Способ оценки антагонистической активности лактобактерий толстокишечного биотопа пациента относительно разнообразных бактерий двухэтапным культивированием микроорганизма-антагониста и тестируемой культуры в условиях комбинированной системы Российский патент 2018 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 G01N33/48 C12R1/225 

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу оценки антагонистической активности лактобактерий толстокишечного биотопа пациента относительно разнообразных бактерий двухэтапным культивированием микроорганизма-антагониста и тестируемой культуры в условиях комбинированной системы и может быть использовано при бактериологической оценке состояния содержимого толстокишечного биотопа для оценки функциональной активности лактобактерий в условиях колопроктологических, хирургических и других стационаров.

Известен способ оценки антагонистической активности лактобацилл толстого кишечника, включающий заполнение рабочего объема пластиковой вентилируемой чашки Петри однократного применения диаметром 90 мм 25 мл среды расплавленного агара Де Манна-Рогоза-Шарпе (MRS-агара) и после застывания рассечение агаровой пластины стерильным скальпелем по диаметру чашки Петри на две равные части, удаляют одну их них и освободившийся объем заливают до уровня первоначального агара (MRS-агара) расплавленного триптиказо-соевый агара (TSA) для культивирования неприхотливых микроорганизмов, или расплавленного агара Sabouraud для культивирования грибов, или расплавленного агара Columbia с 5% (об./об.) дефибрированной цельной бараньей крови для культивирования стрептококков, или расплавленного агара Columbia с 10% (об./об.) дефибрированной цельной бараньей крови для культивирования кампилобактерий (С. jejuni), или расплавленного Brucella агара с 7% (об./об.) дефибрированной цельной крови барана для культивирования клостридий, затем выполнение первого этапа культивирования микроорганизма-антагониста равномерным нанесением 0,1 мл суспензии исследуемой лактобактерий толстокишечного биотопа пациента с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF на поверхность MRS-агара и инкубирование созданного посева исследуемой лактобактерий, затем, по завершению первого этапа, нанесение на поверхность второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования равномерно 0,1 мл суспензии тестируемой культуры с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF и выполнение инкубирования, по завершению второго этапа культивирования микроорганизма-антагониста выполняют оценку функциональной антагонистической активности тестируемой культуры по величине измеряемого в миллиметрах расстояния от середины края газона лактобактерий в перпендикулярном ему направлении до фронтальной точки края газона тестируемой культуры, причем длина измеренной зоны роста тестируемой культуры свидетельствует о величине задержки направленной относительно нее антагонистической активности исследуемой лактобактерий, (см. Сухина М.А., Бургасова О.А. и др. «Антагонистическая активность лактобацилл толстого кишечника», Журнал Микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 2012, №1, с 41-49).

Однако известный способ оценки антагонистической активности лактобацилл толстого кишечника при своем использовании имеет следующие недостатки:

- недостаточно обеспечивает возможность оценки антагонистической активности лактобактерий в отношении различных физиологических потребностей каждого микроорганизма,

- не обеспечивает заданной точности оценки функциональной антагонистической активности лактобактерий толстокишечного биотопа пациента,

- не обеспечивает расширения спектра тестируемых микроорганизмов для конкретного пациента,

- обладает недостаточной диагностической информативностью исследования микрофлоры кишечника пациента,

- не позволяет охарактеризовать функциональную способность лактофлоры и бифидофлоры,

- не позволяет изучить механизмы формирования и функционирования микробиоценозов, направленных на поддержание колонизационной резистентности биотопа.

Задачей изобретения является создание способа оценки антагонистической активности лактобактерий толстокишечного биотопа пациента относительно разнообразных бактерий двухэтапным культивированием микроорганизма-антагониста и тестируемой культуры в условиях комбинированной системы.

Техническим результатом является обеспечение возможности оценки антагонистической активности лактобактерий в отношении различных физиологических потребностей каждого микроорганизма, обеспечение повышения точности оценки функциональной антагонистической активности лактобактерий толстокишечного биотопа пациента, обеспечение расширения спектра тестируемых микроорганизмов для конкретного пациента, значительное повышение диагностической информативности исследования микрофлоры кишечника пациента, обеспечение возможности охарактеризовать функциональную способность лактофлоры и бифидофлоры, а также обеспечение возможности изучения механизмов формирования и функционирования микробиоценозов, направленных на поддержание колонизационной резистентности биотопа.

Технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что предложен способ оценки антагонистической активности лактобактерий толстокишечного биотопа пациента относительно разнообразных бактерий двухэтапным культивированием микроорганизма-антагониста и тестируемой культуры в условиях комбинированной системы, характеризующийся тем, что в рабочий объем пластиковой вентилируемой чашки Петри однократного применения диаметром 90 мм заливают 25 мл среды расплавленного агара Де Манна-Рогоза-Шарпе (MRS-агара) и после застывания агаровую пластину рассекают стерильным скальпелем по диаметру чашки Петри на две равные части, удаляют одну их них и освободившийся объем заливают до уровня первоначального агара (MRS-агара) 12-13 мл расплавленного триптиказо-соевого агара (TSA) для культивирования неприхотливых микроорганизмов, или расплавленного агара Sabouraud для культивирования грибов, или расплавленного агара Columbia с 5% (об/об) дефибрированной цельной бараньей крови для культивирования стрептококков, или расплавленного агара Columbia с 10% (об/об) дефибрированной цельной бараньей крови для культивирования кампилобактерий (С. jejuni), или расплавленного агара Columbia с 7% (об/об) дефибрированной лизированной лошадиной крови для культивирования штамма Helicobacter pylori или расплавленного Brucella агара с 7% (об/об) дефибрированной цельной крови барана для культивирования клостридий, затем выполняют первый этап культивирования микроорганизма-антагониста равномерным нанесением 0,1 мл суспензии исследуемой лактобактерий толстокишечного биотопа пациента с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF на поверхность MRS-агара и созданный посев исследуемой лактобактерий инкубируют при температуре 37°С в течение 24-48 часов в обогащенной 5-10% (об/об) углекислым газом атмосфере, затем, по завершению первого этапа, на поверхность второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования равномерно наносят 0,1 мл суспензии тестируемой культуры с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF и нанесенные посевы инкубируют при следующих параметрах по температуре, времени инкубации и используемой атмосфере, при этом культивирование неприхотливых микроорганизмов осуществляют в воздушной атмосфере инкубатора температуре 37°С в течение 24 часов, культивирование грибов осуществляют в атмосфере инкубатора при температуре 28°С в течение 24 часов, культивирование стрептококков осуществляют в атмосфере СО₂ инкубатора при температуре 37°С в течение 24 часов, культивирование кампилобактерий осуществляют при температуре 37°С в течение 48 часов в микроаэробной атмосфере на основе азота, содержащей 10% (об/об) углекислого газа (СO₂) и 5% (об/об) кислорода, культивирование штамма Helicobacter pylori осуществляют при температуре 37°С в течение 48-72 часов в микроаэробной атмосфере на основе азота, содержащей 10% (об/об) углекислого газа (СО₂) и 5% (об/об) кислорода и культивирование клостридий осуществляют при температуре 37°С в течение 48-72 часа в строгой анаэробной атмосфере на основе азота, содержащей 5% (об/об) водорода и 10% (об/об) углекислого газа, по завершению второго этапа культивирования микроорганизма-антагониста выполняют оценку антагонистической активности тестируемой культуры по величине измеряемого в миллиметрах расстояния от середины края газона лактобактерий в перпендикулярном ему направлении до фронтальной точки края газона тестируемой культуры, причем длина измеренной зоны роста тестируемой культуры свидетельствует о величине задержки направленной относительно нее антагонистической активности исследуемой лактобактерий, при этом измеренную зону задержки роста тестируемой культуры длиной до 1 мм расценивают как отсутствие антагонистической активности лактобактерий, измеренную зону задержки роста тестируемой культуры длиной от 1 до 10 мм расценивают как низкую антагонистическую активность лактобактерий, измеренную зону задержки роста тестируемой культуры длиной от 11 до 29 мм расценивают как умеренную антагонистическую активность лактобактерий и измеренную зону задержки роста штамма лактобактерий шириной от 30 до 45 мм расценивают как высокую антагонистическую активность. При этом в процессе нанесения на поверхность второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования в качестве тестируемой культуры клостридий и стрептококков применяют тестируемые суспензии с плотностью бактериальной взвеси 2,0 McF. При этом в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют неприхотливые микроорганизмы Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica Serovar Enteritidis и Klebsiella pneumoniae. При этом в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют грибы Candida albicans и Candida tropicalis. При этом в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют стрептококки Streptococcus pyogenes и Streptococcus mitis. При этом в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют кампилобактерий Campylobacter jejuni NCTC 11638. При этом в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют штамм Helicobacter pylori NCTC 11639. При этом в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют клостридии Clostridium difficile, Clostridium perfringens и Clostridium septicum.

Способ осуществляют следующим образом. В рабочий объем пластиковой вентилируемой чашки Петри однократного применения диаметром 90 мм заливают 25 мл среды расплавленного агара Де Манна-Рогоза-Шарпе (MRS-агара) и после застывания агаровую пластину рассекают стерильным скальпелем по диаметру чашки Петри на две равные части. Удаляют одну их них и освободившийся объем заливают до уровня первоначального агара (MRS-агара) 12-13 мл расплавленного триптиказо-соевого агара (TSA) для культивирования неприхотливых микроорганизмов, или расплавленного агара Sabouraud для культивирования грибов, или расплавленного агара Columbia с 5% (об/об) дефибрированной цельной бараньей крови для культивирования стрептококков, или расплавленного агара Columbia с 10% (об/об) дефибрированной цельной бараньей крови для культивирования кампилобактерий (С. jejuni), или расплавленного агара Columbia с 7% (об/об) дефибрированной лизированной лошадиной крови для культивирования Helicobacter pylori или расплавленного Brucella агара с 7% (об/об) дефибрированной цельной крови барана для культивирования клостридий с образованием второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования.

