ПРИМЕНЕНИЕ ДНК-ДИАГНОСТИКИ НА НАЛИЧИЕ ПОЛИМОРФИЗМА R353Q В ГЕНЕ ФАКТОРА VII СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ ДЛЯ ОЦЕНКИ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К РАЗВИТИЮ ПРИВЫЧНОГО НЕВЫНАШИВАНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ И СПОСОБ ОЦЕНКИ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ЭТОМУ ЗАБОЛЕВАНИЮ ПУТЕМ АНАЛИЗА СОЧЕТАНИЯ ПОЛИМОРФИЗМОВ С677Т ГЕНА MTHFR И R353Q ГЕНА ФАКТОРА VII Российский патент 2008 года по МПК C12Q1/68 

Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии и медицинской генетики и может быть использовано при определении риска развития привычного невынашивания беременности (ПН). Предлагается способ, позволяющий установить предрасположенность к развитию привычного невынашивания по результатам ДНК-диагностики на носительство определенных полиморфизмов генов метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) и фактора VII свертывания крови.

Одной из основных причин развития ПН являются гемодинамические микроциркуляторные изменения. Важную роль в регуляции гемодинамики играют процессы свертывания крови. Беременность является сама по себе тромбофилическим состоянием: при физиологическом течении беременности, с одной стороны, происходит активация факторов свертывания, а с другой - снижение активности системы фибринолиза. Указанные изменения направлены на защиту организма от возможного кровотечения при родах. Однако в случае «избыточной» гиперкоагуляции возникают тромботические изменения в материнско-плодовом кровотоке, что приводит к нарушению маточно-плацентарной гемодинамики и, как следствие, развитию таких осложнений, как гестоз, гипоксия плода, невынашивание беременности и др. В связи с этим при прогнозировании возможности развития ПН особое значение приобретает оценка состояния у беременных системы коагуляции крови, прежде всего выявление ее индивидуальных особенностей наследственного характера. Поскольку указанные особенности могут быть связаны с наличием определенных полиморфизмов в генах, участвующих в процессах свертывания крови, выявление носителей таких полиморфизмов среди женщин с клиническими признаками ПН представляется перспективным подходом для оценки предрасположенности к развитию данной патологии.

Уровень техники

В последнее время появляется все больше работ, посвященных исследованию взаимосвязи между носительством полиморфизмов генов факторов, которые прямо или косвенно относятся к системе свертывания крови, и развитием ПН. В частности, имеются данные, свидетельствующие о наличии опосредованной (кодированием белков - участников процессов коагуляции и фибринолиза) связи с риском невынашивания беременности таких полиморфизмов, как G20210A гена протромбина (Hohlagschwandtner М. et all, 2003), С677Т гена метилентетрагидрофолатредуктазы (Schwahn В., Rozen R., 2001), C1565T гена гликопротеина IIIa, 4G/5G гена PAI-1 (Goodman C.S. et al., 2006).

Результаты, полученные разными авторами при изучении одних и тех же полиморфизмов, во многих случаях достаточно противоречивы, однако большинство исследователей сходится во мнении о том, что носительство мутантного аллеля 677Т гена MTHFR определенно является наиболее частым среди других полиморфизмов фактором риска развития ПН.

Метилентетрагидрофолат редуктаза (MTHFR) - один из ключевых ферментов метаболизма гомоцистеина, который опосредует превращение последнего в метионин с помощью активной формы фолиевой кислоты. При нормальном уровне гомоцистеина в крови продуцируемый эндотелием оксид азота полностью связывает его в присутствии кислорода с образованием мощного вазодилататора и антиагреганта - S-нитрозогомоцистеина, имеющего период полужизни около 15 минут. В случае гипергомоцистеинемии «избыток» гомоцистеина остается не инактивированным, что вызывает оксидативное повреждение эндотелия и способствует развитию эндотелиальной дисфункции. Это, в свою очередь, приводит к активации тканевого фактора и «запуску» каскада тромбообразования с участием фактора VII (Welch G.N., Loscalzo J., 1998).

В 1995 году Fross и соавт. описали часто встречающийся полиморфизм, который заключается в замене цитозина на тимин в 677-м положении гена, кодирующего MTHFR (Frosst Р., Blom H.J., et al., 1995). Данный полиморфизм обнаруживается у 5-15% белого населения и приблизительно с той же частотой среди населения Японии (Deloughery T.G. et al., 1996). В популяции Санкт-Петербурга, согласно данным Ельчанинова А.П. и соавт. (2000), гомозиготы по данному полиморфизму встречаются с частотой 3,6%, а в Северо-Западном регионе РФ частота встречаемости гомозиготного носительства Т аллеля (ТТ генотип) и гетерозиготного (СТ генотип) составляет 8,4% и 33,6%, соответственно (Ельчанинов А.П. и соавт, 2000). В результате точечной мутации в гене происходит замена Glu на Ala в первичной структуре ферментного белка, что приводит к образованию термолабильного и менее активного варианта фермента (Frosst P. et al., 1995) и последующему повышению концентрации гомоцистеина в плазме крови (гипергомоцистеинемии).

