СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ПРОБ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ИЗ СОПРЯЖЕННЫХ ОЧАГОВ ЧУМЫ И АРБОВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности микробиологии, и может быть использовано для лабораторной диагностики чумы и арбовирусных инфекций.

Yersinia pestis и ряд арбовирусов относятся к возбудителям заболеваний человека, имеющих индивидуальную и общественную опасность, тяжелое течение и высокую летальность.

С начала 90-х годов прошлого века в мире отмечается активизация природных очагов чумы и арбовирусных инфекций. В России осложнилась эпизоотологическая ситуация по чуме, активизировался эпизоотический и эпидемический процесс, вызванный арбовирусами. В настоящее время сформировались новые природные очаги арбовирусов, территориально совпадающие (сопряженные) с традиционно существующими природными очагами чумы. Важным мероприятием по предупреждению и предотвращению вспышек указанных заболеваний является эпидемиологический надзор за очагами. Осуществление эпидемиологического надзора включает в качестве основного мероприятия проведение серологического исследования материала, потенциально зараженного возбудителями чумы и арбовирусных инфекций. При этом необходимо обеспечить биологическую безопасность персонала, снизить риск его инфицирования. Этого можно добиться в ходе подготовки проб, в частности предварительной обработки (инактивации) материала. Вместе с тем не должна снижаться эффективность диагностических исследований. Следовательно, актуальным является разработка способов инактивации материала, собранного на территории сопряженных очагов чумы и арбовирусных инфекций.

Известны способы инактивации Y.pestis, включающие обработку суспензий дибутиловым и диизобутиловым эфирами фосфористой кислоты (1), C,N-фосфорилированными имидатами (2), N-ацилированными фосфорсодержащими бутилтиоимидатами (3), этилбензимидатом (4), описанные в патентах. Однако перечисленные химические вещества и предложенные способы инактивации не регламентированы нормативно-методическими документами по безопасной работе с патогенами. Неизвестны эффективность их действия на Y.pestis, содержащихся в пробах из объектов внешней среды, в материале от животных и больных людей, их влияние на чувствительность и специфичность серологических реакций, а также эффективность действия в отношении арбовирусов.

Известен способ предварительной обработки перед серологическим исследованием взвесей Y.pestis, проб из природных очагов чумы (суспензий внутренних органов или костного мозга животных, субстратов гнезд птиц и млекопитающих, погадок хищных птиц), а также материала от людей, больных чумой или с подозрением на заболевание. Способ регламентирован действующими санитарными правилами по безопасности работ с микроорганизмами I-II групп патогенности. Способ предусматривает инактивацию проб раствором формалина в двух режимах: использование раствора формалина в концентрации 1-2% в течение 12 ч или в концентрации 4% в течение 1 ч при комнатной температуре (5). Недостатком применения 1-2% раствора формалина является продолжительный период инактивации. Использование формалина в высокой концентрации (4%) приводит к ингибированию активности ферментов (6). Обязательным требованием является проверка бактерицидной активности формалина, требующая дополнительных временных и материальных затрат. Кроме того, эффективность вышеуказанных режимов инактивации не известна в отношении арбовирусов.

Известен способ инактивации инфекционной активности арбовирусов раствором формалина в концентрации 1:2000 (0,05% р-р) в течение 72 ч при температуре 32°С. Вместе с тем имеются данные, что формалин в указанном разведении снижает иммуногенность препаратов, приготовленных из вирусов, что косвенно свидетельствует о возможном изменении антигенной структуры и снижении диагностической ценности материала. Недостатком способа также является длительность процесса инактивции. Неизвестна эффективность обеззараживающего действия 0,05% раствора формалина в отношении Y.pestis. В настоящее время обязательным этапом подготовки материала, содержащего Y.pestis, является инактивация 1-2% раствором формалина (6).

Известны способы приготовления антигенов арбовирусов для серологических реакций, включающие инактивацию путем обработки Трис-буфером, метиленовым синим, прогреванием в определенных режимах. Однако они не всегда обеспечивают надежность инактивации (7).

