НАБОР ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ОМСКОЙ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ И КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА Российский патент 1996 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к вирусологии, точнее, к созданию диагностических наборов для дифференциальной диагностики омской геморрагической лихорадки (ОГЛ) и клещевого энцефалита (КЭ).

Известны коммерческие препараты (диагностикум КЭ для РТГА, РСК, РРГ и РТНГА, тест-система иммуноферментная для индикации антигена вируса КЭ) производства НПО "Вирион", г. Томск и др. Однако указанные препараты предназначены для выявления вируса КЭ или антител к нему и не позволяют серологически или вирусологически дифференцировать вирусы ОГЛ и КЭ и антитела к ним вследствие антигенной близости указанных возбудителей.

Известно использование в РТГА инфекционных боратно-солевых антигенов (БСА) к штаммам вируса ОГЛ и коммерческих антигенов вируса КЭ при массовых иммунологических обследованиях здорового населения с целью дифференциации природных очагов ОГЛ и КЭ (Ф.Ф.Бусыгин. В сб. Эпидемиологическая география клещевого энцефалита, омской геморрагической лихорадки и клещевого риккетсиоза Азии в Западной Сибири, 1973. С. 80-87) прототип.

Однако высокая патогенность БСА ограничивает применение препарата в учреждениях практического здравоохранения. К его недостаткам относится также низкая специфическая активность и ограниченный срок годности.

Известно также использование растворимых антигенов для дифференциации вирусов комплекса КЭ в РСК (С.Я.Гайдамович и др. Acta virologika Т. 29. - Вып. 2, 1985. С. 143-149). Однако при этом не показана возможность дифференциации штаммов вируса ОГЛ от различных географических вариантов вируса КЭ.

Задача изобретения повышение точности дифференциальной диагностики ОГЛ и КЭ за счет использования диагностического набора.

Технический результат усовершенствование лабораторной диагностики вирусов комплекса КЭ, а следовательно, создание предпосылок для оптимизации противоэпидемических и лечебно-профилактических мероприятий.

Для решения поставленной задачи сформирован диагностический набор, включающий диагностикумы ОГЛ и КЭ в комплекте с иммунными сыворотками. Диагностикумы представляют собой антигены вирусов ОГЛ и КЭ, полученные из мозга инфицированных белых мышей методом сахарозо-ацетоновой экстракции, инактивированные бетапропиолактоном, лиофилизированные.

Иммунные сыворотки представляют собой лиофилизированные сыворотки крови иммунизированных вирусами ОГЛ и КЭ кроликов или лиофилизированные асцитические жидкости иммунизированных вирусами ОГЛ и КЭ белых мышей, индуцированные введением клеток асцитной саркомы 180/TG. Диагностикумы используют для дифференцированного выявления в РТГА видоспецифических антител к вирусам ОГЛ и КЭ в сыворотках крови больных, переболевших людей и животных, исследования сывороток крови людей и животных в очагах заболеваний, а растворимые антигены, полученные из них, в качестве положительного и отрицательного контролей в РСК. Видовую специфичность обнаруженных антител оценивают по разнице их титров с 8 гемагглютинирующими единицами диагностикумов ОГЛ и КЭ, причем достоверной считают четырехкратную и более высокую разницу. Достоверным серологическим показателем считают четырехкратный и более интенсивный прирост титра специфических антител в сыворотках крови больного, взятых в начальном периоде заболевания и реконвалесценции. Иммунные сыворотки используют для идентификации штаммов вирусов ОГЛ и КЭ в шахматной РСК по их растворимым антигенам и контроля специфичности диагностикумов в РТГА. Для приготовления видоспецифических растворимых антигенов используют сахарозо-ацетоновые антигены к исследуемым штаммам вирусов. Наличие титра растворимого антигена с одной из иммунных сывороток позволяет четко идентифицировать исследуемый штамм вируса.

1. Получение диагностикумов ОГЛ и КЭ модифицированным методом сахарозо-ацетоновой экстракции. Из высокотитражных материалов (для приготовления препаратов используется эталонный штамм Софьин КЭ и штамм Боголюбовка ОГЛ) готовят 10% (10^-1) взвесь мозга на физиологическом растворе, центрифугируют 10 мин. при 2-3 тыс. об/мин и из надосадочной жидкости готовят разведение 10^-3. Полученным разведением заражают необходимое количество сосунков белых мышей (2-3 суточных) по 0,01 мл в мозг. Через 3-5 суток после заражения проводят сбор сосунков с типичными признаками болезни (состояние прострации, судороги, параличи задних и передних конечностей).

Отобранных сосунков обескроавливают разрезом грудной клетки и укладывают в чашки Петри для извлечения мозга. Кожу в области шеи и головы обрабатывают 5% спиртом, стерильными ножницами вскрывают черепную коробку и извлекают мозг. Мозг помещают в охлажденную фарфоровую ступку.

