СПОСОБ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ГАРДНЕРЕЛЛЕЗА У БОЛЬНЫХ С ИНФЕКЦИОННОЙ ПАТОЛОГИЕЙ МОЧЕПОЛОВОЙ СИСТЕМЫ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/48 C12Q1/04 C12Q1/00 

Изобретение относится к области медицины, в частности к микробиологии, акушерству и гинекологии, урологии, педиатрии, и может быть использовано при бактериологической диагностике гарднереллеза мочеполовой системы человека.

В последние годы, благодаря прогрессу медицинской микробиологии, стали известны новые инфекции, к которым относится гарднереллез. Возрастает клиническое значение «бактериального вагиноза», который можно рассматривать как частный случай гарднереллеза, где Gardnerella vaginalis является одним из наиболее существенных этиопатогенетических компонентов. Это в большей степени относится к беременным женщинам и может привести к развитию преждевременных родов, сальпингоофоритов, циститов, пиелонефритов, послеродовых эндометритов, септицемии и др. На фоне общего снижения уровня неспецифических факторов защиты в человеческой популяции возрастает роль гарднерелл, как возбудителей заболеваний верхних отделов мочеполовых путей.

Известен способ диагностики гарднереллеза нижних отделов мочеполовой системы по результатам клинико-лабораторных сопоставлений (анамнестическим данным, характеру, запаху и кислотности влагалищных выделений, определению жирных кислот, наличию «ключевых» клеток и соотношению различных морфологических типов бактерий при микроскопии) (Глазкова Л.А. Бактериальный вагиноз. /Л.А.Глазкова, Н.М.Герасимова. // Методическое пособие. - Издание 2-е. - Екатеринбург, 1996. - С.23).

Недостатком данного метода является то, что клиническая диагностика гарднереллеза затруднена из-за слабой выраженности или отсутствия типичных симптомов заболевания. Распознавание болезни часто осложняется наслоением признаков в результате смешанных форм инфекции. Данным способом не может быть диагностирована патология верхних отделов мочевыводящих путей.

Наиболее близким аналогом является развернутое бактериологическое исследование клинического материала, которое в настоящее время проводится только в сложных диагностических случаях (Колуканов И.Е., Чайка Н.А. Гарднереллез. Научный обзор. - СПб, 1994. - С.14-18). Этот метод включает следующие этапы: посев клинического материала на питательный агар (Vaginalis - агар, КДС-1 и др.), определение характера роста колоний на средах, изучение морфологии и ферментативных свойств возбудителя на продукцию кислот из сахаров, газообразование, OPNG-тест, реакции с красителями, наличие ферментов, гидролиз жиров, декарбоксилирование аминокислот, ростовые особенности на селективных питательных средах (в том числе при различных уровнях рН-среды и температурном режиме). Всего исследуют 49 признаков. Развернутый метод культуральной диагностики не нашел широкого практического применения в силу недостатков: сложности исполнения, значительного количества высокопитательных сред, как правило импортного производства, большого набора биохимических и ферментативных тестов, длительных (от 7 до 14 суток) сроков производства анализа.

Техническим результатом изобретения является повышение степени достоверности лабораторной диагностики гарднереллеза при уменьшении материальных затрат на ее проведение и сокращение сроков исследований.

Технический результат достигается путем изучения «ведущих» биологических свойств возбудителя, выросшего на питательных средах: каталазообразование, кислотоустойчивость, наличие х-фактора и характер роста в полужидкой питательной среде СКС-199 (Добрынин В.М. Микробиологическая диагностика гнойно-септических инфекций. Рекомендации для врачей. / В.М.Добрынин, Н.М.Каргальцева, И.А.Добрынина. - СПб, 1996. - С.38), что позволит дифференцировать Gardnerella spp. от наиболее близких представителей бактериальной микрофлоры по характеру роста на питательных средах для первичного выделения: КДС-1 или 5% кровяном агаре - коринебактерий, гемофильной палочки, лактобактерий и установить диагноз.

Сущность изобретения заключается в следующем. Основные признаки гарднерелл, выделенных из клинического материала от больных с использованием классических питательных сред, стандартного режима инкубации, после изучения тинкториальных и морфологических особенностей исследуемого микроорганизма на среде КДС-1 или 5% кровяном агаре, определяют с помощью дифференцирующих тестов: способности к каталазообразованию, потребности в гемине (наличие х-фактора), кислотоустойчивости и характеру роста культуры в полужидкой среде СКС-199.