К настоящему времени в литературе представлены многочисленные экспериментальные данные, свидетельствующие в пользу взаимосвязи носительства этого полиморфизма с предрасположенностью к развитию ПН (Unfried G. et al., 2002 - прототип настоящего изобретения, Lissak A., 1999, Wang X.P. et al., 2004, Mtiraoui N. et al., 2006). Однако нельзя не отметить, что авторы ряда работ этой связи все же не обнаруживают (Holmes Z.R., Regan L., 1999, Pauer H.U. et al., 2003, Makino A., 2004). С целью повышения надежности прогноза, касающегося наследственной предрасположенности к заболеванию, многие исследователи обращаются к поиску новых полиморфизмов, а также анализу комбинаций полиморфизмов различных генов, относящихся к системе свертывания крови, включающей и полиморфизм С677Т MTHFR (Raziel А. et al., 2001, Goodman C.S. et al., 2006).

Общим недостатком большинства предлагаемых для оценки риска развития ПН комбинаций можно считать недостаточно корректный принцип составления анализируемой группы полиморфизмов. В подавляющем большинстве случаев в такую группу включаются полиморфизмы генов, имеющих однонаправленный эффект на систему коагуляции, которые объединяются по признаку предполагаемой или экспериментально установленной связи с риском развития ПН (как правило, все это полиморфизмы прокоагулянтного действия). Между тем, логично предположить, что исключение из рассмотрения полиморфизмов, ответственных за подавление активности системы свертывания крови, может искажать реальную ситуацию и, соответственно, приводить к ошибкам в прогнозе развития заболевания. Более корректным представляется принцип формирования комбинации полиморфизмов, подлежащих анализу с целью оценки предрасположенности к ПН, предусматривающий включение в анализ полиморфизмов генов факторов системы гемомтаза, имеющих разнонаправленный эффект (как промоторный, так и протективный) на развитие заболевания.

Попытка реализовать указанный принцип была положена в основу настоящего изобретения.

Раскрытие изобретения.

Общая задача данного исследования - создание адекватной модели для прогнозирования развития ПН, основанной на анализе комбинации одновременно промоторных и протективных значимых для развития ПН полиморфизмов, относящихся к генам, которые кодируют функционально связанные между собой белки свертывания крови, участвующих в запуске каскада тромбообразования по внешнему пути свертывания.

В рамках настоящего изобретения поставленная задача нашла конкретное воплощение в разработке способа оценки предрасположенности к развитию ПН, осуществляемого путем одновременного ДНК-тестирования образцов крови на носительство полиморфизма С677Т гена MTHFR и полиморфизма R353Q гена фактора VII, первый из которых характеризуется прокоагулянтным эффектом, а второй - ингибирующим действием в отношении процессов свертывания крови, и составления заключения с учетом суммарного влияния выявленных генотипов на развитие заболевания.

Выбор данной пары полиморфизмов был обусловлен следующими причинами.

Как уже указывалось, полиморфизм С677Т гена MTHFR является одним из наиболее исследованных и частых полиморфизмов в отношении его связи с ПН, причем для гомозиготного состояния этого полиморфизма (ТТ) большинством исследователей показано выраженное прокоагулянтное действие, повышающее риск развития заболевания.

Что касается полиморфизма R353Q гена фактора VII, то, во-первых, кодируемый этим геном белок рассматривался нами как участвующий наравне с MTHFR в тромбообразовании путем активации тканевого фактора, а во-вторых, предположительно имеющий обратное по отношению к 677Т действие на процессы свертывания крови.

Фактор VII - неактивный витамин К-зависимый профермент, синтезируемый в печени и секретируемый в виде одноцепочечного гликопротеина молекулярной массой 50 кДа. При связывании с тканевым фактором он превращается в двухцепочечную активную форму и далее включается в процесс коагуляции в качестве активаторов факторов Х и XI.

К началу 90-х годов накопилось много экспериментальных данных о наличии корреляции между содержанием в плазме активного фактора VII и тромбообразованием, в частности при некоторых кардиологических заболеваниях (Orlando M. et al., 1987; Hoffman С. et al., 1988; de Sousa J.C. et al., 1988). Что касается работ по изучению роли фактора VII в развитии ПН, то в ряде из них также получены данные, свидетельствующие о том, что повышение его концентрации в крови является фактором риска спонтанного прерывания беременности (Miller С. et al., 2005). В 1991 году Green и соавт. обнаружили связь между концентрацией фактора VII в крови и полиморфизмом кодирующего его гена, характеризующимся заменой гуанина (G) на аденин (А) в 353-м кодоне, результатом которой является замена аргинина глутамином в последовательности белка (Green F. et al., 1991). При этом согласно данным Lane D.A., 2000 мутантный аллель ассоциирован примерно с 20-30% снижением уровня белка в плазме (Lane D.A. et al., 2000). В более позднем исследовании, включавшем более 2500 пациентов с кардиоваскулярной патологией, было установлено, что RQ (Arg/Gln)-генотип четко коррелирует со снижением риска ишемической болезни сердца (Wu А.Н., Tsongalis G.J., 2001). Аналогичные результаты получены в работе Girelli D. и соавт. (2000), которые показали, что наличие RQ и QQ генотипа может отчасти объяснить отсутствие инфаркта миокарда у лиц с выраженным атеросклерозом (Girelli D. et al., 2000).

Таким образом, имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о связи мутантного аллеля 353Q со снижением уровня фактора VII, а следовательно, и с возможным снижением активности свертывающей системы крови, результатом чего можно считать его протективное действие при некоторых кардиологических заболеваниях. Что касается попыток исследования связи с ПН, то влияние на развитие заболевания полиморфизма R353Q VII фактора до настоящего времени не изучалось. В то же время имеются данные о том, что патогенез ПН связан с повышением концентрации VII фактора в плазме крови (Miller et al., 2005).

Осуществление изобретения включало следующие этапы.

