СПОСОБ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ТРОМБОЦИТАРНЫХ НАРУШЕНИЙ ПРИ ДИСПЕПСИИ У НОВОРОЖДЕННЫХ ТЕЛЯТ Российский патент 2008 года по МПК A61K31/708 

Изобретение относится к ветеринарии, к области гематологии, а именно к гемостазу, и может быть использовано для коррекции антиоксидантной защиты тромбоцитов для исключения риска формирования тромбоцитарных нарушений у новорожденных телят с диспепсией.

В литературе имеются рекомендации по назначению «Биопага-Д» для дезинфекции помещений: больниц, коровников, птицеферм, обработки зерновых культур, картофеля перед посевом и перед хранением для лучшей сохранности урожая (Ефимов К. Борьба за хлеб насущный: ПАГИ на службе сельского хозяйства.// Журнал. Барьер безопасности, 2005. - №1. - с.77-81).

Известно, что применение «Биопага-Д» в растворе вовнутрь у телят при диспепсии способно купировать заболевание (Наумов М.М., Жукова Л.А., Баскаков Е.В., Мерзленко Р.А., Гнездилов С.А., Медведев И.Н. Практические рекомендации по применению гуанидинсодержащих препаратов в ветеринарии. М., 2005. - 16 с.).

Ранее «Биопаг-Д» не применялся для коррекции антиоксидантной защиты тромбоцитов у новорожденных телят при диспепсии.

Целью изобретения является коррекция антиоксидантной защиты тромбоцитов для нивелирования риска формирования тромбоцитарных нарушений у новорожденных телят при начале диспепсии.

Сущность заявляемого способа заключается в том, что для раннего предотвращения риска формирования тромбоцитарных нарушений у новорожденных телят с диспепсией при начале диспепсии животному дается однократно 0,01% 200,0 мл «Биопага-Д», что коррегирует в тромбоцитах активность каталазы, супероксиддисмутазы (СОД) и содержание малонового диальдегида (МДА).

Способ отличается тем, что с применением нескольких технически простых и не требующих дорогостоящих реактивов, оборудования, затрат сил и времени методов, возможно ранняя коррекция перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной защиты тромбоцитов и исключение риска формирования тромбоцитарных нарушений у новорожденных телят, способных привести без применения «Биопага-Д» к тромбофиллической тромбоцитопатии с возникновением тромбозов различных сосудов.

По завершении профилактических мероприятий возможно повторное обследование ПОЛ и антиоксидантной защиты с целью контроля адекватности проводимых мер.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом. Кровь берут из вены в количестве 20 мл через толстую иглу самотеком в пробирку. В качестве корсенванта используют 5% раствор трилона-Б из расчета 1,5 мл консерванта на 20 мл цельной крови. Затем кровь с консервантом осторожно и тщательно перемешивают и для осаждения эритроцитов и лейкоцитов центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочный слой, который содержит основную массу тромбоцитов, отсасывают в отдельную пробирку и центригируют при 1000 об/мин в течение 10 мин. При этом оставшиеся в надосадочном слое эритроциты и лейкоциты оказываются в осадке. Осадок удаляют, а супернатант помещают в отдельную пробирку и центифугируют при 2200 об/мин в течение 15 мин. В результате получают осадок, состоящий из одних тромбоцитов. Выход тромбоцитов составляет 1,5×10⁹-2,5×10⁹ клеток из 20 мл цельной крови. Полученные тромбоциты отмывают следующим образом. Недосадочную жидкость после третьего центрифугирования удаляют, а к осадку тромбоцитов добавляют 6 мл 0,85% раствора натрия хлорида, приготовленного на 2,7% растворе трилона Б. Осадок кровяных пластинок осторожно перемешивают и центрифугируют при 2200 об/мин в течение 10 мин. Затем супернатант удаляют, а к осадку вновь добавляют физиологический раствор на трилоне Б в тех же количествах. Эту процедуру повторяют трижды. Следует отметить, что выделение и отмывание тромбоцитов проводят при комнатной температуре. Часть клеток в процессе отмывания теряется и количество тромбоцитов, выделенных из 20 мл цельной крови, в итоге составляет в среднем 1,8×10⁹ клеток. В каждом конкретном случае количество тромбоцитов подсчитывается в камере Горяинова.

Последующая оценка активности каталазы и СОД осуществляется следующим способом.

Определение каталазы в крови. Принцип метода состоит в том, что каталаза разрушает субстрат Н₂О₂, а оставшуюся неразрушенной часть перекиси водорода измеряют с помощью молибдата натрия. Как известно для молибдена характерно образование при взаимодействии с перекисью водорода перекисных соединений состава Na₂MoO₆, которые имеют желтую окраску. Интенсивность окраски образующихся перекисных соединений молибдена зависит от количества перекиси водорода в растворе, т.е. от активности каталазы в пробе.

Реагенты.

(1) 0,3% водный раствор перекиси водорода (1 мл концентрированного раствора перекиси водорода доводят дистиллированной водой до 100 мл).

(2) 4% водный раствор молибдата натрия.