Наиболее близким к заявляемому способу является способ приготовления антигенов арбовирусов для серологических реакций (7).

Способ приготовления антигенов арбовирусов для серологических реакций, описанный в методическом документе федерального уровня, включает инактивацию инфекционной активности вирусов путем обработки β-пропиолактоном в концентрации 0,05-0,1% в двух режимах при 37°C в течение 8-10 часов и при +4°С в течение 96 часов. Контроль качества инактивации инфекционной активности арбовирусов проводят заражением клеточных культур или мышей-сосунков полученной суспензией. Отсутствие цитопатогенного эффекта в культуре клеток и гибели мышей-сосунков свидетельствует об отсутствии жизнеспособных вирусов,

Использование β-пропиолактона в заданных режимах обеспечивает надежность инактивации арбовирусов и высокую чувствительность серологических реакций. Условия применения β-пропиолактона не предусматривают необходимости контроля его бактерицидной активности. Однако неизвестна эффективность использования β-пропиолактона для инактивации возбудителя чумы.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентам и научно-техническим источникам информации, показал, что сведений о способе, позволяющем инактивировать материал, доставленный из сопряженных природных очагов Y.pestis и арбовирусов, для подготовки его к серологическому исследованию не обнаружено.

Задачей изобретения является разработка способа подготовки проб, одновременно содержащих возбудителей чумы и арбовирусных инфекций, обеспечивающего безопасность работы персонала и эффективность диагностического исследования.

Изобретение предлагает оптимальный вариант способа подготовки проб, одновременно содержащих бактериальные (возбудитель чумы) и вирусные агенты (арбовирусы).

Сущность изобретения заключается в том, что исследуемые пробы обрабатывают β-пропиолактоном путем внесения в них до конечной концентрации 0,1% при +37°С в течение 8-10 часов.

Авторами впервые установлена бактерицидная активность β-пропиолактона в отношении взвесей Y.pestis и проб из внутренних органов животных, содержащих Y.pestis, а также разработан режим инактивации проб, содержащих чумной микроб, а именно при 37°C в течение 6-8 часов.

Режим подготовки проб из сопряженных очагов разработан с учетом комплексного состава. Кроме микроорганизмов в пробах содержатся дополнительные компоненты (белки, липиды, липополисахариды и пр.) из внутренних органов млекопитающих и материала от больных людей. Они нестандартны по составу и могут, взаимодействуя с β-пропиолактоном, снижать его бактерицидную активность.

В заявляемом способе предложен конкретный режим его выполнения:

1. β-пропиолактон вносят в пробы до конечной концентрации 0,1% по объему.

2. Пробы выдерживают при 37° в течение 8-10 часов.

Способ подготовки проб осуществляют следующим образом.

Кусочки внутренних органов животных (печень, легкие, селезенка), добытых в сопряженных очагах, измельчают, добавляют физиологический раствор в определенной пропорции; отбирают надосадочную жидкость; к полученной взвеси добавляют β-пропиолактон до получения конечной концентрации в пробе 0,1%; смесь выдерживают при 37°C в течение 8-10 часов.

Контроль эффективности инактивации проводят в соответствии с действующими нормативно-методическими документами. Для контроля качества инактивации бактерий проводят высев полученной суспензии на плотные и жидкие питательные среды и заражают лабораторных животных. По истечении срока наблюдения за зараженными животными суспензии, приготовленные из внутренних органов, высевают на указанные питательные среды. Отсутствие роста бактерий свидетельствует об отсутствии жизнеспособных микроорганизмов в исследуемом материале. Контроль качества инактивации инфекционной активности арбовирусов проводят заражением клеточных культур или мышей-сосунков полученной суспензией.

Полученные инактивированные пробы используют для постановки серологических реакций, при этом обеспечивается высокая специфичность и чувствительность ИФА для обнаружения в пробах Y.pestis и возбудителей арбовирусных инфекций.

Сущность изобретения пояснена примерами его исполнения.

Пример 1.