При этом в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют неприхотливые микроорганизмы Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica Serovar Enteritidis и Klebsiella pneumoniae. При этом в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют грибы Candida albicans и Candida tropicana. При этом в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют стрептококки Streptococcus pyogenes и Streptococcus mitis. При этом в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют кампилобактерий Campylobacter jejuni NCTC 11638. При этом в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют штамм Helicobacter pylori NCTC 11639. При этом в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют клостридии Clostridium difficile, Clostridium perfringens и Clostridium septicum.

Затем выполняют первый этап культивирования микроорганизма-антагониста равномерным нанесением 0,1 мл суспензии исследуемой лактобактерий толстокишечного биотопа пациента с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF на поверхность MRS-агара.

Созданный посев исследуемой лактобактерий инкубируют при температуре 37°С в течение 24-48 часов в обогащенной 5-10% (об/об) углекислым газом атмосфере.

По завершению первого этапа, на поверхность второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования равномерно наносят 0,1 мл суспензии тестируемой культуры с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF и нанесенные посевы инкубируют при следующих параметрах по температуре, времени инкубации и используемой атмосфере.

При этом культивирование неприхотливых микроорганизмов осуществляют в воздушной атмосфере инкубатора температуре 37°С в течение 24 часов. При этом культивирование грибов осуществляют в атмосфере инкубатора при температуре 28°С в течение 24 часов. При этом культивирование стрептококков осуществляют в атмосфере СО₂ инкубатора при температуре 37°С в течение 24 часов. При этом культивирование кампилобактерий осуществляют при температуре 37°С в течение 48 часов в микроаэробной атмосфере на основе азота, содержащей 10% (об/об) углекислого газа (СО₂) и 5% (об/об) кислорода. При этом культивирование Helicobacter pylori осуществляют при температуре 37°С в течение 48-72 часов в микроаэробной атмосфере на основе азота, содержащей 10% (об/об) углекислого газа (СО₂) и 5% (об/об) кислорода. При этом культивирование Clostridium difficile и других видов клостридий осуществляют при температуре 37°С в течение 48-72 часа в строгой анаэробной атмосфере на основе азота, содержащей 5% (об/об) водорода и 10% (об/об) углекислого газа. При этом в процессе нанесения на поверхность второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования в качестве тестируемой культуры клостридий и стрептококков применяют тестируемые суспензии с плотностью бактериальной взвеси 2,0 McF.

По завершению второго этапа культивирования микроорганизма-антагониста выполняют оценку антагонистической активности тестируемой культуры по величине измеряемого в миллиметрах расстояния от середины края газона лактобактерий в перпендикулярном ему направлении до фронтальной точки края газона тестируемой культуры. Причем длина измеренной зоны роста тестируемой культуры свидетельствует о величине задержки направленной относительно нее антагонистической активности исследуемой лактобактерий Измеренную зону задержки роста тестируемой культуры длиной до 1 мм расценивают как отсутствие антагонистической активности лактобактерий. Измеренную зону задержки роста тестируемой культуры длиной от 1 до 10 мм расценивают как низкую антагонистическую активность лактобактерий. Измеренную зону задержки роста тестируемой культуры длиной от 11 до 29 мм расценивают как умеренную антагонистическую активность лактобактерий. Измеренную зону задержки роста штамма лактобактерий шириной от 30 до 45 мм расценивают как высокую антагонистическую активность.

Среди существенных признаков, характеризующих предложенный способ оценки антагонистической активности лактобактерий толстокишечного биотопа пациента относительно разнообразных бактерий двухэтапным культивированием микроорганизма-антагониста и тестируемой культуры в условиях комбинированной системы, отличительными являются:

- дополнительное заполнение освободившегося рабочего объема чашки Петри до уровня первоначального агара (MRS-агара) 12-13 мл расплавленным агаром Columbia с 7% (об/об) дефибрированной лизированной лошадиной крови для культивирования Helicobacter pylori,

- инкубирование созданного посева исследуемой лактобактерий при температуре 37°С в течение 24-48 часов в обогащенной 5-10% (об/об) углекислым газом атмосфере,

- инкубирование по завершению первого этапа, нанесенных посевов при следующих параметрах по температуре, времени инкубации и используемой атмосфере для следующих микроорганизмов:

- культивирование неприхотливых микроорганизмов осуществляют в воздушной атмосфере инкубатора температуре 37°С в течение 24 часов,

- культивирование грибов осуществляют в атмосфере инкубатора при температуре 28°С в течение 24 часов,

- культивирование стрептококков осуществляют в атмосфере СО₂ инкубатора при температуре 37°С в течение 24 часов,