Gardnerella vaginalis в биологической субстанции определяют при наличии на поверхности питательного агара КДС-1 мелких бесцветных колоний с зоной β-гемолиза, каталазоотрицательных, не обладающих х-фактором и кислотоустойчивостью, растущих в полужидкой среде СКС-199 в виде мелких грамвариабельных палочек с суданофильными включениями и не образующих цепочки.

Способ осуществляется следующим образом.

Исследуемый материал (моча, вагинальный секрет, мазки из уретры, пунктат заднего свода влагалища, содержимое цервикального канала, полости матки и др.) засевают на чашки со стандартной средой КДС-1. При необходимости используют 5% кровяной агар. В случае роста на питательных средах через 48 часов инкубации при температуре 35-37°С и повышенном содержании СО₂ мелких (диаметром 0,5-2,5 мкм) бесцветных колоний с гладкой поверхностью, окруженных зоной полного гемолиза, проводят их микроскопию. При обнаружении в мазке тонких грамвариабельных палочек выросшие колонии исследуют на способность к каталазообразованию и исследуют характер роста и морфологические особенности культуры при микроскопии из полужидкого агара СКС-199 с уровнем рН - 7,2, кислотоустойчивость (рост в СКС-199 с рН - 3,5) и х-фактор (потребность в гемине). Через 24 часа инкубации при температуре 35-37 градусов учитывают поставленные тесты и оценивают микроскопию колоний из полужидкой среды СКС-199.

При обнаружении из нативного материала на среде КДС-1 (5% кровяном агаре) мелких полупрозрачных каталазоотрицательных колоний диаметром 0,5-2,5 мкм с зоной полного гемолиза, в мазках - полиморфных палочек или коккобактерий с суданофильными включениями, не обладающих х-фактором и кислотоустойчивостью, а на среде СКС-199 с рН - 7,2 - неветвящихся грамвариабельных палочек микроорганизм относят к роду Gardnerella.

Выявленные основные признаки Gardnerella vaginalis: отсутствие каталазообразования, х-фактора, низкая кислотоустойчивость, не способность к цепочечному росту в полужидком агаре СКС-199 служат дифференциально-диагностическими критериями при определении возбудителя заболевания от близких представителей условно-патогенной и нормофлоры (коринобактерий, гемофильной палочки, лактобактерий). Так коринобактерии (Corynebacterium spp.) - каталазоположительные, характеризуются слабым ростом в среде СКС-199, образуя при этом крошащуюся пленку. Гемофильная палочка (Haemophilus influenzae) имеет фактор каталазообразования, плохо растет на средах СКС-199 и обладает высокой потребностью в гемине (вокруг диска с сапонином наблюдается усиленный рост культуры). Лактобактерии (Lactobacillus spp.) кислотоустойчивы (растут на среде СКС-199 с низким уровнем рН - 3,5), а при микроскопии из полужидкой среды СКС-199 имеют форму грамвариабельных палочек, расположенных цепочками (см. чертеж).

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Больная М., 27 лет (ист. бол. №1459). Клинический диагноз: бактериальный вагиноз, гарднереллез. Жалобы: на обильные выделения из влагалища с неприятным запахом, усиливающимся после полового акта, жжение, дискомфорт во влагалище и в области наружных половых органов. Объективно: состояние удовлетворительное, температура тела - 36,7 градусов. Мочеполовая система сформирована по женскому типу. При вагинальном исследовании на зеркалах - обильное количество водянистых выделений с неприятным «рыбным» запахом, на сводах влагалища ярко выраженная адгезия стенок. Шейка матки обычной формы без гиперемии. При мануальном обследовании матка и придатки не увеличены, безболезненны. Лабораторные исследования: общий анализ крови - без патологии, общий анализ мочи - без патологии. Мазки на гонококки и трихомонады - отрицательные. При микроскопии отделяемого из шейка матки: эпителий пластинчатый, лейкоцитов - 20-30 клеток в поле зрения, из уретры: лейкоцитов - 10-15, преобладание палочковой флоры, большое количество «ключевых» клеток. Проба влагалищных выделений с раствором КОН- резко положительная, уровень кислотности (рН) - 8,0. При бактериологическом посеве вагинальных выделений через 48 часов инкубации при 37 градусах на поверхности среды КДС-1 выросло большое количество (сплошной рост) мелких однотипных колоний диаметром 1 мкм с зоной полного гемолиза эритроцитов вокруг колоний. При микроскопии с чашки первичного посева обнаружены грамвариабельные мелкие палочки с суданофильными включениями. Проба с 3% раствором перекиси водорода - отрицательная. При пересеве колоний в диагностические среды через 24 часа инкубации обнаружен рост культуры в среде СКС-199 с уровнем рН 7,2, при микроскопии из полужидкого агара - коротких не образующих цепочки палочек. В питательной среде СКС-199 с рН 3,5 рост отсутствовал. На кровяном агаре с диском сапонина выявлен однородный (сплошным газоном) рост мелких прозрачных колоний.

