого стекла, чем многоканальный элемент, причем коэффициент термического расширения трубки соответствует коэффициенту термического расширения многоканального элемента.

4. Способ изготовления многоканального элемента входящего в состав многоканального наконечника по п. 1, включающий сборку стеклянных трубок в многоканальный пакет, закрепление одного его конца в захвате узла подачи, нагревание в печи другого конца с образованием луковицы и вытяжку до требуемого размера, отличающийся тем, что в процессе формования для получения структур с диаметром канала порядка и меньше 1 мкм осуществляют многократную вытяжку многоканальных элементов, предварительно сформированных укладкой элементов шестигранной формы, граничащих друг с другом диагональю, в углах которых располагают трехгранные элементы, количество капилляров на стороне трехгранника m=(n-1)/2, где n - количество капилляров на диагонали шестигранника.

5. Способ изготовления многоканального элемента по п. 4, отличающийся тем, что для предотвращения схлопывания капилляров во время вытяжки все пакеты первой или многократной вытяжки изолируют с одного торца силиконовым герметиком или клеем, или запаивают.