МИКРОНОСИТЕЛЬ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ СУБСТРАТЗАВИСИМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ IN VITRO Российский патент 2008 года по МПК C12N5/06 

Область применения

Настоящее изобретения относится к области биологии клетки и биотехнологии культивирования субстратзависимых клеток животных в условиях in vitro методом микроносителей и может быть использовано при крупномасштабном выращивании клеток животных - продуцентов биологически важных продуктов.

Уровень техники

В 1967 г. Van Wezel предложил метод культивирования клеток на поверхности полимерных шариков-частиц "микроносителей". Этот метод, названный впоследствии методом микроносителей, давал возможность суспензионного выращивания субстратзависимых клеток, поддерживаемых в условиях in vitro. Суть метода заключалась в том, что клетки совершали адгезивный контакт с поверхностью микроносителя и впоследствии пролиферировали, находясь на поверхности этих частиц. Первый микроноситель клеток животных был создан на основе поперечно-сшитого декстрана (Van Wezel A.L. "Growth of cell strains and primary cells on microcarriers in homogeneous cultures.", Nature, 1967, 216: 64-65).

С этого момента началась разработка различных типов микроносителей. Вскоре был предложен декстрановый микроноситель, который может нести положительный или отрицательный заряд, который создается путем специальной дополнительной обработки поверхности носителя (Levine, David W.; Thilly, William G.; Wang, Daniel I.C.; Wong, Jason S.; US Patent 4293654. "Cell culture microcarriers." 1979, Jul. 2.).

В дальнейшем было разработано дополнительное покрытие микроносителя слоем из магнитного материала (Henderson, Timothy M.; U.S. Patent 4448884, "Glass-surface microcarrier for growth of cell cultures.", Mar. 3, 1982).

Основой патента Чунга по культивированию клеток животных стал новый микроноситель на основе кальция (Cheung, Herman S., US Patent 4757017, "In vitro cell culture system.", Sep.14, 1984). По своим свойствам он удовлетворял критериям, предъявляемым к микроносителям клеток животных.

Проведенные исследования гранулированных препаратов различной химической природы с целью использования их в качестве микроносителей, включая также коммерчески доступные и экспериментальные препараты, применяемые в хроматографии, подтвердили перспективу применения подобных частиц в качестве микроносителей (Жестерев В.И., Сергеев В.А., Хижинская В.П., Грудина Н.В., Макарова С.Б. "Изыскание отечественных микроносителей для культивирования клеток.". Цитология. 1986, Том XXVIII, №4, стр.465-469).

В дальнейшем был создан полистироловый микроноситель, поверхность которого была покрыта коллагеном (Hillegas, William J.; Varani, James; Helmreich, David L. United States Patent 4994388, "Collagen-coated polystyrene microcarrier beads.", Apr. 15, 1988).

Также был создан микроноситель на основе полисахаридов (Schwengers, Dieter; Keller, Ingrid; United States Patent 4910142. "Cell culture microcarrier, method for preparing same and use thereof for cultivating anchorage-dependent cells.", 1989, Jan. 4.).

Было предложено связывать с поверхностью микроносителя компоненты, благоприятствующие клеточной адгезии, например такие, как фибронектин, коллаген и др. (Clapper, David L.; Hu, Wei-Shou; United States Patent 5512474, "Cell culture support containing a cell adhesion factor and a positively-charged molecule." 1994, Mar. 9).

Спектр различных модификаций поверхностей микроносителей достаточно широк. Со временем были получены микроносители, которые открыли возможность использования для адгезии клеток не только их внешнюю поверхность, но и искусственно созданные в микроносителях поры соответствующего размера, обычно 20-30 μм. Микроносители подобного рода называют макропоровыми микроносителями. Такие микроносители дают возможность получить более высокую концентрацию биомассы по сравнению с непоровыми микроносителями. Этот тип микроносителей относят ко второму, более совершенному поколению микроносителей клеток животных (Van der Velden-de Groot C.A.M. "Microcarrier technology - present status and perspective." Cytotechnology. 1995; vol.18, N.1-2, pp.51-56).