- культивирование кампилобактерий осуществляют при температуре 37°С в течение 48 часов в микроаэробной атмосфере на основе азота, содержащей 10% (об/об) углекислого газа (СO₂) и 5% (об/об) кислорода,

- культивирование Helicobacter pylori осуществляют при температуре 37°С в течение 48-72 часов в микроаэробной атмосфере на основе азота, содержащей 10% (об/об) углекислого газа (СO₂) и 5% (об/об) кислорода,

- культивирование клостридий осуществляют при температуре 37°С в течение 48-72 часа в строгой анаэробной атмосфере на основе азота, содержащей 5% (об/об) водорода и 10% (об/об) углекислого газа,

- измеренную зону задержки роста тестируемой культуры длиной до 1 мм расценивают как отсутствие антагонистической активности лактобактерий,

- измеренную зону задержки роста тестируемой культуры длиной от 1 до 10 мм расценивают как низкую антагонистическую активность лактобактерий,

- измеренную зону задержки роста тестируемой культуры длиной от 11 до 29 мм расценивают как умеренную антагонистическую активность лактобактерий,

- измеренную зону задержки роста штамма лактобактерий шириной от 30 до 45 мм расценивают как высокую антагонистическую активность.

- применение в процессе нанесения на поверхность второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования в качестве тестируемой культуры клостридий и стрептококков тестируемых суспензий с плотностью бактериальной взвеси 2,0 McF,

- использование в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, неприхотливых микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica Serovar Enteritidis и Klebsiella pneumoniae.

- использование в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, грибов Candida albicans и Candida Tropicalis,

- использование в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, стрептококков Streptococcus pyogenes и Streptococcus mitis,

- использование в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, кампилобактерий Campylobacter jejuni NCTC 11638.

- использование в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, штамма Helicobacter pylori NCTC 11639.

- использование в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, клостридий Clostridium difficile, Clostridium perfringens и Clostridium septicum.

Клинические исследования и практическое использование предложенного способа оценки антагонистической активности лактобактерий толстокишечного биотопа пациента относительно разнообразных бактерий двухэтапным культивированием микроорганизма-антагониста и тестируемой культуры в условиях комбинированной системы показали его высокую эффективность. Предложенный способ оценки антагонистической активности лактобактерий толстокишечного биотопа пациента относительно разнообразных бактерий двухэтапным культивированием микроорганизма-антагониста и тестируемой культуры в условиях комбинированной системы при своем использовании обеспечил возможность оценки антагонистической активности лактобактерий в отношении различных физиологических потребностей каждого микроорганизма, обеспечил повышение на 60-70% точности оценки функциональной антагонистической активности лактобактерий толстокишечного биотопа пациента, обеспечил расширение спектра тестируемых микроорганизмов для конкретного пациента Кроме того, предложенный способ обеспечил значительное повышение диагностической информативности исследования микрофлоры кишечника пациента, обеспечил возможность охарактеризовать функциональную способность лактофлоры и бифидофлоры, а также обеспечил возможности изучения механизмов формирования и функционирования микробиоценозов, направленных на поддержание колонизационной резистентности биотопа.

Реализация предложенного способа оценки антагонистической активности лактобактерий толстокишечного биотопа пациента относительно разнообразных бактерий двухэтапным культивированием микроорганизма-антагониста и тестируемой культуры в условиях комбинированной системы поясняется следующими клиническими примерами.

Пример 1. Пациентка П., 58 лет, ФГБУ «ГНЦК им. А.Н. Рыжих» Минздрава России. Проведено исследование основной микрофлоры толстого кишечника с определением качественного и количественного состава микроорганизмов. Были выделены лактобактерий в титре 10⁹ КОЕ/г и представители условно-патогенной микрофлоры Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus и Klebsiella pneumoniae в титре более 10⁸ КОЕ/г. Кроме этого был выделен патогенный микроорганизм Salmonella enterica serovar enteritidis. Для оценки активности лактобактерий пациента был использован способ оценки антагонистической активности лактобактерий толстокишечного биотопа пациента относительно разнообразных бактерий двухэтапным культивированием микроорганизма-антагониста и тестируемой культуры в условиях комбинированной системы.

В рабочие объемы четырех пластиковых вентилируемых чашек Петри однократного применения диаметром 90 мм залили по 25 мл среды расплавленного агара Де Манна-Рогоза-Шарпе (MRS-агара) и после застывания агаровые пластины рассекли стерильным скальпелем по диаметру чашки Петри на две равные части. Удалили каждую одну их них и освободившийся объем залили до уровня первоначального агара (MRS-агара) 12 мл расплавленного триптиказо-соевого агара (TSA) для культивирования неприхотливых микроорганизмов с образованием второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования. При этом в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучали антагонистическую активность лактобактерий, использовали неприхотливые микроорганизмы Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica serovar enteritidis и Klebsiella pneumoniae.

Затем выполнили первый этап культивирования микроорганизма-антагониста. Равномерно нанесли 0,1 мл суспензии исследуемой лактобактерий толстокишечного биотопа пациентки с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF на поверхность MRS-агара. Созданный посев исследуемой лактобактерий инкубировали при температуре 37°С в течение 24 часов в обогащенной 10% (об/об) углекислым газом атмосфере.

