СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОГО ДЕТОРОЖДЕНИЯ ПОСЛЕ ИММУНОЦИТОТЕРАПИИ У ЖЕНЩИН С НЕВЫНАШИВАНИЕМ БЕРЕМЕННОСТИ РАННИХ СРОКОВ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования восстановления эффективного деторождения у женщин вне беременности с невынашиванием ранних сроков (до 12 недель) в анамнезе.

Актуальность изобретения определяется высокой частотой встречаемости невынашивания беременности ранних сроков. По данным отечественных авторов частота невынашивания составляет от 13 до 17%, оставаясь одной из главных причин перинатальной патологии и смертности. Потери детей, как следствие невынашивания, составляют от 35 до 78% [1]. Большая роль в генезе невынашивания беременности отводится иммунным механизмам [2, 3]. В настоящее время несмотря на довольно значительное количество препаратов, обладающих иммуномодулирующими свойствами, выбирать приходится в основном между двумя способами иммунотерапии: активной иммунизацией аллогенными лимфоцитами и пассивной - введением иммуноглобулинов [2, 3]. Разработка способа прогнозирования восстановления эффективного деторождения после иммуноцитотерапии у женщин с невынашиванием ранних сроков в анамнезе позволит прогнозировать восстановление эффективного деторождения еще до наступления беременности.

Известен способ прогнозирования течения беременности после иммунокоррекции у женщин, страдающих привычным невынашиванием (Патент №2013772. Способ прогнозирования течения беременности после иммунокоррекции у женщин, страдающих привычным невынашиванием / Милько-Черноморец Ю.В., Шилко А.Н. // Изобретения. - 1994. - №10. - С.142). Заключается он в следующем: женщинам, страдающим привычным невынашиванием, проводится подкожное введение суспензии лимфоцитов от мужа или донора с последующим исследованием иммунограммы. Способ отличается тем, что с целью повышения точности в крови беременной до первой и после каждой последующей подсадки определяют показатели иммунограмм, а именно Т-РОК теофиллинчувствительные лимфоциты, Т-активные лимфоциты, Т-лимфоциты Е-РОК, Т-РОК теофиллинрезистентные лимфоциты и соотношение Т-РОК теофиллинрезистентных и Т-РОК теофиллинчувствительных лимфоцитов и при нарастании показателей Т-РОК теофиллинчувствительных лимфоцитов в 2,5 раза и более, Т-лимфоцитов активных в 3 и более раз, Т-лимфоцитов Е-РОК в 1,2 раза и более и при снижении показателей Т-РОК теофиллинрезистентных лимфоцитов в 1,4 раза и более и отношения Т-РОК теофиллинрезистентных к Т-РОК теофиллинчувствительным лимфоцитам по сравнению с исходным уровнем прогнозируют благоприятное течение беременности, при снижении же показателей Т-РОК теофиллинчувствительных лимфоцитов активных, Т-лимфоцитов Е-РОК и при нарастании показателей Т-РОК теофиллинрезистентных лимфоцитов и отношения Т-РОК теофиллинрезистентных и Т-РОК теофиллинчувствительных лимфоцитов прогнозируют неблагоприятное течение беременности.

Недостатки способа:

1. используется только у беременных женщин;

2. не указывается срок беременности, в который рекомендуется проводить обследование;

3. высокая трудоемкость;

4. длительность исполнения анализа;

5. не указана точность способа.

Известен способ оценки эффективности предгравидарной подготовки женщин к беременности с невынашиванием гормонального генеза в анамнезе (Патент №2242009. Способ оценки эффективности предгравидарной подготовки женщин к беременности с невынашиванием гормонального генеза в анамнезе / Краснопольский В.И., Серова О.Ф. // Изобретения. Полезные модели. - 2004. - №34. - С.1011). Заключается он в следующем: у женщин с невынашиванием гормонального генеза определяют уровень прогестерона и дополнительно - эндометриальный белок α₂-микроглобулин фертильности (АМГФ) в смыве из полости матки на 22-24 день цикла и в менструальных выделениях до и после лечения и при увеличении его в смыве из полости матки более чем в 6 раз, в менструальных выделениях более чем в 4 раза и при увеличении уровня прогестерона оценивают подготовку как эффективную.

Недостатки способа:

1. способ применим только к случаям невынашивания гормонального генеза;

2. двухкратность проведения анализов;

3. высокая инвазивность;

4. требует привлечения многочисленного персонала;

5. не указана точность способа.