Таким образом, у больной М., имеющей клинические признаки «бактериального вагиноза» в форме гарднереллеза, при бактериологическом исследовании вагинальных выделений были обнаружены мелкие грамвариабельные палочки, выросшие колонии из которых на агаре КДС-1 давали гемолиз по β-типу, каталазоотрицательные, не обладающие кислотоустойчивостью и х-фактором, не образующие цепочки в полужидком агаре, относящиеся к роду Gardnerella. При бактериологическом исследовании полового партнера, из содержимого уретры у него были выделены однотипные микроорганизмы.

Пример 2. Больная П., 10 лет (ист. бол. №231). Клинический диагноз: хронический цистит, сахарный диабет. Жалобы: на подъем температуры тела до 37,1 градуса в течение 3 дней, боли в животе, частые болезненные мочеиспускания. Хронический цистит с 3 лет. Объективно: состояние удовлетворительное, температура тела - 37,2 градуса. Кожные покровы бледные, отеков нет, пульс - 90 ударов в минуту. Тоны сердца ясные, ритмичные. АД - 110/60 мм Hg. Мочеполовая система сформирована по женскому типу. Пальпация надлобковой области болезненная. Синдром сотрясения поясничной области отрицательный. Мочеиспускания до 10 раз в сутки, болезненные. Моча мутная. В общем анализе крови: патологии не выявлено. В общем анализе мочи: удельный вес - 1006, моча мутная, реакция кислая, белка нет, лейкоцитов - 20 в поле зрения, эритроциты - 4-3, бактерии ++++, слизь ++++, ураты +. При бактериологическом исследовании мочи через 36 часов инкубации на кровяном агаре выросли мелкие прозрачные колонии диаметром 2 мкм. Общее микробное число - 1000000 Кое/мл. В мазках - грамположительные палочки с суданофильными включениями. Каталазоотрицательные. После пересева культуры на среду СКС-199 с рН - 7,2 через 24 часа инкубации обнаружен рост микроорганизмов. На среде СКС-199 с рН - 3,5 рост отсутствовал. Тест с сапонином отрицательный. При микроскопии из жидких сред в мазках выявлены грамвариабельные полиморфные палочки без ветвлений.

Таким образом, у ребенка, имеющего клинические признаки обострения хронического цистита, при бактериологическом исследовании из мочи были выделены грамположительные палочки, дающие рост на кровяном агаре в виде мелких колоний диаметром 2 мкм, каталазоотрицательные, не кислотоустойчивые, не имеющие х-фактора, при микроскопии из жидких сред не дающие ветвлений, что позволяет их отнести к роду Gardnerella.