Кусочки внутренних органов (печень, легкие, селезенка) павших белых мышей, зараженных штаммом Y.pestis 231, помещают в стерильную ступку, измельчают, приливают примерно 2 мл 0,9% физиологического раствора рН 7,2, перемешивают и отбирают через стерильную марлевую салфетку пастеровской пипеткой в стерильную пробирку. Мерной пипеткой замеряют количество жидкости, доводят объем до 5 мл стерильным физиологическим раствором. К полученной взвеси добавляют цельный β-пропиолактон до получения конечной концентрации в пробе 0,1%. Смесь выдерживают при +37°С в течение 8-10 часов. Для контроля эффективности инактивации проводят высев на 2 чашки с агаром LB, в 2 пробирки с бульоном LB, заражают биопробных животных - по 2 белые мыши. В течение 5 суток наблюдают за появлением роста на питательных средах и за лабораторными животными. На 6 сутки животных забивают, кусочками органов (печень, селезенка, легкие, сердце) делают посевы отпечатками на питательные среды (2 чашки с агаром LB, 1 пробирка с бульоном LB для посева крови из сердца). За посевами наблюдают 5 суток. В ходе контроля на всех средах роста чумного микроба не отмечено. Данные об инактивации взвесей чумного микроба и проб из внутренних органов животных, зараженных Y.pestis 231, приведены в таблице 1.

Инактивированную взвесь используют для постановки иммуноферментного анализа (ИФА) на наличие антигена (FI), образующегося при культивировании Y.pestis при 37°С. Для сравнения параллельно проводили постановку ИФА с аналогичными пробами, обработанными 2% раствором формалина. Результаты контроля специфичности и чувствительности ИФА отражены в таблице 2. В качестве анализируемых объектов использованы пробы, приготовленные из внутренних органов лабораторных животных, зараженных штаммом Y.pestis 231, взвеси штамма Y.pestis 231, выращенного при 37°С (положительный контроль) и 28°С (отрицательный контроль). Сравнительный анализ продемонстрировал высокую чувствительность и специфичность ИФА с пробами, инактивированными заявляемым способом.

Пример 2 (модельный эксперимент).

В модельном эксперименте при подготовке проб, одновременно содержащих возбудителей чумы и арбовирусных инфекций (вирус Конго Крымской геморрагической лихорадки), кусочки внутренних органов (печень, легкие, селезенка) павших белых мышей, зараженных штаммом Y.pestis 231, помещают в стерильную ступку, измельчают, приливают примерно 2 мл 0,9% физиологического раствора рН 7,2, вносят суспензии клещей, инфицированных арбовирусами (вирус Конго Крымской геморрагической лихорадки - ККГЛ), перемешивают и отбирают через стерильную марлевую салфетку пастеровской пипеткой в стерильную пробирку. Далее подготовка проб и постановка ИФА, контроль эффективности инактивации проводятся аналогично примеру 1. Результаты контроля специфичности и чувствительности ИФА отражены в таблице 2. Сравнительный анализ продемонстрировал высокую чувствительность и специфичность ИФА с пробами, инактивированными заявляемым способом.

Как видно из примеров, заявляемый способ обеспечивает эффективную инактивацию проб и позволяет надежно выявлять в серологических реакциях наличие возбудителей чумы и арбовирусных инфекций в пробах из сопряженных природных очагов.

Технический результат от использования изобретения заключается в повышении уровня безопасности работы персонала с материалом, содержащим одновременно возбудителей чумы и арбовирусных инфекций, и сохранении ценности проб для лабораторной диагностики. Предложенный способ обеспечивает высокую специфичность и чувствительность ИФА для диагностики Y.pestis по наличию антигена FI, и по наличию специфических антигенов арбовирусов.

Присутствие в пробе дополнительных компонентов (белков, липидов, липополисахаридов и пр.) не снижает эффективность инактивации.