Сахарозо-ацетоновая экстракция. Раствор сахарозы 8,5% (ГОСТ 5833-54) готовят непосредственно перед употреблением, рН этого раствора должен быть не ниже 7,0.

К мозгу мышей, находящемуся в охлажденной фарфоровой ступке, добавляют охлажденный до +4^oС 8.5% раствор сахарозы из расчета 0,4 мл раствора на мозг (20% суспензия) и измельчают до получения однородной массы.

Для работы используют ацетон квалификации "ч" (чистый). Ацетон хранят в темной стеклянной посуде. Предварительно ацетон охлаждают до +4^oС, 20% суспензию мозга мышей на 8,5% растворе сахарозы трехкратно обрабатывают охлажденным ацетоном.

Для первой ацетоновой экстракции берут 20 объемов ацетона на 1 объем суспензии мозга. Для этого суспензию осторожно, по каплям, добавляют в центрифужный стакан с охлажденным ацетоном при непрерывном перемешивании. Затем взвесь центрифугируют 10 мин. при 2000 об/мин. и удаляют молочного цвета надосадочную жидкость (ацетон). Осадок имеет вид розоватой вязкой массы, прилипшей к стеклу.

Для второй обработки берут свежую порцию охлажденного ацетона в 20-кратном объеме и добавляют к осадку. После этого осадок тщательно разбивают стеклянным или фарфоровым пестиком до образования равномерной взвеси и оставляют в холодильнике при +4^oС на 1 час. В течение часовой экстракции взвесь следует периодически перемешивать. Затем взвесь центрифугируют 10 мин. при 2000 об/мин, и ацетон осторожно отсасывают.

Третий раз к осадку добавляют свежую порцию ацетона в небольшом произвольном количестве. Если обработка проводилась в нескольких центрифужных стаканах, то следует собрать осадок в один центрифужный стакан, обмыв его небольшим количеством ацетона. Смесь тщательно перемешивают, центрифугируют, удаляют ацетон, а осадок высушивают под вакуумом до превращения его в сухой рассыпчатый порошок.

В связи с тем, что после обработки ацетоном антиген сохраняет инфекционные свойства, отсасываемый воздух пропускают через сосуд с дезинфицирующим раствором.

К порошкообразному осадку добавляют 0,1 М трис-буферный раствор до объема первоначальной суспензии мозга. Для инактивации вируса к полученному антигену добавляют бетапропиолактон до конечной концентрации 0,1% и выдерживают в течение 24 ч при температуре +4^oС. Антиген центрифугируют на холоде (+4^oС) в течение 1 ч при 10000 об/мин. После центрифугирования инактивация продолжается еще в течение трех суток. Контроль инактивации осуществляют заражением 5-7 граммовых белых мышей в мозг по 0,02 мл неразведенным антигеном и последовательными его разведениями 10^-1,10^-2. Зараженных животных наблюдают в течение 15 суток. САА разливаются в ампулы по 1 мл и лиофилизируются без наполнителя. Гемагглютинирующую активность антигенов проверяют в реакции гемагглютинации (РГА) с 0,4% взвесью гусиных эритроцитов. Титр антигенов вирусов КЭ и ОГЛ должен быть в РГА не ниже 1:320, титр в РСК с гомологичной иммунной сывороткой не ниже 1:160. При использовании в РТГА сахарозо-ацетоновых антигенов к штамму КЭ Софьин и штамму вируса ОГЛ Боголюбовка, достоверная разница титров антител к гомологичному антигену выявлялась в 1,7 раза чаще при исследовании крови от больных КЭ и в 2,1 раза чаще при исследовании сывороток крови от больных ОГЛ, по сравнению с боратно-солевыми антигенами к этому же штамму вируса ОГЛ и диагностикумом КЭ НПО "Вирион".

11. Получение иммунных сывороток. В качестве материала для иммунизации животных используют 10% вируссодержащую суспензию мозга белых мышей, зараженных используемыми в производстве штаммами вирусов ОГЛ и КЭ.

Инокулят вводят кроликам внутримышечно по 5 мл. Через неделю внутримышечно вводят еще 5 мл 10% вируссодержащей мозговой суспензии. Следующую иммунизацию проводят через неделю внутривенным введением 3 мл вируссодержащей суспензии. Через 10 дней после последней (третьей) иммунизации берут пробу крови. При титре антигемагглютининов и комплементсвязывающих антител ниже 1: 160 повторяют внутримышечное введение 5 мл 10% мозговой вируссодержащей суспензии. Сыворотка должна иметь титр антител с гомологичным антигеном не ниже 1:160 в РТГА и РСК.

