Питательная среда для выделения и культивирования Lactobacillus iners и других представителей вагинальной микробиоты Российский патент 2023 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для выделения и культивирования Lactobacillus iners и других представителей вагинальной микробиоты.

Слизистая оболочка влагалища человека колонизирована большим количеством микроорганизмов. У здоровых женщин репродуктивного возраста в 1 мл вагинального отделяемого концентрация микроорганизмов может составлять от 10⁷ до 10⁹ микробных клеток. При этом у большинства женщин с нормоценозом доминируют лактобациллы. Они представляют собой микроаэрофильные или анаэробные бактерии, продуцирующие молочную кислоту и перекись водорода, благодаря чему во влагалище поддерживается кислое значение рН (от 3,5 до 4,5). Это важно для поддержания нормоценоза и обеспечения условий для выживания сперматозоидов. Кроме того, лактобациллы выделяют множество веществ, обладающих противомикробным действием, - лизоцим, лактоцидин и другие. Указанные свойства позволяют в совокупности поддерживать устойчивый состав микробиоты, не допуская избыточного роста нежелательной флоры [Journal of Lower Genital Tract Disease. 2022. Vol. 26, no 1. P. 73-78.]

В микробиоте влагалища наиболее часто встречаются четыре вида лактобацилл: Lactobacillus iners, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri и Lactobacillus jensenii, среди которых L. iners занимает особое место. Этот микроорганизм является труднокультивируемым, не растет на питательных средах, традиционно используемых для выделения лактобацилл (MRS агаре), и очень изменчив по морфологическим и тинкториальным свойствам. В отличие от других лактобацилл L. iners часто встречается при бактериальном вагинозе, что может считаться косвенным доказательством связи между присутствием этого микроорганизма и бактериальным вагинозом. Различные исследования дают противоречивую информацию о связи L. iners с преждевременными родами, бесплодием или повышенным риском заражения инфекциями, передающимися половым путем. Тем не менее у исследователей все еще недостаточно данных, чтобы доказать причинно-следственные связи между данным микроорганизмом, инфекционными заболеваниями репродуктивного тракта и неблагоприятными акушерскими исходами [Frontiers in cellular and infection microbiology. 2021. Vol. 11. doi: https://doi.org/10.3389/fcimb.2021.792787]. Неоднозначная информация о роли L. iners, которую получают исследователи, обусловлена отсутствием специальных питательных сред, предназначенных для выделения и культивирования этого микроорганизма. Культуральный метод с посевом на питательные среды остается наиболее доступным для повсеместного проведения исследования в микробиологических лабораториях, позволяет получить чистую культуру микроорганизма для проведения дальнейшего фенотипического и генотипического изучения, определения его роли в сохранении нормоценоза и развитии инфекций половых путей, а также для хранения в государственных коллекциях микроорганизмов.

Наряду с лактобациллами во влагалище человека в норме присутствуют и другие бактерии, которые не приносят вреда до тех пор, пока их численность небольшая. Колебания уровня эстрогенов, беременность, прием оральных контрацептивов, стрессы, тяжелые заболевания и другие факторы вызывают нарушение колонизационной резистентности и избыточное размножение таких условно-патогенных микроорганизмов, как Gardnerella vaginalis, Candida albicans, Bacteroides spp., Prevotella spp., Mobiluncus spp., Veillonella spp., Megasphera spp., Leptotrichia spp., Atopobium vaginae и др. Помимо этого, нарушение гигиены аногенитальной области, а также атрофические процессы, состояния после химио- и лучевой терапии вызывают заселение микроорганизмов из прямой кишки во влагалище, например попадание Escherichia coli. Таким образом нарушается естественный микробный баланс влагалища и создаются условия для развития оппортунистических инфекций, вследствие хронизации которых возникают репродуктивные проблемы вплоть до бесплодия.

Бактериологическое исследование отделяемого влагалища показывает состав микробиоты влагалища, в том числе помогает выявить возбудителей бактериального вагиноза, что важно для подбора оптимального лечения.

В рутинной лабораторной практике для бактериологического исследования микробиоты влагалища используют набор питательных сред для аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, который чаще состоит из MRS агара и кровяного агара [Акушерство и гинекология: новости, мнения, обучение. 2020. Т. 8, № 1. С. 69-76. doi: 10.24411/2303-9698-2020-11009.].

Облигатные анаэробы исследуют в основном молекулярно-генетическими методами.

MRS агар - это питательная среда для культивирования и выделения лактобацилл, в его состав входят, на 1 л среды:

Ферментативный гидролизат казеина 10,0 г Мясной экстракт 10,0 г Дрожжевой экстракт 4,0 г Аммония цитрат 2,0 г Натрия ацетат 5,0 г Магния сульфат 0,2 г Марганца сульфат 0,05 г Калия гидрофосфат 2,0 г Глюкоза 20,0 г Полисорбат 80 1,08 г Агар от 12,0 до 18,0 г [4]

Недостатком данной питательной среды является то, что она не поддерживает рост L. iners. На данной питательной среде не растут условно-патогенные микроорганизмы (стафилококки, кишечная палочка, за исключением C. albicans и Enterococcus faecalis).

