СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА ПРИ ИНФЕКЦИИ Helicobacter pylori Российский патент 2008 года по МПК G01N33/50 C12Q1/02 

Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии, и может быть применено в качестве способа определения содержания активных форм кислорода при инфекции Хеликобактер пилори.

Известен способ определения инфекции H.pylori по уреазному дыхательному тесту (1 - McNulty C.A., Wise R. Rapid diagnosis of Campilobacter-associated gastritis / Lancet. 1985; 1 (8443): 1443-4).

Известен способ определения содержания активных форм кислорода, принятый за прототип (2 - Nagata, К., Satoh, H., Iwahi, Т. et al. Antimicr. Agents Chemath'er. 1993; 37, 769-774). Для этого используют следующие реагенты : раствор пероксинитрита и карбокси-2-фенил-4,4,5,5-тетраметилимидазолин-1-оксил-3-оксид (cPTIO), Mn-типа супероксиддисмутаза (SOD) из Е.coli и 2-метил-6-[р-метоксифенил]-3,7-дигидроимидазол[1,2-а]пиразин-3-один (MCLA). Использовали два типа энтеральных микроорганизмов - Е. cell K-12 JM109 и H. pylori. NCTC-11637. Е. coli культивировали с встряхиванием в питательной среде (Difco), содержащей 0,5% NaCl. H. pylori выращивали в среде Brucella broth, содержащей 5% horse aerum в микроаэрофильной атмосфере при 37°С в течение 20 час.

Однако способ-прототип основан на применении сложных дорогостоящих препаратов и не позволяет с достаточной точностью оценить суммарное содержание активных форм кислорода при инфекции Хеликобактер пилори.

Целью изобретения является повышение точности определения суммарного содержания активных форм кислорода при инфекции Хеликобактер пилори.

Технический результат достигается тем, что чистую культуру Helicobacter pylori культивируют при 36,5-37,5°С в микроаэрофильных условиях на агаре Колумбия с добавлением лошадиной крови. После 48-120 часов культивирования колонии микроорганизма снимали с агара, готовили суспензию с оптической плотностью 2,0 в 0,85% растворе NaCl; определяли уровень люминолзависимой хемилюминесценции суспензии HP на хемилюминометре с временем интеграции 10 с в течение 15,5-16,3 минут. В пластиковую кювету вносили 400 мкл 0,85% раствора NaCl, 10^-3 М люминола, 0,71 М NADPH и 500 мкл бактериальной суспензии. В начале третьей минуты записи фонового уровня хемилюминесценции продукцию активных форм кислорода инициировали добавлением в кювету 5 мМ мочевины; определяли соотношение бациллярной и кокковой форм в культуре различного возраста и при достижении соотношения бациллярной формы к кокковой культуре 69-74% определяли высвобождение активных форм кислорода.

Способ осуществляется следующим образом.

Чистую культуру Helicobacter pylori получали из биоптатов слизистой оболочки желудка от больных с хроническим хеликобактерным гастритом путем культивирования при 36,5-37,5°С в микроаэрофильных условиях на агаре Колумбия с добавлением лошадиной крови в течение 48-120 часов. Определяли соотношение бациллярной и кокковой форм в культуре различного возраста. При достижении соотношения доли кокковой флоры 69-74% снимали с агара, готовили суспензию с оптической плотностью 2,0 в 0,85% растворе NaCl, вносили 400 мкл 0,85% раствора NaCl, 10^-3 М люминола, 0,71 М NADPH и 500 мкл бактериальной суспензии. Измеряли люминолзависимую хемилюминесценцию суспензии HP со временем интеграции 10 с, показания регистрировали в течение 15,5-16,3 минут, в начале третьей минуты записи фонового уровня добавляли 5 мМ мочевины и определяли высвобождение активных форм кислорода.

Пример 1

Больной Н., 43 лет, страдает гастродуоденитом. Жалуется на жгучие режущие боли в эпигастральной области после каждого приема пищи. Эндоскопически слизистая желудка гиперемирована, отечна. Отбирали биоптаты слизистой фундального и антрального отделов желудка.