По завершению первого этапа, на поверхность второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования равномерно нанесли 0,1 мл суспензии тестируемой культуры с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF и нанесенные посевы инкубировали в воздушной атмосфере инкубатора при температуре 37°С в течение 24 часов.

По завершению второго этапа культивирования микроорганизма-антагониста выполнили оценку антагонистической активности тестируемой культуры по величине измеренного в миллиметрах расстояния от середины края газона лактобактерий в перпендикулярном ему направлении до фронтальной точки края газона тестируемой культуры. Установили, что измеренная зона задержки роста тестируемой культуры составили для Pseudomonas aeruginosa 8 мм, для Staphylococcus aureus 10 мм, для Salmonella enterica serovar enteritidis 4 мм и для Klebsiella pneumoniae 8 мм, что позволило расценить как низкую антагонистическую активность лактобактерий, не обеспечивающую колонизационную резистентность макроорганизма, не смотря на высокий титр присутствия лактобактерий в толстокишечном биотопе у данной пациентки.

Пример 2. Пациентка П., 58 лет, ФГБУ «ГНЦК им. А.Н. Рыжих» Минздрава России. Проведено исследование основной микрофлоры толстого кишечника с определением качественного и количественного состава микроорганизмов. Были выделены лактобактерий в титре 10⁶ КОЕ/г и представители условно-патогенной микрофлоры грибы Candida albicans и Candida tropicalis в титре более 10⁴ КОЕ/г. Для оценки антагонистической активности лактобактерий в отношении грибов был использован следующий способ.

В рабочее пространство двух пластиковых вентилируемых чашек Петри однократного применения диаметром 90 мм залили по 25 мл среды расплавленного агара Де Манна-Рогоза-Шарпе (MRS-агара) и после застывания агаровые пластины рассекли стерильным скальпелем по диаметру чашки Петри на две равные части. Удалили каждую одну часть их них и в освободившийся объем залили до уровня первоначального агара (MRS-агара) по 12 мл расплавленного агара Sabouraud для культивирования грибов с образованием второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования. При этом в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучали антагонистическую активность лактобактерий, использовали грибы Candida albicans и Candida tropicalis.

Затем выполнили первый этап культивирования микроорганизма -антагониста. Равномерно нанесли 0,1 мл суспензии исследуемой лактобактерий толстокишечного биотопа пациентки с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF на поверхность MRS-агара. Созданный посев исследуемой лактобактерий инкубировали при температуре 37°С в течение 36 часов в обогащенной 7,5% (об/об) углекислым газом атмосфере.

По завершению первого этапа, на поверхность второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования равномерно нанесли 0,1 мл суспензии тестируемой культуры с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF и нанесенные посевы инкубировали в воздушной атмосфере инкубатора при температуре 28°С в течение 48 часов.

По завершению второго этапа культивирования микроорганизма-антагониста выполнили оценку функциональной антагонистической активности тестируемой культуры по величине измеренного в миллиметрах расстояния от середины края газона лактобактерий в перпендикулярном ему направлении до фронтальной точки края газона тестируемой культуры. Установили, что измеренная зона задержки роста тестируемой культуры составили для Candida albicans 32 мм, и для Candida tropicalis 35 мм, что позволило расценить антагонистическую активность лактобактерий в биотопе пациентки как высокую, обеспечивающую колонизационную резистентность макроорганизма; и характеризовать данный кишечный биотоп как нормоценоз, не смотря на титр лактобацилл 10⁶ КОЕ/г.

Пример 3. Пациентка П., 58 лет, ФГБУ «ГНЦК им. А.Н. Рыжих» Минздрава России. Проведено исследование основной микрофлоры толстого кишечника с определением качественного и количественного состава микроорганизмов. Были выделены лактобактерий в титре 10⁸ КОЕ/г и представители условно-патогенной микрофлоры Streptococcus pyogenes и Streptococcus mitis в титре более 10⁹ КОЕ/г.

В рабочее пространство двух пластиковых вентилируемых чашек Петри однократного применения диаметром 90 мм залили по 25 мл среды расплавленного агара Де Манна-Рогоза-Шарпе (MRS-агара) и после застывания агаровые пластины рассекли стерильным скальпелем по диаметру чашки Петри на две равные части. Удалили каждую одну их них и в освободившийся объем каждой чашки залили до уровня первоначального агара (MRS-агара) по 12,5 мл расплавленного агара Columbia с 5% (об/об) дефибрированной цельной бараньей крови для культивирования стрептококков с образованием второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования. При этом в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучали антагонистическую активность лактобактерий, использовали стрептококки Streptococcus pyogenes и Streptococcus mitis.