Наиболее близким по техническому решению к заявленному способу является способ прогнозирования восстановления эффективного деторождения у женщин с невынашиванием ранних сроков путем исследования периферической крови, отличающийся тем, что вне беременности определяют относительное содержание CD38+ лимфоцитов и при их значениях, равных или больших 12%, прогнозируют восстановление эффективного деторождения с точностью 86,33% (Патент №2257584. Способ прогнозирования восстановления эффективного деторождения у женщин с невынашиванием ранних сроков / Посисеева Л.В., Сотникова Н.Ю., Колесникова И.К. и др. // Изобретения. Полезные модели. - 2005. - №21).

Данный способ был выбран нами в качестве ближайшего аналога (прототипа).

Однако он имеет ряд недостатков:

1. женщинам с невынашиванием беременности проводилась только традиционная противовоспалительная и гормональная терапия и не проводилась иммунотерапия с целью коррекции иммунологических нарушений, которым отводится ведущая роль в генезе невынашивания беременности [2, 4, 5];

2. показатель содержания CD38+ лимфоцитов также определяется в периферической крови для прогнозирования темпов роста миомы матки [6], у часто и длительно болеющих лиц [4], в острый период нейрожелезистой формы паротитной инфекции [7]. При этом во всех случаях отмечается повышение числа лимфоцитов, несущих на своей поверхности данную молекулу.

3. точность - 86,33%.

Заявляемый технический результат достигается тем, что в периферической крови женщин вне беременности с невынашиванием ранних сроков в анамнезе после проведения традиционной и последующей иммуноцитотерапии определяют относительное количество CD69+ лимфоцитов и при значении этого показателя, равном или менее 6,2%, прогнозируют восстановление эффективного деторождения в 91% случаев.

Новизна заявляемого способа заключается в том, что впервые предлагается прогнозировать восстановление эффективного деторождения по определению относительного содержания CD69+ лимфоцитов в периферической крови.

Ранее показатель CD69+ определяли в периферической крови при первичных иммунодефицитных заболеваниях, обусловленных дефектами лимфоцитов [8], при старении организма, при лекарственной аллергии [5], при аутоиммунном тиреоидите [9], у больных хроническим гепатитом С [10]. При всей вышеуказанной патологии отмечалось высокое содержание лимфоцитов, несущих маркер ранней активации CD69+.

Применение иммуноцитотерапии вне беременности у женщин с невынашиванием ранних сроков в анамнезе оказывает выраженное иммуномодулирующее действие, проявляющееся в достижении высочайшего уровня «блокирующих антител». Последние, связываясь с клетками трофобласта, защищают их от цитотоксического действия клеток матери, тем самым предотвращая отторжение плода [2, 3]. Высокое содержание активированных лимфоцитов в периферической крови, а именно CD69+, по-видимому, можно расценивать как активацию системного иммунного ответа клеточного типа на стимуляцию антигеном, в частности, инфекционным агентом [3, 5]. У женщин под воздействием иммуноцитотерапии отмечалось снижение уровня активированных CD69+ лимфоцитов. Мы предполагаем, что это связано с уменьшением антигенной нагрузки за счет элиминации инфекционных агентов под действием иммуноцитотерапии.

Для прогнозирования восстановления эффективного деторождения этот показатель применяется впервые.

Способ осуществляется следующим образом:

1. У женщин производят забор 1 мл периферической венозной крови.

2. Выделение лимфоцитов из 1 мл периферической венозной крови осуществляется стандартным методом - центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографин при 1500 об/мин в течение 30 минут [11].

3. В пробирку, содержащую 100 мкл лимфоцитов в концентрации 1×10⁶ кл/мл, добавляют 20 мкл моноклональных анти-СD69 антител, меченных FITC или РЕ. Клетки инкубируют с моноклональными антителами в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте, после чего отмывают 1 раз 1 мл физиологического раствора центрифугированием при 1500 об/мин в течение 2 минут. Клетки в пробирках ресуспендируют в 500 мкл физиологического раствора [12].

4. Учет реакции проводят на проточном цитометре, определяя в лимфоцитарном гейте процентное (относительное) содержание CD69+ клеток.

Отличительными признаками способа являются:

установлен прогностический параметр относительного содержания CD69+ лимфоцитов в периферической крови после проведения традиционной и последующей иммуноцитотерапии, при количественном значении которого, равном или менее 6,2%, прогнозируют восстановление эффективного деторождения у женщин с невынашиванием беременности ранних сроков.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами:

Пример 1.