Из биоптатов слизистой оболочки желудка получали чистую культуру Helicobacter pylori путем культивирования при 36,5°С в микроаэрофильных условиях на агаре Колумбия с добавлением лошадиной крови в течение 48 часов. После 48 часов культивирования колонии микроорганизма снимали с агара и после биохимического тестирования готовили суспензию с оптической плотностью 2,0 по МакФарланду (McF) в 0,85% растворе NaCl.

Измеряли люминолзависимую хемилюминесценцию суспензии HP на хемилюминометре Lumat LB 9507 со временем интеграции 10 с. Показания регистрировали в течение 15,5 минут. В пластиковую кювету вносили 400 мкл 0,85% раствора NaCl, 10^-3 М люминола, 0,71 М NADPH и 500 мкл бактериальной суспензии. Определяют соотношение бациллярной и кокковой форм в культуре различного возраста и при достижении соотношения доли кокковой флоры 69% в начале третьей минуты записи фонового уровня добавляют 5 мМ мочевины и определяют высвобождение активных форм кислорода.

48-часовая культура продуцирует активные формы кислорода в количестве 680 mV/McF в течение 12 мин с максимумом на 6 мин.

Пример 2

Больная Ж., 38 лет, страдает язвенной болезнью желудка. При поступлении предъявляет жалобы на боли в эпигастральной области натощак, стихающие после приема пищи. Эндоскопически слизистая желудка гиперемирована, отечна. По малой кривизне в области тела желудка определяется язвенный дефект овальной формы с подрытыми краями, дно выполнено серым налетом. Отбирали биоптаты слизистой фундального и антрального отделов желудка.

Из биоптатов слизистой оболочки желудка получали чистую культуру Helicobacter pylori путем культивирования при 37,5°С в микроаэрофильных условиях на агаре Колумбия с добавлением лошадиной крови в течение 120 часов. После 120 часов культивирования колонии определяли соотношение бациллярной и кокковой форм в 120-часовой культуре и при достижении соотношения доли кокковой флоры 70%. Культуру микроорганизма снимали с агара и после биохимического тестирования готовили суспензию с оптической плотностью 2,0 по МакФарланду (McF) в 0,85% растворе NaCl.

Определяли уровень люминолзависимой хемилюминесценции суспензии HP на хемилюминометре Lumat LB 9507 со временем интеграции 10 с. Показания регистрировали в течение 16,3 минут. В пластиковую кювету вносили 400 мкл 0,85% раствора NaCl, 10^-3 М люминола, 0,71 М NADPH и 500 мкл бактериальной суспензии. В начале третьей минуты записи фонового уровня хемилюминесценции продукцию активных форм кислорода инициировали добавляя 5 мМ мочевины. Способность к продукции и высвобождению активных форм кислорода у 120-часовой культуры H. pylori составила: 120-часовая культура продуцирует активные формы кислорода в количестве 780 mV/McF в течение 13 мин с максимумом на 6,5 мин.

Пример 3

Больной К-в, 57 лет, страдает язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки. При поступлении жалуется на боли в эпигастральной области натощак, ночные боли, стихающие после приема пищи. Эндоскопически: слизистая желудка отечна. В фундальном отделе желудка определяют дефект слизисто-подслизистого слоя звездчатой формы с подрытыми гиперемированными краями, дно выполнено серо-желтым налетом. В области луковицы двенадцатиперстной кишки определяется дефект слизистой округлой формы диаметром 1,5 см с отечными краями. На дне определяется инъецированный сосуд. Отбирали биоптаты слизистой фундального и антрального отделов желудка и бульбарного отдела двенадцатиперстной кишки.