Затем выполнили первый этап культивирования микроорганизма-антагониста. Равномерно нанесли 0,1 мл суспензии исследуемой лактобактерий толстокишечного биотопа пациентки с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF на поверхность MRS-агара. Созданный посев исследуемой лактобактерий инкубировали при температуре 37°С в течение 48 часов в обогащенной 5% (об/об) углекислым газом атмосфере.

По завершению первого этапа, на поверхность второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования равномерно нанесли 0,1 мл суспензии тестируемой культуры с мутностью бактериальной взвеси 2,0 McF и нанесенные посевы инкубировали в атмосфере СО₂ инкубатора при температуре 37°С в течение 24 часов.

По завершению второго этапа культивирования микроорганизма-антагониста выполнили оценку функциональной антагонистической активности тестируемой культуры по величине измеренного в миллиметрах расстояния от середины края газона лактобактерий в перпендикулярном ему направлении до фронтальной точки края газона тестируемой культуры. Установили, что измеренная зона задержки роста тестируемой культуры составили для Streptococcus pyogenes 15 мм и для Streptococcus mitis 19 мм, что позволило расценить как умеренную антагонистическую активность лактобактерий против изученных штаммов условно-патогенных микроорганизмов.

Пример 4. Пациентка В., 63 лет, ФГБУ «ГНЦК им. А.Н. Рыжих» Минздрава России. Проведено исследование основной микрофлоры толстого кишечника с определением качественного и количественного состава микроорганизмов. Были выделены лактобактерий в титре 10⁹ КОЕ/г и представители условно-патогенной микрофлоры в титре более 10⁶ КОЕ/г. Кроме этого был выделен Campylobacter jejuni в титре 10⁵ КОЕ/г. Для оценки антагонистической активности лактобактерий против Campylobacter jejuni был использован следующий способ.

В рабочее пространство пластиковой вентилируемой чашки Петри однократного применения диаметром 90 мм залили 25 мл среды расплавленного агара Де Манна-Рогоза-Шарпе (MRS-агара) и после застывания агаровую пластину рассекли стерильным скальпелем по диаметру чашки Петри на две равные части. Удалили одну их них и освободившийся объем залили до уровня первоначального агара (MRS-агара) 13 мл расплавленного агара Columbia с 10% (об/об) дефибрированной цельной бараньей крови для культивирования кампилобактерий Campylobacter jejuni NCTC 11638 с образованием второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования.

Затем выполнили первый этап культивирования микроорганизма-антагониста. Равномерно нанесли 0,1 мл суспензии исследуемой лактобактерий толстокишечного биотопа пациентки с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF на поверхность MRS-агара. Созданный посев исследуемой лактобактерий инкубировали при температуре 37°С в течение 48 часов в обогащенной 10% (об/об) углекислого газа атмосфере.

По завершению первого этапа, на поверхность второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования равномерно нанесли 0,1 мл суспензии тестируемой культуры с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF и нанесенные посевы инкубировали при температуре 37°С в течение 48 часов в микроаэробной атмосфере на основе азота, содержащей 10% (об/об) углекислого газа (СO₂) и 5% (об/об) кислорода.

По завершению второго этапа культивирования микроорганизма-антагониста выполнили оценку функциональной антагонистической активности тестируемой культуры по величине измеренного в миллиметрах расстояния от середины края газона лактобактерий в перпендикулярном ему направлении до фронтальной точки края газона тестируемой культуры. Установили, что измеренная зона задержки роста тестируемой культуры составили для Campylobacter jejuni NCTC 11638 38 мм, что позволило расценить как высокую антагонистическую активность лактобактерий толстокишечного биотопа пациентки против Campylobacter jejuni.

Пример 5. Пациентка В., 63 лет, ФГБУ «ГНЦК им. А.Н. Рыжих» Минздрава России. Проведено исследование основной микрофлоры толстого кишечника с определением качественного и количественного состава микроорганизмов. Были выделены лактобактерий в титре 10⁹ КОЕ/г и представители условно-патогенной микрофлоры в титре более 10⁶ КОЕ/г. Кроме этого был выделен Helicobacter pylori из биоптата желудка. Для оценки антагонистической активности лактобактерий против Helicobacter pylori был использован следующий способ.

В рабочее пространство трех пластиковых вентилируемых чашек Петри однократного применения диаметром 90 мм залили по 25 мл среды расплавленного агара Де Манна-Рогоза-Шарпе (MRS-агара) и после застывания агаровые пластины рассекли стерильным скальпелем по диаметру чашки Петри на две равные части. Удалили каждую одну часть их них и освободившийся объем трех чашек Петри залили до уровня первоначального агара (MRS-агара) по 12 мл расплавленного агара с 7% (об/об) дефибрированной лизированной лошадиной крови для культивирования штамма Helicobacter pylori NCTC 11639 с образованием второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования.

Затем выполнили первый этап культивирования микроорганизма-антагониста. Равномерно нанесли 0,1 мл суспензии исследуемой лактобактерий толстокишечного биотопа пациентки с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF на поверхность MRS-агара. Созданный посев исследуемой лактобактерий инкубировали при температуре 37°С в течение 24 часов в обогащенной 10% (об/об) углекислым газом атмосфере.