Кроме того, способ позволяет обеззаразить и провести обнаружение возбудителя чумы и арбовирусов в пробах малых объемов (микролитры), обеспечивает предварительную обработку перед серологическим исследованием взвесей микроорганизмов, проб из природных очагов (суспензий внутренних органов или костного мозга животных, субстратов гнезд птиц и млекопитающих, погадок хищных птиц), а также материала от больных людей, или лиц с подозрением на заболевание.

По сравнению с регламентированным в санитарных правилах по безопасности работ с микроорганизмами I-II групп патогенности способом подготовки проб, содержащих возбудитель чумы, заявляемый способ позволяет уменьшить сроки инактивации проб на 2-4 ч, таким образом сократив время получения результата диагностических серологических реакций.

Заявляемый способ разработан и апробирован в лабораториях биологической безопасности и диагностики инфекционных болезней Российского научно-исследовательского противочумного института "Микроб".

Источники информации

1. Патент РФ №1235030, A61L 2/16, A61L 2/18, 10.05.99.

2. Патент РФ №1241688, C07F 9/40, C07F 9/24, А61K 31/66, 30.05.84.

3. Патент РФ №1389238, C07F 9/40, А61K 31/66, 07.07.86.

4. Патент РФ №1345402, A61L 2/16, 30.05.84.

5. Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп безопасности. Санитарно-эпидемиологические правила. СП 1.3.1285-03.

6. Майоров Н.В., Тихонов Н.Г., Адамов А.К. и др. / Матер. Всесоюз. конф. "Дезинфекция и стерилизация. Перспективы развития". - Волгоград, 1985. - С.77-78.

7. Выявление циркуляции арбовирусов. Методы вирусологических и серологических исследований, клинико-эпидемиологические характеристики малоизученных арбовирусных инфекций, подходы к мониторингу природных очагов арбовирусов. - Метод. рекомендации. // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Сер. Вирусология. - 1991. - Т.25. - С.30-34.

Таблица 1
Результаты инактивации взвесей Y.pestis 231, содержащих 10⁹ м.к./мл, при 37°СЭкспозиция (ч)взвесей Y.pestis 231 (10⁹ м.к./мл)проб из внутренних органов лабораторных животных, зараженных Y.pestis 2311 часрост на 2 суткирост на 2 сутки3 часа6 часовроста нетроста нет8 часов18 часов

Таблица 2
Влияние способа обеззараживания материала на результаты ИФАКонцентрация Y.pestis (м.к./мл) в образцах10⁹10⁸10⁷10⁶10⁵10⁴10³Средства инактивации       β-пропиолактон в конечной концентрации 0,1%Взвеси Y.pestis++++++/--Пробы из внутренних органов грызунов, содержащие Y.pestis++++++/--Пробы, включающие суспензии внутренних органов грызунов, зараженных Y.pestis, и
суспензии клещей, содержащие арбовирусы (ККГЛ)Y.pestis++++++/--ККГЛ+++++++Отрицательный контроль (взвеси Y. pestis, выращенные при 28°С)-------2% р-р формалинаВзвеси Y.pestis++++++/--Пробы из внутренних органов грызунов, содержащие Y.pestis++++++/--Пробы, включающие суспензии внутренних органов грызунов, зараженных Y.pestis, и
суспензии клещей, содержащие арбовирусы (ККГЛ)Y.pestis++++++/--ККГЛ+++++++Отрицательный контроль (взвеси Y.pestis, выращенные при 28°С)-------

Изобретение относится к биотехнологии. Способ заключается в том, что исследуемые пробы обрабатывают β-пропиолактоном в конечной концентрации в пробе 0,1% при +37°С в течение 8-10 часов. Способ позволяет повысить биологическую безопасность проведения персоналом манипуляций с инфицированным или подозрительным на зараженность материалом при постановке серологических реакций, сократить время инактивации материала на 2-4 ч, не снизив эффективность диагностики. 2 табл.

Способ подготовки проб для серологических исследований из сопряженных очагов чумы и арбовирусных инфекций, характеризующийся тем, что исследуемые пробы обрабатывают β-пропиолактоном в конечной концентрации в пробе 0,1% при +37°С в течение 8-10 ч.