Пациентка В., 26 лет, была направлена в клинику с диагнозом: Привычное невынашивание беременности (в анамнезе 2 самопроизвольных выкидыша в сроке 8-9 недель, 1 погибшая беременность в сроке 10-11 недель). В ходе клинического обследования установлено: менструальный цикл - двухфазный с недостаточностью II фазы; по данным гормонального обследования выявлена гиперандрогения. При морфологическом исследовании эндометрия установлено сочетание хронического эндометрита с гормональными нарушениями в структуре эндометрия. Выявлен хламидиоз и уреаплазмоз. Заключение терапевта: Хронический бронхит, хронический гастрит, нейроциркуляторная дистония по гипотоническому типу. Поставлен клинический диагноз: Привычное невынашивание беременности. Хронический эндомиометрит. Хламидиоз. Уреаплазмоз. Гиперандрогения. Нарушение менструальной функции по типу НЛФ.

После проведенного противовоспалительного лечения, коррекции менструального цикла с последующим использованием иммуноцитотерапии при обследовании заявляемым способом содержание CD69+ лимфоцитов в периферической крови составило 4,4%, что позволяет прогнозировать восстановление эффективного деторождения. Действительно, у женщины наступила беременность, которая закончилась своевременными родами и рождением здорового ребенка. Заключение: прогноз по заявляемому способу подтвердился.

Пример 2.

Пациентка Б., 24 лет, поступила на обследование по поводу первичного невынашивания беременности (в анамнезе погибшая беременность в сроке 9-10 недель). В ходе клинического обследования установлено: менструальный цикл - двухфазный, уровень гормонов в периферической крови, моче - в пределах нормальных значений. При морфологическом исследовании эндометрия установлено наличие воспалительных изменений в структуре эндометрия. Выявлена герпетическая инфекция.

Поставлен клинический диагноз: Первичное невынашивание беременности. Хронический эндометрит. Герпетическая инфекция. Гирсутный синдром.

В стационаре проведено специфическое противовоспалительное лечение, иммуноцитотерапия. При обследовании заявляемым способом содержание CD69+ лимфоцитов в периферической крови составило 7,5%, что выше заявляемого параметра и позволяет прогнозировать неэффективное деторождение. Действительно, последующая беременность закончилась самопроизвольным выкидышем в сроке 8-9 недель. Прогноз по заявляемому способу подтвердился - восстановление эффективного деторождения не произошло.

Пример 3.

Пациентка А., 25 лет, поступила на обследование в гинекологическое отделение по поводу невынашивания беременности и нарушения менструальной функции. В анамнезе: 1 своевременные роды, 1 погибшая беременность в сроке 9 недель беременности. По тестам функциональной диагностики - цикл двухфазный с недостаточностью лютеиновой фазы. В ходе гормонального обследования выявлена гиперпролактинемия, гипопрогестеронемия. При гистологическом исследовании биоптата эндометрия установлено наличие сочетания признаков хронического эндометрита с гормональными нарушениями в структуре эндометрия. Выявлен хламидиоз и микоплазмоз. Заключение терапевта: Хронический пиелонефрит, хронический гастрит, хронический гайморит, нейроциркуляторная дистония по гипотоническому типу. Поставлен клинический диагноз: Невынашивание беременности смешанного генеза. Гиперпролактинемия. Нарушение менструальной функции по типу НЛФ. Хронический эндометрит. Хламидиоз. Микоплазмоз.

После проведенного противовоспалительного лечения, коррекции менструального цикла с последующим использованием иммуноцитотерапии при обследовании заявляемым способом установлено содержание CD69+ лимфоцитов в периферической крови - 6,2%. Восстановление эффективного деторождения прогнозируется. У женщины наступила беременность, которая закончилась своевременными родами и рождением здорового ребенка. Заключение: прогноз по заявляемому способу подтвердился.

Преимущества заявляемого способа:

1. высокая точность - 91%, чувствительность - 95%, специфичность - 80%;

2. позволяет прогнозировать восстановление эффективного деторождения еще до наступления беременности.

3. применение иммуноцитотерапии вне беременности у женщин с невынашиванием ранних сроков в анамнезе оказывает выраженное иммуномодулирующее действие, проявляющееся в развитии адекватного иммунного ответа, нормализации гормональной функции плаценты и, как следствие, предотвращение самопроизвольных выкидышей.