а) Экспериментальная проверка сведений о взаимосвязи полиморфизма С677Т гена MTHFR с развитием ПН.

б) Установление наличия и характера влияния полиморфизма R353Q на развитие ПН.

в) Анализ суммарного эффекта двух исследуемых полиморфных состояний генов MTHFR и фактора VII относительно риска развития ПН и использование полученных результатов для оценки предрасположенности к развитию заболевания.

Проведение ДНК-диагностики пациенток с целью определения аллельных вариантов двух анализируемых генов проводилось нами, главным образом, с помощью метода полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, однако следует иметь в виду, что при осуществлении предлагаемого способа может быть применен любой из известных ныне методов, обеспечивающий надежное детектирование точечных замен в последовательности ДНК, в частности аллель-специфичная ПЦР, масс-спектрометрия, метод гибридизации, ПЦР в реальном времени и т.д.

Проведенный анализ ДНК у 120 женщин с клиникой угрозы прерывания беременности показал, что

а) в случае полиморфизма С677Т в гене MTHFR гомозиготный генотип ТТ в несколько раз чаще выявляется у женщин с неблагоприятными исходами в анамнезе (выкидыши, неразвивающаяся беременность) по сравнению с группой женщин, не имевших неблагоприятных исходов в анамнезе. Причем данные различия сохраняются вне зависимости от наличия или отсутствия у них воспалительных заболеваний репродуктивной сферы, которые могут также способствовать формированию ПН. Генотипы СС и СТ не обнаруживают достоверной связи с развитием ПН (пример 2, фиг.2, 3);

б) В случае полиморфизма R353Q в гене фактора VII частота встречаемости гетерозиготного генотипа RQ у женщин с неблагоприятными исходами в анамнезе значительно (примерно в 5 раз) ниже, чем в группе пациенток с отсутствием таких исходов. Соответственно при отсутствии Q-аллеля гомозиготный генотип RR проявляет себя как неблагоприятный наследственный признак. Генотип QQ характеризуется низкой частотой встречаемости (2,4% в норме и 2,5% в исследуемых группах), что в рамках данного исследования препятствует составлению однозначного мнения относительно его взаимосвязи с ПН (пример 3, фиг.4 и 5).

в) Влияние конкретной комбинации двух генотипов на развитие ПН представляет собой результат суммирования эффектов составляющих ее генотипов (пример 4, фиг.6 и 7). Генотипы СТ и СС проявляют себя как «нейтральные» в комбинации с любым генотипом, относящиеся к полиморфизму R353Q, в данном случае благоприятный/неблагоприятный эффект зависит от наличия протективного генотипа RQ. Генотип ТТ при отсутствии протективного генотипа RQ усиливает неблагоприятный эффект на формирование ПН. К сожалению, из-за отсутствия пациенток с генотипом RQ/TT мы не можем сказать о влиянии данного сочетания генотипов.

На основании полученных данных оба взятые в анализ полиморфизма были признаны значимыми для развития ПН; при этом для гомозиготного состония мутантного аллеля 677Т гена MTHFR был подтвержден выраженный неблагоприятный эффект, коррелирующий с угрозой прерывания беременности, а для аллеля 353 Q гена VII фактора впервые показано явное протективное влияние в отношении развития ПН. По результатам исследования определяемых у пациенток конкретных генотипов сделан вывод о суммировании эффектов, наблюдаемых для полиморфизма С677Т MTHFR и полиморфизма R353Q фактора VII в отдельности и, соответственно, о том, что корректное прогнозирование риска невынашивания требует одновременного исследования образцов ДНК на носительство обоих названных полиморфизмов. В связи с этим для оценки предрасположенности женщин к развитию ПН предлагается проводить ДНК-диагностику на носительство полиморфизма С677Т в гене MTHFR и полиморфизма R353Q в гене фактора VII с целью установления генотипа пациентки для определения прогноза заболевания (см. таблицу 1).

Таким образом, первым аспектом изобретения является применение ДНК-диагностики на наличие полиморфизма R353Q гена фактора VII свертывания крови для оценки предрасположенности к развитию привычного невынашивания беременности, а вторым - новый способ оценки предрасположенности к развитию привычного невынашивания беременности, предусматривающий проведение ДНК-диагностики на наличие полиморфизма С677Т гена метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) и полиморфизма R353Q гена фактора VII свертывания крови и составление заключения по результатам определения генотипов с использованием таблицы №1.

Краткое описание графических материалов.

Фиг.1

А. Специфические фрагменты, наблюдаемые при электрофоретическом разделении рестрицированного ПЦР-продукта области полиморфизма С677Т MTHFR.

СС - генотип, гомозиготный по аллелю дикого типа, СТ - гетерозиготный генотип и ТТ - гомозиготный генотип по мутантному аллелю.

Б. Специфические фрагменты, наблюдаемые при электрофоретическом разделении рестрицированного ПЦР-продукта области полиморфизма R353Q фактора VII. RR - генотип, гомозиготный по аллелю дикого типа, RQ - гетерозиготный генотип и QQ - гомозиготный генотип по мутантному аллелю.

Фиг.2 - Полиморфизм MTHFR С677Т. Распределение частот встречаемости различных генотипов в популяции и в группах пациенток с наличием и с отсутствием неблагоприятных исходов в анамнезе. По оси ординат - процент от общего количества в данной группе. Белые столбцы - контрольная группа; серые столбцы - подгруппа пациенток без неблагоприятных исходов в анамнезе; черные столбцы - подгруппа пациенток с неблагоприятными исходами в анамнезе.