Пример 3. Больная К., 31 год (ист.бол. №455). Клинический диагноз: беременность 22 недели, абсцесс бартолиниевой железы справа. Жалобы на подъем температуры тела до 38 градусов в течение 2 суток, общую слабость, потерю аппетита, боли внизу живота и в области наружных половых органов, больше справа, болезненное мочеиспускание. Объективно: состояние средней тяжести, температура тела - 38,1 градуса. Кожные покровы бледные, отеков нет. Пульс - 105 ударов в минуту. Тоны сердца ритмичные. АД - 110/70 мм Hg. Синдром сотрясения поясничной области отрицательный. В области наружной половой губы справа пальпируется плотное болезненное образование размерами 2×3 см. Лабораторные данные: в общем анализе крови эритроцитов - 3,2×10¹²/л, гемоглобин - 110 г/л, лейкоцитов - 12,8×10⁹/л. Из них эозинофилов - 1%, сегментоядерных форм - 60%, палочкоядерных нейтрофилов - 3%, лимфоцитов - 27%, моноцитов - 4%, СОЭ - 65 мм/ч. В общем анализе мочи: удельный вес 10015, моча прозрачная, реакция кислая, белок - отрицательный, эпителий 0-2 клеток в поле зрения, лейкоцитов 3-5 клеток, эритроцитов 1-2, оксалаты +. Абсцесс вскрыт под местной анестезией. Его содержимое доставлено для микробиологического исследования. После первичного посева гнойного содержимого из абсцесса бартолиниевой железы через 48 часов инкубации на кровяном агаре выросли сплошным газоном мелкие бесцветные колонии диаметром 0,5 мкм с зоной гемолиза. Проба с каталазой отрицательная. В мазках при микроскопии обнаружены мелкие грамвариабельные палочки. При посеве на среды СКС-199 с рН 7,2, СКС-199 с рН 3,5, кровяной агар с диском сапонина через 24 часа инкубации при температуре 37 градусов обнаружен рост культуры микроорганизмов в полужидком агаре на среде СКС-199 только с уровнем рН - 7,2, равномерный газон на кровяном агаре с сапонином. При микроскопии с полужидких сред СКС-199 определены мелкие не образующие цепочки грамотрицательные палочки.

Таким образом, у больной, имеющей клинические признаки абсцесса бартолиниевой железы, при посеве бактериологического материала выросли грамвариабельные палочки, каталазоотрицательные, не кислотоустойчивые, не имеющие х-фактора. При микроскопии колоний со среды СКС-199 с рН 7,2 - тонкие короткие не образующие цепочек грамотрицательные палочки, что позволяет их отнести к роду Gardnerella.

Данным методом исследованы эталонные штаммы Gardnerella vaginalis НИИ им. Тарасовича, более 250 клинических штаммов гарднерелл, выделенных от больных с «бактериальным вагинозом» и подтвержденных другими методами (клиническим, иммунологическим, развернутым микробиологическим). Контрольную группу составили 400 больных с различной патологией и практически здоровых пациентов, из клинического материала у которых выделялись схожие по тинкториальным свойствам представители условно-патогенной и нормофлоры - Corynebacterium spp., Haemophilus spp., Lactobacillus spp. Родовая принадлежность у этих микроорганизмов также была подтверждена методом развернутой культуральной диагностики.

Предложенный способ диагностики гарднереллеза при неспецифических инфекциях мочеполового тракта информативен, достоверен, укорачивает сроки проведения анализа (до 3-4 суток), проводится на стандартных питательных средах, не требует для производства дорогостоящего оборудования, удобен при постановке, не сложен в методическом плане. Поэтому без значительных материальных затрат и в короткие сроки может быть внедрен в работу любой бактериологической лаборатории. Метод может быть рекомендован для более точной этиологической диагностики заболеваний мочеполовой системы микробно-воспалительного характера, которые составляют одну из самых актуальных проблем медицины.

Изобретение относится к области медицины, в частности к микробиологии, акушерству и гинекологии, урологии, педиатрии. Способ характеризуется тем, что определяют биологические признаки гарднерелл, выделенных из клинического материала от больных с использованием классических питательных сред, стандартного режима инкубации. После установления тинкториальных и морфологических особенностей исследуемого микроорганизма определяют его способность к каталазообразованию, потребность в гемине (наличие х-фактора), кислотоустойчивость и характер роста культуры в полужидкой среде СКС-199. По результатам определения дифференцируют Gardnerella spp. от патологических близких представителей микрофлоры мочеполовой системы человека и устанавливают диагноз гарднереллез. Изобретение обеспечивает повышение степени достоверности лабораторной диагностики гарднереллеза при сокращении сроков диагностики. 1 ил.

Способ лабораторной диагностики гарднереллеза у больных с инфекционной патологией мочеполовой системы путем изучения биологических свойств возбудителя при посеве клинического материала на питательные среды, стандартного режима инкубации, установления тинкториальных и морфологических свойств исследуемого штамма, отличающийся тем, что в качестве идентифицирующих признаков используют тесты на каталазообразование, кислотоустойчивость, наличие х-фактора и характер роста в полужидкой питательной среде СКС-199, по результатам которых дифференцируют Gardnerella spp. от наиболее биологически близких представителей микрофлоры мочеполовой системы человека Corynebacterium spp., Haemophilus spp., Lactobacillus spp.и установливают диагноз гарднереллез.