4. способ позволяет своевременно провести профилактические и лечебные мероприятия для предотвращения повторных случаев невынашивания беременности;

5. простота и доступность методики.

Указанным способом на базе гинекологической клиники ФГУ «Ив НИИ М и Д им. В.Н.Городкова Росздрава» обследованы 32 пациентки. Данные исследований приведены в таблице. Наблюдение за больными осуществлялось в течение года.

ПоказательКоличество женщинВсего женщин32Истинно положительный результат21Ложно-положительный результат2Истинно отрицательный результат8Ложно-отрицательный результат1Итого:
Точность заявляемого способа - 91%
Чувствительность заявляемого способа - 95%
Специфичность заявляемого способа - 80%

Литература

1. Сидельникова В.М. Привычная потеря беременности. - М.: Триада-Х, 2005. - 304 с.

2. Говалло В.И. Иммунология репродукции. - М.: Медицина, 1987. - 304 с.

3. Сухих Г.Т., Ванько Л.В. Иммунология беременности. - М.: Издательство РАМН, 2003. - 400 с.

4. Суховей Ю.Г., Унгер И.Г., Аргунова Г.А., Береснева Л.А., Петров С.А. Общие иммунологические характеристики групп часто и длительно болеющих в ремиссию у коренного и пришлого населения Тюменской области // Russia Journal of Immunology. - 1999. - V.4. - Supplement 1, - P.191.

5. Ярилин А.А. Основы иммунологии: Учебник. - М.: Медицина, 1999. - 608 с.

6. Патент №2236684. Российская Федерация. Способ прогнозирования роста лейомиомы матки / Посисеева Л.В., Малышкина А.И., Суворкина Е.Е. и др. // Изобретения. Полезные модели. - 2004. - №26 (III ч.). - С.544.

7. Иммунология острого периода паротитной инфекции / Кашуба Э.А., Ханипова Л.В., Дроздова Т.Г., Малышкин А.А., Чебышева Е.В., Черемных Л.Г. // Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии: Сб. трудов 4 Конгресса РААКИ. - М., 2001. - С.70.

8. R.H.Buckley. Primary Immunodeficiency Diseases Due to Defects in Lymphocytes // www.medafarm.ru / php/content.php. // New England Journal of Medicine. - Vol.343. - N18.

9. Kassian М.Т., Ikermatsu., Casati P. CD5+ В lymphocytes // Proc. Soc. Exp. Biol. (N.Y.). - 1991; 197. - P.226-241.

10. Lohr H.F., Sclaak J.F., Kollmannsperger S. et al. Liver-infiltrating and circulating CD4+ Т cells in chronic hepatitis C: immunodominant epitopes, HLA-restriction and functional significance. Liver, 1996, 16: 174-182.

11. Boum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood and bone marrow // Scand. J. Clin. Invest. - 1968. - V.21. - N97. - P.77.

12. Ohta G., Fujiwara K., Nishi Т., Oka H. Normal values of peripheral lymphocyte populatuon and Т cell subsets at a fixed time of day: A flow cytometric analysis with monoclonal antibodies in 210 healthy adults // Clin. Exp. Immunol. - 1986. - V.64. - P.146-149.

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования восстановления эффективного деторождения после иммуноцитотерапии у женщин с невынашиванием беременности ранних сроков. Для осуществления способа после традиционного лечения с последующей иммуноцитотерапией вне беременности в периферической венозной крови женщин с невынашиванием ранних сроков в анамнезе определяют относительное содержание CD69+ лимфоцитов. При значениях этого показателя меньше или равном 6,2% прогнозируют восстановление эффективного деторождения. Предлагаемый способ прост в исполнении и позволяет с высокой точностью, специфичностью и чувствительностью прогнозировать восстановление эффективного деторождения, выбрать правильную тактику ведения женщин с невынашиванием ранних сроков в анамнезе, что способствует снижению частоты данной патологии. 1 табл.

Способ прогнозирования восстановления эффективного деторождения после иммуноцитотерапии у женщин с невынашиванием ранних сроков путем иммунологического исследования периферической крови вне беременности, отличающийся тем, что после проведения традиционного лечения и последующей иммуноцитотерапии определяют относительное содержание CD69+ лимфоцитов и при его значении, равном или менее 6,2% прогнозируют восстановление эффективного деторождения.