Фиг.3 - Полиморфизм MTHFR С677Т. Распределение частот полиморфизмов в группе пациенток без сопутствующих воспалительных заболеваний органов малого таза в зависимости от наличия/отсутствия неблагоприятных исходов и в популяции. По оси ординат - процент от общего количества в данной группе. Белые столбцы - контрольная группа; серые столбцы - подгруппа пациенток без неблагоприятных исходов в анамнезе; черные столбцы - подгруппа пациенток с неблагоприятными исходами в анамнезе.

Фиг.4 - Полиморфизм R353Q фактора VII. Распределение частот встречаемости различных генотипов в популяции и в группах пациенток с наличием и с отсутствием неблагоприятных исходов в анамнезе. По оси ординат - процент от общего количества в данной группе. Белые столбцы - контрольная группа; серые столбцы - подгруппа пациенток без неблагоприятных исходов в анамнезе; черные столбцы - подгруппа пациенток с неблагоприятными исходами в анамнезе.

Фиг.5 - Полиморфизм R353Q фактора VII. Распределение частот полиморфизмов в группе пациенток без сопутствующих воспалительных заболеваний органов малого таза в зависимости от наличия/отсутствия неблагоприятных исходов и в популяции. По оси ординат - процент от общего количества в данной группе. Белые столбцы - контрольная группа; серые столбцы - подгруппа пациенток без неблагоприятных исходов в анамнезе; черные столбцы - подгруппа пациенток с неблагоприятными исходами в анамнезе.

Фиг.6 - Соотношение неблагоприятных и благоприятных исходов для генотипов MTHFR и фактора VII, определяемых как 677ТТ-/R353Q+ и 677ТТ+/R353Q -. По оси ординат - процент от общего количества в данной группе. Белые столбцы - подгруппа пациенток без неблагоприятных исходов в анамнезе; серые столбцы - подгруппа пациенток с неблагоприятными исходами в анамнезе.

Фиг.7 - Соотношение неблагоприятных и благоприятных исходов для различных генотипов MTHFR C677T/VIIF R353Q. По оси ординат - процент от общего количества в данной группе. Белые столбцы - подгруппа пациенток без неблагоприятных исходов в анамнезе; серые столбцы - подгруппа пациенток с неблагоприятными исходами в анамнезе.

Осуществление изобретения.

I. Материалы и методы.

1. Критерии отбора пациенток с ПН для проведения анализа.

В исследуемую группу отбирались женщины российской популяции с клиническими признаками угрозы прерывания беременности на ранних сроках (до 16 недель): кровянистые выделения из половых путей, тянущие боли внизу живота.

При этом в анализируемую группу не включали пациенток с наличием хромосомной патологии, АФС, Rh-конфликта, анатомических аномалий репродуктивных органов.

Контрольная группа формировалась из здоровых доноров российской популяции.

2. Отбор образцов крови и выделение ДНК.

Венозная кровь в объеме 10 мл забиралась в пробирки, содержащие ЭДТА в качестве антикоагулянта (1 объем раствора 0,5 М Na₂-ЭДТА, рН 8,0+9 объемов крови). После тщательного перемешивания образцы помещались в морозильную камеру и хранились при -20°С. Выделение геномной ДНК проводили с помощью модифицированного метода с протеиназой К и экстракцией фенол-хлороформом. Для этого в 1,5 мл пробирку (Eppendorf) вносили 700 мкл анализируемого образца крови и 700 мкл ТЕ-буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА) для гемолиза эритроцитов. Процедуру повторяли 2 раза, а затем к клеточному осадку добавляли 400 мкл буфера для протеиназы К, содержащего 200 мкг/мл протеиназы К, после чего инкубировали 4 часа при 60°С на термошейкере с постоянным перемешиванием (850 об/мин). Далее проводили фенол-хлороформную экстракцию ДНК с последующим осаждением 96% этанолом и центрифугированием в течение 10 мин при 10000 об/мин. После серии промывок ДНК элюировали ТЕ буфером (200 мкл). Концентрация выделенной ДНК составляла от 30 до 50 нг/мкл.

3. ПЦР-амплификация и анализ ПЦР-продуктов.

Для определения полиморфизмов в исследуемых генах применялся метод ПДРФ (полиморфизма длины рестрикционных фрагментов). ПЦР проводили в термоциклере Master Cycler Gradient фирмы Eppendorf. При этом для каждого из генов использовали специфические праймеры и условия реакции.

ПЦР проводили в объеме 25 мкл в растворе следующего состава: по 6 пмоль каждого праймера, четыре дезоксинуклеозидтрифосфата (каждый в концентрации 0,2 мМ), 1 мкл геномной ДНК, ПЦР смесь фирмы Amplisense, содержащая Taq-полимеразу, буфер для Taq-полимеразы и MgCl₂.

Для рестрикционного анализа продукты ПЦР подвергали обработке соответствующей рестриктазой в течение 6 часов. На реакцию рестрикции брали 9 мкл ампликона, 0,5 мкл рестриктазы (3-4ЕД) и 1 мкл 10× буфера для рестриктазы.

Продукты рестрикции/амплификации анализировали посредством электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем 1 мкг/мл бромистого этидия. Размер фрагментов определяли с помощью стандарта массы 500 п.о. - Ladder фирмы «Fermentas».

4. Статистическая обработка результатов.

Обработку результатов, полученных при ДНК-тестировании, проводили с помощью программы «Статистика 6.0» методом χ².