По завершению первого этапа, на поверхность второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования равномерно нанесли по 0,1 мл суспензии тестируемой культуры с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF и нанесенные посевы инкубировали при температуре 37°С в микроаэробной атмосфере на основе азота, содержащей 10% (об/об) углекислого газа (СO₂) и 5% (об/об) кислорода соответственно в течение 60 и 72 часов.

По завершению второго этапа культивирования микроорганизма-антагониста выполнили оценку антагонистической активности тестируемой культуры по величине измеренного в миллиметрах расстояния от середины края газона лактобактерий в перпендикулярном ему направлении до фронтальной точки края газона тестируемой культуры. Установили, что измеренная зона задержки роста тестируемой культуры составили для Helicobacter pylori NCTC 11639 при инкубировании в течение 60 часов 38 мм и при инкубировании в течение 72 часов 35 мм, что позволило расценить как высокую антагонистическую активность лактобактерий против Helicobacter pylori NCTC 11639.

Пример 6. Пациентка В., 63 лет, ФГБУ «ГНЦК им. А.Н. Рыжих» Минздрава России. Проведено исследование основной микрофлоры толстого кишечника с определением качественного и количественного состава микроорганизмов. Были выделены лактобактерий в титре 10⁹ КОЕ/г и представители условно-патогенной микрофлоры Clostridium perfringens и Clostridium septicum. в титре более 10⁶ КОЕ/г. Кроме этого была выделена токсигенная Clostridium difficile, продуцирующая токсины А, В и бинарный токсин в титре 10⁸ КОЕ/г. Для оценки антагонистической активности лактобактерий у данной пациентки была использован следующий способ.

В рабочее пространство трех пластиковых вентилируемых чашек Петри однократного применения диаметром 90 мм залили по 25 мл среды расплавленного агара Де Манна-Рогоза-Шарпе (MRS-агара) и после застывания каждую агаровую пластину рассекли стерильным скальпелем по диаметру чашки Петри на две равные части. Удалили каждую одну часть их них и освободившийся объем трех чашек Петри залили до уровня первоначального агара (MRS-агара) по 12 мл расплавленного агара с 7% (об/об) дефибрированной цельной крови барана для культивирования клостридий с образованием второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования. При этом в качестве исследуемых клостридий, в отношении которых изучали антагонистическую активность лактобактерий, использовали Clostridium difficile, Clostridium perfringens и Clostridium septicum.

Затем выполнили первый этап культивирования микроорганизма-антагониста. Равномерно нанесли 0,1 мл суспензии исследуемой лактобактерий толстокишечного биотопа пациентки с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF на поверхность MRS-агара. Созданный посев исследуемой лактобактерий инкубировали при температуре 37°С в микроаэробной атмосфере на основе 10% (об/об) углекислого газа (СO2) и 5% (об/об) кислорода.

По завершению первого этапа, на поверхность второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования равномерно нанесли по 0,1 мл суспензии тестируемой культуры с мутностью бактериальной взвеси 2,0 McF и нанесенные посевы инкубировали в при температуре 37°С в строгой анаэробной атмосфере на основе азота, содержащей соответственно азота, содержащей 5% (об/об) водорода и 10% (об/об) углекислого газа в течение 48 часов.

По завершению второго этапа культивирования микроорганизма-антагониста выполнили оценку антагонистической активности тестируемой культуры по величине измеренного в миллиметрах расстояния от середины края газона лактобактерий в перпендикулярном ему направлении до фронтальной точки края газона тестируемой культуры. Установили, что измеренная зона задержки роста тестируемой культуры составили для Clostridium difficile 5 мм, для Clostridium perfringens 10 мм и для Clostridium septicum 15 мм, что позволило расценить как низкую антагонистическую активность лактобактерий против токсигенной Clostridium difficile и Clostridium perfringens и умеренную против Clostridium septicum. Что позволяет сделать вывод о неспособности лактобацилл пациентки обеспечить колонизационную резистентность макроорганизма, несмотря на высокий титр содержания лактобацилл в толстокишечном биотопе пациентки.

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ оценки антагонистической активности лактобактерий толстокишечного биотопа пациента относительно разнообразных бактерий двухэтапным культивированием микроорганизма-антагониста и тестируемой культуры в условиях комбинированной системы. Способ включает заливку расплавленного MRS-агара в чашку Петри, по застывании агара его рассекают на две равные части, удаляют одну и освободившийся объем заливают расплавленным агаром соответствующего состава. На поверхности MRS-агара культивируют микроорганизм-антагонист, на поверхности незасеянной половины культивируют тестируемую культуру при условиях, соответствующих потребностям тестируемых культур. Антагонистическую активность тестируемой культуры оценивают по величине расстояния (в мм) от середины края газона лактобактерий в перпендикулярном ему направлении до фронтальной точки края газона тестируемой культуры. Изобретение обеспечивает точность оценки антагонистической активности лактобактерий. 7 з.п. ф-лы, 6 пр.