Поверхность макропорового микроносителя была изучена с помощью методов сканирующей микроскопии. В частности, показано различие в геометрии пор и неоднородность распределения клеток по порам микроносителя (Bancel, S. and Hu, W.-S. "Confocal laser scanning microscopy examination of cell distribution in macroporous microcarrieris.", Biotechnol. Progress., 1996; 12, 398-402).

Число различных типов микроносителей постоянно растет, например, в 2000 году предложен микроноситель на основе фосфата кальция и его химических аналогов (Starling L. Brian; Stephan, James E., US Patent 6210715, "Calcium phosphate microcarriers and microspheres.", Feb. 2, 2000).

Интенсивные научно-технологические исследования с применением микроносителей показали ограниченность применения микроносителя одного типа к культивированию различных типов клеток животных, полученных от разных организмов. Рост одних и тех же клеток животных может значительно различаться при применении совместимых с ними, но разных микроносителей. Например, изучение роста клеток почки обезьяны (VERO) на декстрановом микроносителе двух типов показало, что рост этих клеток был несколько интенсивнее (на 30%) на микроносителе, несущем поверхностный позитивный заряд, чем на микроносителе, поверхность которого была покрыта тонким слоем коллагена (М. С de Oliveira Souza, М. Da Silva Freire, L. dos Reis Castilho. "Influence of culture condition on Vero cell propagation on non-porous microcarriers" Brazilian Archives of Biology and Technology 2005, vol.48).

Вышеназванные искусственные микроносители имеют следующие недостатки:

1) ограниченность применения микроносителя одного типа для культивирования разных типов субстратзависимых клеток животных;

2) многие из микроносителей предназначены для однократного применения;

3) поверхность микроносителя неоднородна как по размеру, так и по форме;

4) размер микроносителя колеблется в широком диапазоне, т.е. дисперсия по данному параметру у микроносителя достаточна велика;

5) стерилизация микроносителя не может осуществляться любым способом.

Задача изобретения

Задачей настоящего изобретения является устранение этих недостатков, а именно создание нетоксичного, устойчивого к физико-химическим и биологическим факторам микроносителя для культивирования субстратзависимых клеток животных, многократного применения, однородного по размеру и форме, с широким диапазоном методов стерилизации.

Поставленная задача решается тем, что создан новый микроноситель для культивирования субстратзависимых клеток животных в условиях in vitro, представляющий собой полимерную поверхность, причем указанная поверхность выполнена из природных полимеров клеточной стенки пыльцы.

Оболочки пыльцы обладают достаточной жесткостью и эластичностью для выполнения функции микроносителей клеток. Разрушение этих оболочек маловероятно при применении любого типа перемешивающих устройств. Плотность пыльцы и спор будучи несколько выше 1.00 г/см³ может быть изменена до необходимой величины путем их дополнительной обработки окислительными реакциями или иными воздействия. Пыльца хорошо видима в микроскоп и дает возможность визуального наблюдения адгезии клеток на ее поверхности. Пыльца не является токсичной для клеток животных.

Оболочка пыльцы, именуемая спородермом, состоит из двух слоев: интина - внутреннего слоя и экзина - внешнего слоя, содержащего сложный природный биополимер - спорополенин, который образован путем окислительной полимеризации каротиноидов и их эфиров (Биологический энциклопедический словарь. Москва, 1989; издательство "Советская Энциклопедия"). Оболочка пыльцы устойчива к воздействию различных ферментов, что немаловажно для микроносителя, поскольку при культивировании клеток животных могут применять специфические ферменты, например такие, как трипсин.

По морфометрическим параметрам пыльца подходит для применения ее в качестве микроносителя клеток животных. Размеры пыльцы находятся в диапазоне от 6,0 μм - представители рода Myosotis L. (незабудки), до 250 μм - растения рода Cucurbita (тыква) (Биологический энциклопедический словарь. Москва, 1989; издательство "Советская Энциклопедия"). Размер пыльцы может различаться в пределах вида. Например, несмотря на сходство формы пыльцы двух видов сосны Pinus nigra Arnold и Pinus sylvestris L., их морфометрические размеры центральных капсул различаются, однако линейные размеры пыльцы в пределах каждого из этих видов достаточно жестко детерминированы и дисперсия не превышает 13% от их среднестатистического значения (Bonne G., Richter E., Woehlecke H. and Ehwald R. "Diffusion barriers of tripartite sporopollenin microcapsules prepared from Pine pollen". Annals of Botany. 2003, 92: 289-297).