II. Примеры реализации и результаты.

Пример 1. Общая характеристика исследуемой группы.

Исследуемая группа включала 120 пациенток, отобранных в соответствии с критериями, указанными в разделе «Материалы и методы». В контрольную группу было включено 200 здоровых доноров.

Первоначально женщины исследуемой группы были разделены на подгруппы по следующим критериям:

а) наличие/отсутствие воспалительных заболеваний репродуктивной сферы (хронический аднексит, хронический эндометрит, бактериальный вагиноз, грибковый кольпит, хламидиоз, уреаплазмоз), как дополнительного фактора риска ПН - подгруппы «а1» и «а2», соответственно.

б) наличие/отсутствие неблагоприятных исходов (выкидыши, неразвивающаяся беременность) в анамнезе - подгруппы «б1» и «б2», соответственно.

Далее в подгруппах «а» было проведено исследование зависимости частоты неблагоприятных исходов от наличия заболевания. При этом было установлено, что эти показатели в двух подгруппах различаются незначительно (частота неблагоприятных исходов для группы «а1» - 78%, для группы «а2» - 68%). Это позволило при проведении генетического анализа пренебречь наличием у пациенток воспалительных заболеваний, входящих в перечень, который приведен выше, и продолжить исследования только с учетом критерия, относящегося к наличию/отсутствию неблагоприятных исходов в анамнезе.

Пример 2. Проведение анализа ДНК на носительство полиморфизма С677Т гена MTHFR и его результаты.

Отбор образцов крови, выделение ДНК, ПЦР-амплификацию и анализ ПЦР-продуктов проводили в соответствии с методиками, описанными в разделе «Материалы и методы». При этом для амплификации использовали праймеры, представленные в нижеследующей таблице 1.

Таблица 1ПолиморфизмПраймерыРазмер ПЦР продуктов (пар оснований)С677Т MTHFR5' - TGA AGO AGA AGG TGT CTG CGG GA - 3' sense1985' - AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG - 3' antisense

ПЦР проводили при следующих условиях: денатурация (94°С, 5 мин) - 1 цикл, денатурация (94°С, 60 сек), отжиг (62°С, 90 сек) и элонгация (72°С, 60 сек) - 38 циклов, конечная элонгация (72°С, 5 мин) - 1 цикл.

Для получения специфических рестрикционных фрагментов применяли рестриктазу HinfI.

О наличии в образце определенных аллельных вариантов гена MTHFR судили по появлению в геле фрагментов с размерами, указанными ниже (фиг.1А).

ПолиморфизмРазмер ПЦР-продукта, пар основанийРестриктазаПродукты рестрикции (пар оснований)С677Т MTHFR198Hinf IСС - 198СТ - 198, 175, 23ТТ - 175, 23

При проведении ДНК-тестирования на носительство полиморфизма С677Т были получены следующие результаты.

а) Определение частоты встречаемости аллеля 677Т в группе доноров показало соответствие этого показателя равновесию Харди-Вайнберга, что свидетельствовало о репрезентативности выборки. В исследуемой группе этот аллель обнаруживался с такой же частотой (30,1%), что и в контрольной (30%).

б) При сравнении частот встречаемости генотипов СС, СТ и ТТ в двух исследованных подгруппах пациенток (с наличием и отсутствием неблагоприятных исходов в анамнезе) было установлено, что у женщин с наличием неблагоприятных исходов в анамнезе частота генотипа MTHFR ТТ была примерно в 6 раз выше (17.9%), чем у остальных пациенток (3%, OR=5,67, p<0,05), и примерно вдвое выше, чем в популяции (9%, OR=1,9; р=0,3). Для гетерозиготы СТ результаты по двум анализируемым подгруппам практически совпадали (38,4% и 40,6%) и при этом соответствовали частоте встречаемости данного генотипа в популяции (42%). Представленность гомозиготного генотипа СС в группе с отсутствием неблагоприятных исходов была несколько выше, чем в группе с неблагоприятным анамнезом, однако выявленное различие не было статистически достоверным (фиг.2).

С целью дополнительного контроля возможности искажения результатов в связи с наличием у пациенток воспалительных заболеваний при оценке распределения генотипов СС, СТ и ТТ в каждой из подгрупп были использованы только данные, полученные при тестировании ДНК женщин с отсутствием указанных заболеваний. Полученные данные (фиг.3) свидетельствуют о сохранении всех закономерностей, выявленных при анализе группы в целом.

На основании результатов тестирования ДНК на носительство полиморфизма С677Т был сделан вывод, что гомозиготное носительство аллеля 677Т является при прогнозировании ПН выраженным неблагоприятным признаком, а генотипы СС и СТ с точки зрения предрасположенности к заболеванию представляются нейтральными.

Пример 3. Проведение анализа ДНК на носительство полиморфизма R353Q гена фактора VII и его результаты.

Отбор образцов крови, выделение ДНК, ПЦР-амплификацию и анализ ПЦР-продуктов проводили в соответствии с методиками, описанными в разделе «Материалы и методы». При этом для амплификации использовали праймеры, представленные в нижеследующей таблице 2.

Таблица 2ПолиморфизмПраймерыРазмер ПЦР продуктов (пар оснований)R353Q фактора VII5' - GCA GCA AGG ACT CCT GCA AG - 3' sense2395' - CCA CAG GCC AGG GCT GCT GG - 3' antisense

ПЦР проводили при следующих условиях: денатурация (94°С, 5 мин) - 1 цикл, денатурация (94°С, 30 сек), отжиг (58°С, 30 сек) и элонгация (72°С, 30 сек) - 39 циклов, конечная элонгация (72°С, 5 мин) - 1 цикл.