Таблица 1.
Схема определения каталазы в кровиВводимые реагентыХолостая пробаИсследуемая пробаРаствор Н₂О₃, мл2,0002,000Суспензия тромбоцитов, мл---0,010Раствор молибдата, мл1,0001,000

В табл.1 приведено описание методики.

Раствор молибдата добавляют к каждой пробе по отдельности и сразу же после перемешивания реакционной смеси измеряют экстинкцию при 410 нм против дистиллированной воды. Экстинкция холостой пробы около 0,350. Чем больше в пробе каталазы, тем меньше перекиси водорода остается неразрушенной и тем меньше образуется перекисей молибдата. Результат оценивают по степени разрушения перекиси водорода каталазой или степени блокирования образования конечных продуктов перекисей молибдата и выражают в процентах. Расчет проводят по формуле:

где Е_х.пр и Е_исс.пр - экстинкция соответственно холостой и исследуемой проб. С помощью калибровочной кривой, построенной для стандартных растворов каталазы (см.схему на фиг.1), оценивают активность каталазы в пробе на основании рассчитанного процента разрушения перекиси водорода. Активность каталазы относят к концентрации тромбоцитов (в МЕ/10⁹ тр.) в исследуемой взвеси тромбоцитов.

По оси абсцисс схемы отложена активность каталазы в МЕ/10⁹ тр., по оси ординат - блокирование реакции в %.

Определение СОД. Принцип определения основан на восстановлении нитротетразолия супероксидными радикалами, которые образуются при реакции между феназинметасульфатом и восстановленной формой никотинамиддинуклеотида (NAD·Н). Образование нитроформазана, продукта восстановления нитротетразолия, блокируется наличием в пробе СОД. Так, на основании количества нитроформазана можно оценить активность СОД.

Реагенты.

(1) 0,15 М фосфатный буфер (рН 7,8) (4,48 г Na₂HPO₄, 0,25 г КН₂РО₄ растворяют в 500 мл дистиллированной воды).

(2) Инкубационная смесь 37 мг ЭДТА-Na₂, 330 мг нитротетразолия голубого, 55 мг феназинметасульфата смешивают с 300 мл фосфатного буфера, оставляют стоять на ночь. Утром фильтруют.

(3) Раствор NAD·H (152 мг NAD·H растворяют в 10 мл трис-ЭДТА-буфера).

(4) Трис-ЭДТА-буфер, рН 8,0 (37 мг ЭДТА-Na, 24 мг трис растворяют в 100 мл дистиллированной воды).

В суспензии тромбоцитов определяют СОД (табл.2).

Таблица 2.
Схема определения СОДДобавляемые реагентыХолостая пробаИсследуемая пробаИнкубационная смесь, мл1,5001,500Дистиллированная вода, мл0,100-----Суспензия тромбоцитов, мл-----0,100Раствор NAD·Н, мл0,0500,050

Смешивают при комнатной температуре и измеряют экстинкцию холостой и исследуемой проб при 540 нм на спектрофотометре. Экстинкция холостой пробы составляет около 0,680. Расчет производят по формуле:

Активность СОД определяют с помощью калибровочной кривой (см.схему на фиг.2). Активность СОД в крови выражают в ME/10⁹ тр. По оси абсцисс схемы отложены активность СОД в МЕ/10⁹ тр, по оси ординат - блокирование восстановления нитротетразолия в %.

Определение МДА. Уровень МДА определяли тиобарбитуровым методом в отмытых и ресуспендированных тромбоцитах, принцип метода Smith I.B., Jngerman С.М., Silver M.I. Malondialdehyde formation as an indicator ofprostaglandin production by human platelet.// J. Lab. Clin. Med. - 1976. - Vol.88. - №1. - Р.167-172 в модификации Кубатиев А.А., Андреев С. В. Перекиси липидов и тромбоз. // Бюллетень экспериментальной биологии. - 1979. - №5. - с.414-417.

Продукция МДА в суспензии клеток индуцировалась внесением в 0,5 мл суспензии в условиях перемешивания раствора 10-20 мкл тромбина (концентрация тромбина 4 мг/мл). Пробу инкубировали с тромбином 5 мин. Затем добавляли 0,5 мл 50% трихлоруксусной кислоты на 1 N HCl и 0,5 мл 0,9% тиобарбитуровой кислоты. Сразу после смешивания реактивов проба помещалась на кипящую водяную баню на 15-30 мин. После этого ее охлаждали при комнатной температуре и центрифугировали при 3000 об/мин.

Супернатант фотометрировали при λ=532 нм. Контролем служила проба, в которую вносили 0,5 мл физиологического раствора. Для оценки исходного уровня МДА определяли экстинкцию пробы без добавления тромбина. Расчет велся по формуле:

ε - экстинкция пробы;

1,5·10⁵ - коэффициент молярной экстинкции;

3 - коэффициент учитываемого разведения;

10⁹ - коэффициент перехода в нМ.

Концентрация МДА, в пересчете на 10⁹ тромбоцитов определялась следующим образом:

С (нМ·10⁹ тромбоцитов)=ε·2·10²/N;

N - число тромбоцитов в мкл, деленное на 100000.