Многообразие и неповторимость трехмерных поверхностных узоров и пространственной формы пыльцы являются таксономическими признаками организмов. Точность и однородность поверхности этих специфических клеток отточена длительным эволюционным процессом и уже давно стала основой, например, для споро-пыльцевого анализа ("Textbook of Pollen Analysis", Blackwell, Oxford, 1984).

Функционирование изобретенного микроносителя показано на примерах, изложенных далее. В качестве микроносителя мы использовали пыльцу обычного растения - сосны (Pinus sylvestris L). Микрокапсулы (оболочки) пыльцы сосны Pinus sylvestris L. были любезно предоставлены профессором Рудольфом Эвальдом (Prof. Rudolf Ehwald, Humboldt University Berlin, Germany) Институту Физиологии Растений им. К.А.Тимирязева для дополнительного исследования ее применимости в научных исследованиях биотехнологических направлений. Способ получения микрокапсул пыльцы описан в его работе (Bohne G., Richter E., Woehlecke H. and Ehwald R. "Diffusion barriers of tripartite sporopollenin microcapsules prepared from Pine pollen", Annals of Botany. 2003, 92: 289-297). В дальнейшем, для краткости изложения, микрокапсулы (оболочки) пыльцы Pinus sylvestris L могут именоваться в тексте как пыльца.

Перечень иллюстративных материалов

Фигура 1. Клетки НЕК 293.

Фигура 2. Микрокапсулы (оболочки) пыльцы Pinus slv.

Фигура 3. Конгломераты клеток НЕК 293 и микрокапсул пыльцы Pinus slv.

Фигура 4. Результат отделения клеток НЕК 293 от капсул пыльцы Pinus slv. после обработки 0,05% раствором трипсина.

Фигура 5. Трансформированные клетки НЕК 293 на поверхности микрокапсул пыльцы Pinus slv.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

В примерах использовали следующие клеточные линии:

НЕК 293 - клетки почки человека,

NIH 3Т3 - соединительнотканные клетки мыши (фибробласты),

НТ1080 - опухолевые клетки соединительной ткани человека, мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани мыши Balb/c.

Все указанные клеточные культуры поддерживались в стерильных условиях (in vitro) на модифицированной среде Игла, содержащей необходимый набор аминокислот и витаминов (DMEM, HyClone), концентрация эмбриональной телячьей сыворотки - 10% (FCS 10%, HyClone), L-глутамин - 12 mM с добавлением пенициллина и стрептомицина.

В экспериментах использовали полистироловые чашки Петри Ленинградского завода медицинских полимеров, именуемые далее как микробиологические, и полистироловые чашки Петри фирмы Coster, поверхность которых обработана ионизирующим излучением или электротоком высокого напряжения, именуемые далее как культуральные.

Количество клеток и их жизнеспособность просчитывали в камере Горяева согласно общепринятым методикам.

Пример 1

В экспериментах использовали культуральные чашки Петри.

Эксперимент показал, что 90% клеток человека - НЕК 293 (Фиг.1) образуют с пыльцой (Фиг.2) конгломераты (Фиг.3) при их совместном культивировании в соотношении 1:1. Пыльца не влияла на рост и жизнеспособность клеток человека, поскольку значения этих параметров не отличались от таковых контрольного варианта (выращивание клеток на культуральных чашках Петри). Отделение клеток от микроносителя провели 0,05% раствором трипсина (Фиг.4).

Дополнительное видимое изображение клеток человека (НЕК 293) на поверхности пыльцы представлено на Фиг.5. Для получения изображения клетки человека (НЕК 293) в нее вводили плазмиду, экспрессирующую зеленый флюоресцентный белок (GFP), а затем культивировали с пыльцой в соотношении 1:1; съемку проводили на флюоресцентном микроскопе с помощью цифровой фотокамеры.