О наличии в образце определенных аллельных вариантов гена VII фактора судили по появлению в геле фрагментов с размерами, указанными ниже (фиг.1Б).

ПолиморфизмРазмер ПЦР-продукта, пар основанийРестриктазаПродукты рестрикции (пар оснований)R353Q фактора VII198Msp IRR - 186, 53
RQ - 239, 186, 53
QQ - 239

При проведении ДНК-тестирования на носительство полиморфизма R353Q гена фактора VII были получены следующие результаты.

а) Определение частоты встречаемости аллеля 353 Q в группе доноров показало соответствие этого показателя равновесию Харди-Вайнберга, что свидетельствовало о репрезентативности выборки. В исследуемой группе этот аллель обнаруживался практически с такой же частотой (13.4%), что и в контрольной (10%).

б) При сравнении частот встречаемости генотипов RR, RQ и QQ в двух исследованных подгруппах пациенток (с наличием и отсутствием неблагоприятных исходов в анамнезе) было установлено, что у женщин с наличием неблагоприятных исходов в анамнезе частота генотипа RQ VII фактора была примерно в 5 раз ниже (7.7%), чем у остальных пациенток (34.4%, OR=4.5, р<0,05), и примерно втрое ниже, чем в популяции (22%, OR=2.85; р=0,3), а частота гомозиготного генотипа RR соответственно выше, чем в группе с благоприятными исходами (65.6% и 89.7%, OR=1.36, р<0.05). Встречаемость гомозиготного генотипа QQ в группе с неблагоприятными исходами составляла всего 2,56% и при этом соответствовала частоте представленности данного генотипа в норме (2,4%); в группе пациенток без неблагоприятных исходов в анамнезе данный генотип выявлен не был (фиг.4).

С целью дополнительного контроля возможности искажения результатов в связи с наличием у пациенток воспалительных заболеваний при оценке распределения генотипов RR, RQ и QQ в каждой из подгрупп были использованы только данные, полученные при тестировании ДНК женщин с отсутствием указанных заболеваний. Результаты этого анализа (фиг.5) свидетельствуют о сохранении всех закономерностей, выявленных при тестировании группы в целом (фиг, 4). Более того, отмеченная ранее связь генотипа RR с неблагоприятными исходами в данном варианте эксперимента выражена так же отчетливо с сохранением той же разницы (25%) между группами пациенток с неблагоприятными и благоприятными исходами.

На основании полученных данных был сделан вывод, что гетерозиготное носительство аллеля Q (RQ) при прогнозировании ПН должно рассматриваться как отчетливо протективный (препятствующий развитию патологии) признак. Генотип RR, при котором отсутствует Q-аллель, может быть определен как неблагоприятный с точки зрения исхода беременности. Что касается роли гомозиготы QQ в развитии ПН, то установить ее экспериментально не представлялось возможным в силу низкой частоты встречаемости этого генотипа в исследуемых группах (2,56%, данный генотип был определен только у двух пациенток), которая совпадает с незначительной представленностью данного генотипа и в норме (2,4%).

Пример 4. Определение зависимости исхода беременности от комбинации генотипов

Исходя из того, что генотип RQ фактора VII оказывает выраженное протективное действие и предупреждает появление неблагоприятных исходов, а генотип ТТ MTHFR в наибольшей степени предрасполагает к таким исходам, наиболее благоприятные и наиболее неблагоприятные сочетания генотипов в общем виде были определены нами как MTHFR TT-/VII RQ+ и MTHFR TT+/VII RQ- соответственно. В двух группах пациенток с комбинацией генотипов, отвечающих указанным условиям, было проведено сравнение частот неблагоприятных исходов. У пациенток с генотипом, попадающими под определение MTHFR TT-/VII RQ+, частота неблагоприятных исходов составила 31% (р<0,001), в то время как в группе пациенток с генотипом MTHFR TT+/VII RQ- частота неблагоприятных исходов была 92% (р<0.001) (фиг.6). Этими результатами еще раз был подтвержден вывод о протективном (в отношении развития ПН) характере действия мутантного аллеля 353Q фактора VII и отчетливой ассоциации между наличием генотипа ТТ MTHFR и риском развития заболевания.

Важным этапом в процессе разработки модели для оценки генетической предрасположенности к ПН на основе анализа полиморфизмов С677Т и R353Q было получение ответа на вопрос о соотношении эффектов, характерных для каждого из генотипов, в условиях их определенной комбинации. Результаты проведенного нами анализа представлены на фиг.7. Очевидно, что наибольшая частота благоприятных исходов наблюдается у женщин с генотипом RQ/CC: она составляет 75%, что в 3 раза выше частоты неблагоприятных исходов (25%). В комбинации генотипа RQ с генотипом СТ, хотя и наблюдается некоторое снижение частоты благоприятных исходов по сравнению с частотой неблагоприятных (62.5% и 37.5% соотв.), доля последних составляет немногим более трети от общего числа. Число пациенток, имеющих комбинацию генотипов RQ/TT, было недостаточным для получения статистически достоверных данных относительно этой разновидности генотипа.