Из биоптатов слизистой оболочки получали чистую культуру Helicobacter pylori путем культивирования при 37°С в микроаэрофильных условиях на агаре Колумбия с добавлением лошадиной крови в течение 72 часов. После 72 часов культивирования определяли соотношение бациллярной и кокковой форм в культуре и при достижении соотношения доли кокковой флоры 74% культуру снимали с агара и после биохимического тестирования готовили суспензию с оптической плотностью 2,0 по МакФарланду (McF) в 0,85% растворе NaCl.

Определяли уровень люминолзависимой хемилюминесценции суспензии HP на хемилюминометре Lumat LB 9507 со временем интеграции 10 с. Показания регистрировали в течение 16 минут. В пластиковую кювету вносили 400 мкл 0,85% раствора NaCl, 10^-3 М люминола, 0,71 М NADPH и 500 мкл бактериальной суспензии. В начале третьей минуты записи фонового уровня хемилюминесценции продукцию активных форм кислорода инициировали, добавляя 5 мМ мочевины, и определяли высвобождение активных форм кислорода. Способность к продукции и высвобождению активных форм кислорода у 72-часовой культуры H. pylori составила: 72-часовая культура продуцирует активные формы кислорода в количестве 1730 mV/McF в течение 12,5 мин с максимумом на 6,3 мин.

Проведено определение уровня продуцирования активных форм кислорода из 56 биоптатов 24 больных. Получено, что оптимальным сроком культивирования культуры H. pylori является 72-часовая культура, в которой наблюдаются оптимальные показатели соотношения бациллярной и кокковой форм микрофлоры и динамика продукции суммарного количества АФК. Продукты окислительно-восстановительных реакций, воздействуя на уровни ферментных систем и генов-регуляторов, активируют клеточную пролиферацию, усиливают процесс запрограммированной клеточной гибели - апоптоз и повреждают носитель генетической стабильности клетки ДНК. Нерепарируемые повреждения ДНК - мутации во много раз повышают вероятность развития злокачественных опухолей в слизистой оболочке желудка.

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии, и может быть применено в качестве способа определения содержания активных форм кислорода при инфекции Хеликобактер пилори. Предложенный способ заключается в том, что чистую культуру Helicobacter pylori культивируют при 36,5-37,5°С в микроаэрофильных условиях на агаре Колумбия с добавлением лошадиной крови, после 48-120 часов культивирования колонии микроорганизма определяют соотношение бациллярной и кокковой форм в культуре различного возраста и при достижении соотношения доли кокковой флоры 69-74% снимают с агара, готовят суспензию с оптической плотностью 2,0 в 0,85% растворе NaCl, вносят 400 мкл 0,85% раствора NaCl, 10^-3 М люминола, 0,71 М NADPH и 500 мкл бактериальной суспензии, измеряют люминолзависимую хемилюминесценцию суспензии HP со временем интеграции 10 с, показания регистрируют в течение 15,5-16,3 минут, в начале третьей минуты записи фонового уровня добавляют 5 mM мочевины и определяют высвобождение активных форм кислорода. Использование способа обеспечивает повышение точности определения суммарного содержания активных форм кислорода при инфекции Хеликобактер пилори.

Способ определения содержания активных форм кислорода в культуре H.pylori, включающий культивирование в питательной среде в микроаэрофильной атмосфере, отличающийся тем, что чистую культуру Helicobacter pylori культивируют при 36,5-37,5°С в микроаэрофильных условиях на агаре Колумбия с добавлением лошадиной крови, после 48-120 ч культивирования колонии микроорганизма определяют соотношение бациллярной и кокковой форм в культуре различного возраста и при достижении соотношения доли кокковой флоры 69-74% снимают с агара, готовят суспензию с оптической плотностью 2,0 в 0,85%-ном растворе NaCl, вносят 400 мкл 0,85%-ного раствора NaCl, 10^-3 М люминола, 0,71 М NADPH и 500 мкл бактериальной суспензии, измеряют люминолзависимую хемилюминесценцию суспензии HP со временем интеграции 10 с, показания регистрируют в течение 15,5-16,3 мин, в начале третьей минуты записи фонового уровня добавляют 5 мМ мочевины и определяют высвобождение активных форм кислорода.