В результате проведенных экспериментов было показано отсутствие негативного влияния микроносителя на пролиферацию и жизнеспособность клеток человека (НЕК 293).

В этих экспериментах мы получили доказательства того, что изобретенный нами новый природный микроноситель применим для культивирования субстратзависимых клеток животных.

Пример 2

В экспериментах использовали культуральные чашки Петри.

В этом эксперименте изучили влияние на клетки НЕК 293 различных методов стерилизации пыльцы Pinus slv. Для этого пыльцу стерилизовали автоклавированием (118-120°С, 20 мин), 96% этанолом и воздействием жидкого азота. Затем пыльцу совместно культивировали с клетками почки человека (НЕК 293). Результаты этих экспериментов сравнили с контрольным экспериментом (без пыльцы), который выполнили одновременно с тремя вариантами экспериментов. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1
Изучение влияния различных методов стерилизации микроносителей и обработка жидким азотом, а также трехкратного применения микроносителей (см. пример 3) на рост клеток НЕК 293 Автоклавирование 118-120°С, 20 минОбработка 96% этаноломОбработка жидким азотомИспользование пыльцы1-кратно1-кратно1-кратно*Опыт (кл./мл)2,75×10⁵2,775×10⁵3.61×10⁵*Контроль (кл./мл)2.0×10⁵2.0×10⁵2.0×10⁵Использование пыльцы3-кратно  **Опыт (кл./мл)2,8×10⁶--**Контроль (кл./мл)1.4×10⁶--Примечание;
* Концентрация клеток в 1.0 мл через 48 часов.
** Концентрация клеток в 1.0 мл через 72 часа.
Начальная концентрация клеток во всех вариантах - 1,5×10⁵ кл./мл.

Пример 3

В экспериментах использовали культуральные чашки Петри.

В этом эксперименте изучили влияние на клетки НЕК 293 многократности применения микроносителя - пыльцы Pinus slv. Для этого пыльцу стерилизовали автоклавированием (118-120°С, 20 мин), затем культивировали с клетками НЕК 293, через 48 часов клетки снимали с микроносителей и определили их концентрацию, собранные микроносители повторно автоклавировали и снова культивировали с клетками и т.д. Результаты сравнили с контрольными экспериментами (без микроносителя). Результаты трехкратного применения микроносителя приведены во второй колонке таблицы 1.

Результаты экспериментов, представленных в примере 2 и 3, показали, что применение различных методов стерилизации микроносителя не выявило их негативного влияния на рост клеток человека. Клетки человека (НЕК 293) во всех случаях росли лучше на микрокапсулах пыльцы, чем на поверхности чашки Петри. Эта тенденция наблюдалась также при трехкратном применении пыльцы. Следовательно, изобретенный нами микроноситель можно применять многократно для культивирования клеток животных, при этом его стерилизация может осуществляться различными методами.

Пример 4

В экспериментах использовали культуральные и микробиологические чашки Петри.

В приведенном эксперименте сравнили рост четырех клеточных линий с применением пыльцы и контрольный вариант - рост клеток без пыльцы. Во всех опытах соотношение числа клеток к числу микрокапсул пыльцы составляло 1:1. Время культивирования клеток животных во всех случаях составляло 48 часов. Время прикрепления (адгезии) клеток животных к поверхности пыльцы не отличалось от времени прикрепления клеток животных к поверхности пластика (контроль) и составляло менее 8 часов, в случае со стволовыми клетками менее 3 часов. Экспериментальные данные представлены в таблице 2.

Таблица 2
Культивирование различных клеточных линий на пыльцеКлеткиНЕК 293NIH ЗТЗHT1080Стволовые*опыт (кл./мл)2,75×10⁵3.055×10⁵2,36×10⁵0,95×10⁶* контроль (кл./мл)2,0×10⁵2,875×10⁵2.22×10⁵1,3×10⁶**опыт (кл./мл)2,2×10⁶/---**контроль (кл./мл)1.0×10⁶---Примечание
* в экспериментах использовали культуральные чашки Петри, начальная концентрация клеток, в контроле и опыте - 1.5×10⁵ кл./мл.
** в эксперименте использовали микробиологические чашки Петри, начальная концентрация клеток в контроле и опыте - 2,5×10⁵ кл./мл.