В группе женщин с генотипом RR (дикий тип, в предварительных экспериментах был оценен как неблагоприятный)/СС (дикий тип, определен как нейтральный) частота неблагоприятных исходов достоверно выше по сравнению с частотой благоприятных (72.1% и 27.9% соотв.). Генотип RR в комбинации с генотипом СТ MTHFR дает примерно такую же частоту неблагоприятных исходов (77.1% против 22.9%), что дикий тип RR/CC. Носительство генотипа RR/TT повышает частоту неблагоприятных исходов до 92.3%. В результате анализа конкретных комбинаций генотипов прослеживаются следующие закономерности:

а) генотип ТТ проявляет себя как неблагоприятный признак, а генотипы СТ и СС как «нейтральные» в комбинации с любым генотипом, относящимися к полиморфизму R353Q;

б) генотип RQ демонстрирует протективный эффект, a RR - характерное неблагоприятное влияние на фоне любого из двух «нейтральных» генотипов, относящихся к полиморфизму С677Т;

в) влияние конкретной комбинации двух генотипов на развитие ПН представляет собой результат суммирования эффектов составляющих ее генотипов.

Полученные в этой серии экспериментов результаты приводят к однозначному выводу, что корректное прогнозирование риска развития ПН требует проведения ДНК-диагностики на носительство обоих названных полиморфизмов с целью определения генотипа пациентки.

Пример 5. Составление прогноза развития ПН на основании результатов ДНК-тестирования.

Вариант 1:

На основании проведенного нами экспериментального и теоретического анализа взаимосвязи носительства полиморфизмов С677Т в гене MTHFR и R353Q в гене фактора VII с риском невынашивания беременности составлена таблица (табл.3), где представлены все возможные (кроме включающих гомозиготу QQ, см. выше) варианты генотипов, которые могут быть определены в результате ДНК-тестирования на наличие двух указанных полиморфизмов, отмечено влияние каждого из них на развитие ПН и приведен прогноз, определяемый путем суммирования эффектов каждого из двух выявленных генотипов и подтвержденный экспериментальным путем (фиг.7).

В таблице были приняты следующие обозначения:

+ благоприятный эффект

0 нейтральный

- неблагоприятный

-- выраженно неблагоприятный

Таблица 3Прогноз развития привычного невынашивания у пациенток с угрозой прерывания беременности на основании данных анализа полиморфизмов С677Т гена MTHFR и R353Q гена фактора VIIГенотипОказываемый эффектСуммарная оценка генотипаПрогнозФактор VIIMTHFRRRСС(-)(0)-неблагоприятныйRRСТ(-)(0)-неблагоприятныйRRТТ(-)(--)---крайне неблагоприятныйRQСС(+)(0)+благоприятныйRQСТ(+)(0)+благоприятныйRQТТ(+)(--)+--более вероятен неблагоприятный

Из результатов, представленных в таблице 3, с очевидностью следует, что при оценке риска развития заболевания только на основании данных о полиморфном состоянии гена MTHFR (согласно известным аналогам) прогноз мог бы быть ошибочным, по меньшей мере, в 4 из приведенных шести вариантов (RR/CC, RR/CT, RQ/CC, RQ/CT). Соответственно, основным преимуществом предлагаемого способа прогнозирования развития ПН в сравнении с известными аналогами является возможность получения более точной и надежной информации об индивидуальной предрасположенности женщины с определенным генотипом к этому заболеванию.

В свою очередь это позволяет выработать правильную тактику лечения и объем проводимой терапии в каждом конкретном случае.

Литература

1. Ельчанинов А.П., Капустин С.И., Сироткина О.В., Волков В.К., Силяхина С.В., Ломакина С.В., Шварц Е.И., Папаян Л.П. Протромботические генотипы у молодых лиц с дисциркуляторной энцефалопатией. // Юбилейная Х Конференция "Нейроиммунология": Тез. докл. научн. конф. - СПб., 2000.

2. de Sousa J.C., Soria C., Ayrault-Jarrier M., Pastier D., Bruckert E., Amiral J., Bereziat G., Caen J.P. Association between coagulation factors VII and X with triglyceride rich lipoproteins. J. Clin Pathol. 1988, Sep.; 41(9):940-4.

3. Deloughery T.G., Evans A., Sadeghi A., McWilliams J., Henner W.D., Taylor L.M. Jr, Press R.D. Common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase. Correlation with homocysteine metabolism and late-onset vascular disease. Circulation. 1996, Dec. 15; 94(12):3074-8.

4. Frosst P., Blom H.J., et al. "A candidate genetic risk factor for vascular disease: a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase." Nat Genet. 1995, May; 10(1):111-3.

5. Girelli D., Russo C., Ferraresi P., Olivieri О., Pinotti M., Friso S., Manzato F., Mazzucco A., Bemardi F., Corrocher R. Polymorphisms in the factor VII gene and the risk of myocardial infarction in patients with coronary artery disease. N Engl. J. Med., 2000 Sep. 14; 343(11):774-80.

6. Goodman C.S., Coulam C.B., Jeyendran R.S., Acosta V.A., Roussev R. Which thrombophilic gene mutations are risk factors for recurrent pregnancy loss? Am J. Reprod Immunol. 2006, Oct.; 56(4):230-6.

7. Green F., Kelleher C., Wilkes H., Temple A., Meade T., Humphries S. A. common genetic polymorphism associated with lower coagulation factor VII levels in healthy individuals. Arterioscler Thromb. 1991, May-Jun; 11(3):540-6.

8. Hoffinan C., Shah A., Sodums M., Hultin M.B. Factor VII activity state in coronary artery disease. J. Lab. Clin. Med., 1988 Apr.; 111(4):475-81.