1. Способ оценки антагонистической активности лактобактерий толстокишечного биотопа пациента относительно разнообразных бактерий двухэтапным культивированием микроорганизма-антагониста и тестируемой культуры в условиях комбинированной системы, характеризующийся тем, что в рабочий объем пластиковой вентилируемой чашки Петри однократного применения диаметром 90 мм заливают 25 мл среды расплавленного агара Де Манна-Рогоза-Шарпе (MRS-агара) и после застывания агаровую пластину рассекают стерильным скальпелем по диаметру чашки Петри на две равные части, удаляют одну их них и создают комбинированную систему заливкой освободившегося объема до уровня первоначального агара (MRS-агара) 12-13 мл расплавленного триптиказо-соевого агара (TSA) для культивирования неприхотливых микроорганизмов, или расплавленного агара Sabouraud для культивирования грибов, или расплавленного агара Columbia с 5% (об./об.) дефибрированной цельной бараньей крови для культивирования стрептококков, или расплавленного агара Columbia с 10% (об./об.) дефибрированной цельной бараньей крови для культивирования кампилобактерий (С. jejuni), или расплавленного агара Columbia с 7% (об./об.) дефибрированной лизированной лошадиной крови для культивирования Helicobacter pylori или расплавленного Brucella агара с 7% (об./об.) дефибрированной цельной крови барана для культивирования клостридий, затем выполняют первый этап культивирования микроорганизма-антагониста равномерным нанесением 0,1 мл суспензии исследуемой лактобактерии толстокишечного биотопа пациента с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF на поверхность MRS-агара, и созданный посев исследуемой лактобактерии инкубируют при температуре 37°С в течение 24-48 ч в обогащенной 5-10% (об./об.) углекислым газом атмосфере, затем, по завершении первого этапа, на поверхность второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования равномерно наносят 0,1 мл суспензии тестируемой культуры с мутностью бактериальной взвеси 1,0 McF, и нанесенные посевы инкубируют при следующих параметрах по температуре, времени инкубации и используемой атмосфере, при этом культивирование неприхотливых микроорганизмов осуществляют в воздушной атмосфере инкубатора температуре 37°С в течение 24 ч, культивирование грибов осуществляют в атмосфере инкубатора при температуре 28°С в течение 24 ч, культивирование стрептококков осуществляют в атмосфере CO₂-инкубатора при температуре 37°С в течение 24 ч, культивирование кампилобактерий осуществляют при температуре 37°С в течение 48 ч в микроаэробной атмосфере на основе азота, содержащей 10% (об./об.) углекислого газа (СО₂) и 5% (об./об.) кислорода, культивирование штамма Helicobacter pylori осуществляют при температуре 37°С в течение 48-72 ч в микроаэробной атмосфере на основе азота, содержащей 10% (об./об.) углекислого газа (СО₂) и 5% (об./об.) кислорода и культивирование клостридий осуществляют при температуре 37°С в течение 48-72 ч в строгой анаэробной атмосфере на основе азота, содержащей 5% (об./об.) водорода и 10% (об./об.) углекислого газа, по завершении второго этапа культивирования микроорганизма-антагониста выполняют оценку функциональной антагонистической активности тестируемой культуры по величине измеряемого в миллиметрах расстояния от середины края газона лактобактерии в перпендикулярном ему направлении до фронтальной точки края газона тестируемой культуры, причем длина измеренной зоны роста тестируемой культуры свидетельствует о величине задержки направленной относительно нее антагонистической активности исследуемой лактобактерии, при этом измеренную зону задержки роста тестируемой культуры длиной до 1 мм расценивают как отсутствие антагонистической активности лактобактерий, измеренную зону задержки роста тестируемой культуры длиной от 1 до 10 мм расценивают как низкую антагонистическую активность лактобактерий, измеренную зону задержки роста тестируемой культуры длиной от 11 до 29 мм расценивают как умеренную антагонистическую активность лактобактерий и измеренную зону задержки роста штамма лактобактерий шириной от 30 до 45 мм расценивают как высокую антагонистическую активность.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в процессе нанесения на поверхность второй незасеянной половины комбинированной системы культивирования в качестве тестируемой культуры клостридий и стрептококков применяют тестируемые суспензии с плотностью бактериальной взвеси 2,0 McF.

3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют неприхотливые микроорганизмы Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica Serovar Enteritidis и Klebsiella pneumoniae.

4. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют грибы Candida albicans и Candida tropicalis.

5. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют стрептококки Streptococcus pyogenes и Streptococcus mitis.

6. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют кампилобактерии Campylobacter jejuni NCTC 11638.

7. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют штамм Helicobacter pylori NCTC 11639.

8. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что в качестве исследуемых штаммов, в отношении которых изучалась антагонистическая активность лактобактерий, используют клостридии Clostridium difficile, Clostridium perfringens и Clostridium septicum.