Полученные результаты показали, что все клеточные линии успешно растут на микроносителе. Более того, первичные клеточные культуры, такие как мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани мышей, также успешно могут быть культивированы на пыльце. Время прикрепления клеток животных к поверхности культуральной чашки Петри и к поверхности пыльцы не различается.

Наши результаты также показали, что при совместном культивировании клеток НЕК 293 и пыльцы в микробиологической чашке Петри практически все клетки ПЕК 293 прикрепились на поверхность пыльцы и их рост был в 2 раза выше, чем в контроле. Следовательно, микроноситель в этом случае был намного более благоприятен для клеток человека, чем поверхность микробиологической чашки Петри. Очевидно, для выращивания клеток с применением пыльцы не требуются специальные культуральные сосуды, разработанные для выращивания клеток животных.

Пример 5

В эксперименте использовали культуральные чашки Петри.

Клетки НЕК 293 культивировали 7 дней на пыльце, при этом через каждые 48 часов объем питательной среды полностью меняли на свежую. На 7 сутки культивирования провели подсчет изменения числа клеток НЕК 293 и их жизнеспособность. Контрольный вариант - рост клеток на поверхности культуральной чашки Петри. Начальная концентрация клеток - 1.5×10⁵. Значения роста культуры в контроле и опыте практически не различались, их среднестатистические величины - 2,8×10⁶ кл./мл в эксперименте и 3.0×10⁶ кл./мл в контроле с учетом того, что погрешность метода составляет по крайней мере 5%. Таким образом, изобретенный нами микроноситель - пыльца растений также применим при концентрировании клеток на микроносителе при отъемно-доливных режимах культивирования.

Результаты изобретения

Изобретенный микроноситель на основе оболочек клеточной стенки пыльцы обладает природной биополимерной оболочкой, в состав которой входит спорополенин, который предопределяет многократное применение микроносителей этого типа благодаря его чрезвычайной устойчивости к химическим, физическим, биологическим и иным факторам; обладает строго детерминированной формой и размером; имеет четкий и однородный поверхностный узор; размер пыльцы находятся в оптимальном диапазоне для создания микроносителей размером от 6 до 250 μм; имеет внутреннее пространство, защищенное природной оболочкой, которое может быть использовано при создании макроносителей, т.е. культивируемые клетки защищены клеточной стенкой пыльцы; стерилизация микроносителя может осуществляться любыми методами, включая автоклавирование; предварительные процедуры, связанные с подготовкой микроносителей данного типа к процессу культивирования минимальны или могут полностью отсутствовать. Запасы данного сырья для производства микроносителей не ограничены и возобновляемы.

Кроме того дополнительными преимуществами является то, что транспортировка этих микроносителей может осуществляться в любой форме - как сухой, так и суспензионной, как в стерильном, так и нестерильном варианте; срок их хранения практически неограничен; дополнительная модификация этих микроносителей может проводиться практически любыми методами, которые могут включать в себя как высокотемпературные стадии, так и стадии обработки сильными кислотами, щелочами, ферментами и т.д., что значительно расширяет спектр возможных поверхностных покрытий, которые могут привнести в микроноситель уникальные характеристики.

Изобретение относится к области биотехнологии культивирования субстратзависимых клеток животных в условиях in vitro методом микроносителей и может быть использовано при крупномасштабном выращивании клеток животных - продуцентов биологически важных продуктов. Микроноситель для культивирования субстратзависимых клеток животных в условиях in vitro представляет собой полимерную поверхность, выполненную из природных полимеров клеточной стенки пыльцы. Изобретение позволяет культивировать различные клеточные линии без потери свойств микроносителя при его многократном применении, различных методах стерилизации и при воздействии низких температур. 5 ил., 2 табл.

Микроноситель для культивирования субстратзависимых клеток животных в условиях in vitro представляет собой полимерную поверхность, отличающийся тем, что его поверхность выполнена из природных полимеров клеточной стенки пыльцы.