Таблица 3
Антиоксидантные параметры крови у обследованных телятКатегория обследованныхЧисло наблюденийКаталаза МЕ/10⁹ трСОД
МЕ/10⁹ трМДА
нмоль/10⁹ трЗдоровые новорожденные телята4011600,0-9050,02500,0-1750,00,35-0,98Новорожденные телята с начинающейся диспепсией и риском развития тромбоцитарных нарушений529049,0-6500,01749,0-1500,00,99-1,49

Таким образом, с применением нескольких технически простых и не требующих дорогостоящих реактивов, оборудования, затрат сил и времени методов возможно раннее выявление риска формирования тромбоцитарных нарушений у людей и новорожденных телят, способного привести без применения мер профилактики к тромбофиллической тромбоцитопатии с возникновением тромбозов различных сосудов. При повышении МДА в тромбоцитах до 0,99, но не выше 1,49 нмоль/10⁹ тр. и снижении каталазы до 9049,0-6500,0 МЕ/10⁹ тр. и СОД до 1749,0-1500,0 МЕ/10⁹ тр., для нормализации данных параметров необходимо однократное применение теленку внутрь 0,01% - 200,0 мл «Биопага-Д», что исключает развитие тромбоцитопатии.

Внедрение данного способа раннего выявления риска формирования тромбоцитарных нарушений у людей и животных в лечебных и ветеринарных учреждениях позволит проводить своевременную и эффективную коррекцию ПОЛ и антиоксидантной защиты тромбоцитов с целью профилактики тромбоцитопатии у новорожденных телят в каждом конкретном случае, ускорив рост и развитие, оздоровить молодняк крупного рогатого скота.

Пример 1. Новорожденный теленок №4, 5 сутки жизни с диспепсией в течение 2 часов обследован в условиях телятника. У теленка была взята и исследована кровь с оценкой агрегационной активности тромбоцитов с рядом индукторов (АДФ 40,0 с., коллаген 35,0 с., тромбин 59,0 с., Н₂О₂ 48,8 с., адреналин 107,9 с., АДФ+адреналин 36,9 с., АДф+коллаген 32,9 с., адреналин+коллаген 30,3 с.) и внутрисосудистой активности тромбоцитов (ВАТ) (дискоциты 80,0%, диско-эхиноциты 10,0%, сфероциты 4,0%, сферо-эхиноциты 4,0%, биополярные формы 2,0%). Активность каталазы 7500,0 МЕ/10⁹ тр. и СОД 1500,0 МЕ/10⁹ тр. были снижены при увеличении содержания МДА в тромбоцитах 1,34 нмоль/10⁹ тр., что являлось предпосылкой развития тромбоцитарных нарушений. Теленку назначен «Биопаг-Д» 0,01% 200,0 мл внутрь однократно, что позволило через 1,5 часов полностью купировать диспепсию, нормализовать каталазу 10500,0 МЕ/10⁹ тр., СОД 1850,0 МЕ/10⁹ тр., МДА тромбоцитов 0,6 нмоль/10⁹ тр., исключив риск развития тромбоцитарных нарушений.

В дальнейшем наблюдение за данным теленком не выявило отклонений от нормы.

Пример 2. Новорожденный теленок №8, 7 суток, с диспепсией 3 часа обследован в условиях телятника. У больного теленка была взята и исследована кровь с оценкой агрегационной активности тромбоцитов с рядом индукторов (АДФ 37,0 с., коллаген 36,3 с., тромбин 54,4 с., Н₂О₂ 49,9 с., адреналин 102,6 с., АДФ+адреналин 37,0 с., АДФ+коллаген 33,0 с., адреналин+коллаген 32,0 с.) и усиления ВАТ (дискоциты 82,0%, диско-эхиноциты 8,0%, сфероциты 6,0%, сферо-эхиноциты 2,0%, биополярные формы 2,0%), что выявляло у него нормативные значения данных параметров. В тромбоцитах была зарегистрирована пониженная активность каталазы 6600,0 МЕ/10⁹ тр., СОД 1550,0 ME/10⁹ тр. и увеличенное содержание МДА 1,4 нмоль/10⁹ тр.

Теленку назначен «Биопаг-Д» 0,01% 200,0 мл однократно. Это позволило купировать у него диспепсию в течение 3 часов, нормализовать ПОЛ и антиоксидантную систему тромбоцитов (каталаза 9600,0 МЕ/10⁹ тр., СОД 2300,0 МЕ/10⁹ тр., МДА тромбоцитов 0,8 нмоль/10⁹ тр.), что исключило риск развития тромбоцитопатии.

Дальнейшее наблюдение за теленком не показало отклонений от нормы.

Изобретение относится к области ветеринарии. Способ заключается в том, что телятам выпаивают 0,01%-ый раствор Биопага-Д однократно в дозе 200 мл. Способ позволяет провести раннюю коррекцию перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты тромбоцитов и исключить риск формирования тромбоцитарных нарушений у новорожденных телят. 3 табл. 2 ил.

Способ предотвращения тромбоцитарных нарушений при диспепсии у новорожденных телят, заключающийся в том, что телятам выпаивают 0,01%-ный раствор Биопага-Д однократно в дозе 200 мл.