Кровь у животных берут через 10 дней после 3-й инъекции из ушной вены (для предварительного исследования) и из сердца. Для образования плотного сгустка кровь помещают в термостат при +37^oС на 30 минут, обводят пастеровской пипеткой и затем для отделения сыворотки помещают в холодильную камеру при +4^oС на 16-18 часов. Через 18 часов сыворотку отсасывают, разливают в ампулы по I мл и лиофилизируют без наполнителя.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами использования заявленного набора для дифференциальной диагностики КЭ и ОГЛ.

Пример 1. Сыворотки крови от больных людей с подозрением на арбовирусные инфекции, взятые в начальном периоде заболевания и реконвалесценции, исследуют в РТГА с использованием сахарозо-ацетоновых антигенов, инактивированных и лиофилизированных, приготовленных из штамма вируса КЭ Софьин и штамма ОГЛ Боголюбовка. Реакцию ставят по общепринятому способу микрометодом на аппарате Такачи с 8 гемагглютинирующими единицами (ГАЕ) антигенов. Результаты исследования сывороток больных представлены в таблице 1.

Пример 2. Материал для исследования штаммы арбовирусов, выделенные в природных очагах ОГЛ и КЭ. По методике, описанной выше, из изолированных штаммов готовят сахарозо-ацетоновые антигены. Для приготовления растворимых антигенов к САА добавляют сухую мочевину (мочевина чда, ГОСТ 6691-67, молекулярный вес 60 Н₂NCONH₂) до конечной концентрации 8 М. Чтобы получить такую концентрацию, надо на каждые 10 мл САА добавить 4,8 г мочевины. При растворении мочевины температура смеси резко снижается. Однако процесс растворения должен быть быстрым, чтобы не было участков с избыточной концентрацией детергента. Химический стакан с обрабатываемым антигеном помещают в водяную баню с температурой 37-40^oС, всю навеску мочевины добавляют сразу и встряхивают стакан 3-4 раза. Мочевина должна раствориться в течение 10-15 секунд. Антиген с растворившейся мочевиной тотчас помещают в термостат (37^oС) на 30 минут, после чего пипеткой собирают его в диализный мешочек.

Диализуют в течение 20-24 часов против 100 объемов боратнаго буферного раствора рН 9,0 (производства Томского НПО "Вирной") при 4^oС для удаления мочевины из препарата.

Чтобы получить РА с титром, достаточным для использования в РСК, необходимо учитывать следующее: обработка мочевиной снижает титр комплементсвязывающей активности в 2-4 раза, поэтому для получения РА можно использовать исходные САА с титром в РСК не ниже 1:160. РА, приготовленный из САА, сохраняет свою активность при 4^oС в течение 2-х месяцев.

Проводят постановку РСК с использованием иммунных сывороток к штамму вируса КЭ Софьин и штамму вируса ОГЛ Боголюбовка. Методом шахматного титрования выявляют взаимодействие различных разведений РА с различными разведениями иммунных сывороток.

Результаты идентификации штаммов вирусов представлены в таблице 2.

РА, полученные к штаммам вируса КЭ, изолированным в различных частях его ареала, в отличие от САА, не реагируют с иммунной сывороткой к вирусу ОГЛ, но во всех случаях вступают во взаимодействие с иммунной сывороткой к вирусу КЭ. РА к штаммам вируса ОГЛ, в свою очередь, не реагируют с иммунной сывороткой к вирусу КЭ, что позволяет идентифицировать данные вирусы без перекрестных реакций.

Эффективность заявленного набора доказана при расшифровке эпидемических вспышек заболеваний неясной этиологии среди населения юга Западной Сибири. Диагностический набор апробирован при серологическом обследовании в динамике 852 больных с подозрением на ИЗ, ОГЛ и другие инфекции, а также при идентификации штаммов вирусов, изолированных в природных очагах омской геморрагической лихорадки и клещевого энцефалита. Идентификация 17 штаммов вируса ОГЛ и 32 штаммов вируса КЭ подтверждена в РН, ИФМ и МГНК. ТТТ1

Использование: вирусология, создание диагностических наборов. Сущность изобретения: диагностический набор включает в себя диагностикумы омской геморрагической лихорадки и клещевого энцефалита, приготовленнные на основе сахарозо-ацетоновой экстракции, и иммуннные сыворотки к возбудителям. 2 табл.

Набор для дифференциальной диагностики омской геморрагической лихорадки и клещевого энцефалита, включающий диагностикумы, отличающийся тем, что он содержит антигены вирусов клещевого энцефалита и омской геморрагической лихорадки приготовленные на основе са- харозоацетоновой экстракции из эталонных штаммов клещевого энцефалита Софьин и Омской геморрагической лихорадки Боголюбовка, и иммунные сыворотки к возбудителям.