9. Hohlagschwandtner M., Untried G., Heinze G., Huber J.C., Nagele F., Tempter C. Combined thrombophilic polymorphisms in women with idiopathic recurrent miscarriage. Fertil Steril. 2003, May; 79(5):1141-8.

10. Holmes Z.R., Regan L., Chilcott I., Cohen H. The C677T MTHFR gene mutation is not predictive of risk for recurrent fetal loss. Br. J. Haematol. 1999, Apr.; 105(1):98-101.

11. Lane D.A., Grant P.J. "Role ofhemostatic gene polymorphisms in venous and arterial thrombotic disease." Blood. 2000, Mar. 1; 95(5):1517-32.

12. Lissak A., Sharon A., Fruchter О., Kassel A., Sanderovitz J., Abramovici H. Polymorphism for mutation of cytosine to thymine at location 677 in the methylenetetrahydrofolate reductase gene is associated with recurrent early fetal loss. Am. J. Obstet Gynecol. 1999 Jul.; 181(1):126-30.

13. Makino A., Nakanishi T., Sugiura-Ogasawara M., Ozaki Y., Suzumori N., Suzumori К. No association of C677T methylenetetrahydrofolate reductase and an endothelial nitric oxide synthase polymorphism with recurrent pregnancy loss. Am. J. Reprod Immunol. 2004 Jul.; 52(1):60-6.18.

14. Miller C.H., De Staercke C., Benson J., Hooper W.C., Dilley A., Evatt B.L., Benito C., Patterson-Bamett A., Eller D., Philipp C.S. Elevated factor VII as a risk factor for recurrent fetal loss. Relationship to factor VII gene polymorphisms. Thromb Haemost. 2005, Jun.; 93(6):1089-94.

15. Mtiraoui N., Zammiti W., Ghazouani L., Braham N.J., Saidi S., Finan R.R., Almawi W.Y., Mahjoub T. Methylenetetrahydrofolate reductase C677T and A1298C polymorphism and changes in homocysteine concentrations in women with idiopathic recurrent pregnancy losses. Reproduction. 2006, Feb.; 131(2):395-401.

16. Orlando M., Leri О., Macioce G., Mattia G., Ferri G.M. Factor VII in subjects at risk for thromboembolism: activation or increased synthesis? Haemostasis. 1987; 17(6):340-3.

17. Pauer H.U., Voigt-Tschirschwitz Т., Hinney В., Burfeind P., Wolf C., Emons G., Neesen J. Analyzes of three common thrombophilic gene mutations in German women with recurrent abortions. Acta Obstet Gynecol Scand. 2003, Oct.; 82(10):942-7.

18. Raziel A., Komberg Y., Friedler S., Schachter M., Sela B.A., Ron-El R. Hypercoagulable thrombophilic defects and hyperhomocysteinemia in patients with recurrent pregnancy loss. Am J. Reprod Immunol. 2001, Feb.; 45(2):65-71.

19. Schwahn B., Rozen R. Polymorphisms in the methylenetetrahydrofolate reductase gene: clinical consequences. Am J. Pharmacogenomics. 2001; 1(3):189-201.

20. Unfried G., Griesmacher A., Weismuller W., Nagele F., Huber J.C., Tempfer C.B. The C677T polymorphism of the methylenetetrahydrofolate reductase gene and idiopathic recurrent miscarriage. Obstet Gynecol. 2002, Apr.; 99(4):614-9.

21. Wang X.P., Lin Q.D., Ma Z.W., Zhao A.M. [C677T and A1298C mutation of the methylenetetrahydrofolate reductase gene in unexplained recurrent spontaneous abortion]. Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi. 2004, Apr.; 39(4):238-41.

22. Welch G.N., Loscaizo J. "Homocysteine and atherothrombosis." N Engi J. Med. 1998 Apr. 9; 338(15):1042-50.

23. Wu А.Н., Tsongalis G.J. Correlation of polymorphisms to coagulation and biochemical risk factors for cardiovascular diseases. Am J. Cardiol. 2001, Jun. 15; 87(12):1361-6.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетики и может быть использовано в медицине при определении риска развития привычного невынашивания беременности (ПН). Установлена взаимосвязь полиморфизма R353Q гена фактора свертывания крови VII с развитием ПН и показана возможность использования результатов анализа ДНК на наличие названного полиморфизма при оценке генетической предрасположенности к данному заболеванию. Предложен способ прогнозирования предрасположенности к развитию ПН, предусматривающий одновременное тестирование ДНК на наличие полиморфизма R353Q гена фактора VII свертывания крови и полиморфизма С677Т гена метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR), определение генотипа пациентки с учетом данных по двум исследуемым генам и составление заключения, где генотип RRTT квалифицируется как крайне неблагоприятный, генотипы RRCC, RRCC и RQTT - как неблагоприятные, генотипы RQCC и RQCT - как благоприятные прогностические признаки. 2 н.п. ф-лы, 7 ил., 3 табл.

1. Применение ДНК-диагностики на наличие полиморфизма R353Q гена фактора VII свертывания крови для оценки предрасположенности к развитию привычного невынашивания беременности.2. Способ оценки предрасположенности к развитию привычного невынашивания беременности, включающий ДНК-диагностику на наличие полиморфизма С677Т гена метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) и составление заключения на основании данных о выявленном генотипе, отличающийся тем, что ДНК одновременно исследуют на наличие полиморфизма R353Q гена фактора VII свертывания крови, генотип определяют с учетом данных по двум исследуемым генам, а для составления заключения используют таблицу 1.