Наиболее близкой к предлагаемой питательной среде является кровяной агар, поддерживающий рост большого количества видов микроорганизмов, включая L. iners, и обладающий дифференциальными признаками, основанными на различной гемолитической способности микроорганизмов (α-гемолиз, β-гемолиз или отсутствие гемолиза). Кровяной агар готовят на основе Колумбийского агара с добавлением 5 % дефибринированной крови животного происхождения - (чаще всего бараньей или лошадиной). В состав Колумбийского агара входят, на 1 л среды:

Белковая основа 20,0-23,0 г Натрия хлорид 5,0 г Крахмал 1,0 г Агар 10-15 г

В качестве белковой основы могут быть использованы специальные пептоны или смеси ферментативного гидролизата казеина, мясного пептона, дрожжевого экстракта, панкреатического гидролизата сердца в различных соотношениях [Справочник заведующего КДЛ. - 2021. №7. С. 32-40].

Кровяной агар обладает существенными недостатками. Качество кровяного агара напрямую зависит от качества и типа используемой крови. Кровь является дорогостоящим продуктом и обладает малым сроком хранения. На кровяном агаре L. iners через 72 ч инкубирования формирует очень мелкие, малозаметные невооруженным взглядом колонии, которые могут быть проигнорированы во время исследования. Кроме того, искомый микроорганизм на кровяном агаре по морфологическим свойствам неотличим от Gardnerella vaginalis, что приводит к ошибкам при учете результатов бактериологических посевов исследуемого материала. В связи с тем, что разные виды лактобацилл могут проявлять на кровяном агаре различные типы гемолиза, этот признак не является дифференцирующим для представителей рода Lactobacillus.

Техническим результатом настоящего изобретения является создание питательной среды, которая позволяет выделять, культивировать Lactobacillus iners и других представителей микробиоты влагалища без использования в составе среды нативной крови животного происхождения, при этом предлагаемая питательная среда обладает дифференцирующими свойствами (определяемыми по изменению цвета питательной среды и типичной морфологии колоний различных видов микроорганизмов), более высокой чувствительностью (определяемой как минимальная концентрация засеянных микроорганизмов, позволяющая обнаружить их рост) и увеличенной скоростью роста микроорганизмов (определяемой как время появления признаков роста микроорганизмов).

Указанный технический результат достигается тем, что предлагается питательная среда для выделения и культивирования Lactobacillus iners и других представителей вагинальной микробиоты, содержащая ферментативный гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, агар, и дополнительно содержащая L-лизина гидрохлорид, стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, полисорбат 80, магния сульфат, мальтодекстрин с декстрозным эквивалентом 18-20, натрия пируват, бромкрезоловый пурпуровый, L-цистеина гидрохлорид, L-глутамин, никотинамидадениндинуклеотид при следующем количественном соотношении компонентов г/л:

Ферментативный гидролизат казеина 8,0-10 г Дрожжевой экстракт 9,0-11,0 г L-лизина гидрохлорид 9,0-11,0 г Стимулятор роста гемофильных микроорганизмов 4,5-5,5 г Мальтодекстрин с декстрозным эквивалентом 18-20 4,5-5,5 г Натрия пируват 0,8-1,2 г Полисорбат 80 0,8-1,2 г L-цистеина гидрохлорид 400-600 мг L-глутамин 160-240 мг Магния сульфат 80-120 мг Бромкрезоловый пурпуровый 25-75 мг Никотинамидадениндинуклеотид 1,6-2,4 мг Агар 10,0-14,0 г Вода дистиллированная 1 л

Для получения готовой питательной среды необходимо приготовить два раствора компонентов (раствор компонентов 1 и раствор компонентов 2) в заданном соотношении, простерилизовать их раздельно и объединить. Раствор компонентов 1 готовят, растворяя в дистиллированной воде ферментативный гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, L-лизина гидрохлорид, стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, мальтодекстрин с декстрозным эквивалентом 18-20, натрия пируват, полисорбат 80, магния сульфат, бромкрезоловый пурпуровый и агар, после чего раствор стерилизуют в автоклаве при температуре (121±1) °С в течение 15 мин. Раствор компонентов 2 готовят, последовательно растворяя в дистиллированной воде L-цистеина гидрохлорид, L-глутамин и никотинамидадениндинуклеотид, после чего раствор стерилизуют методом мембранной фильтрации через стерильный мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм или 0,45 мкм. Затем в стерильный охлажденный до температуры (55±10) °С раствор компонентов 1 добавляют раствор компонентов 2, перемешивают взбалтыванием и разливают в чашки Петри.

Дифференцирующие свойства среды обеспечиваются наличием в питательной среде в качестве источника углеводов мальтодекстрина с декстрозным эквивалентом 18-20 и кислотно-основного индикатора бромкрезолового пурпурового. Лактобациллы и G. vaginalis утилизируют мальтодекстрин с образованием кислоты, что сдвигает значение pH питательной среды с 6,6-7,0 вплоть до 3,0, обеспечивая изменение цвета среды. Поэтому в зоне роста представителей рода Lactobacillus, включая L. iners, и G. vaginalis наблюдается изменение цвета среды с пурпурно-красного на желтый, в то время как в зоне роста C. albicans, E. coli и S. aureus изменения цвета не происходит или цвет среды изменяется с пурпурно-красного на синий.

Увеличение скорости роста микроорганизмов и повышение чувствительности питательной среды по сравнению с кровяным агаром обеспечиваются наличием в питательной среде L-лизина гидрохлорида, стимулятора роста гемофильных микроорганизмов, полисорбата 80, магния сульфата и повышенным содержанием дрожжевого экстракта, о чем свидетельствуют экспериментальные данные.

L-Цистеина гидрохлорид и L-глутамин в заданных концентрациях являются стимуляторами роста для L. iners. Несмотря на то, что оба этих компонента термостабильны, их стимулирующее воздействие на рост L. iners при культивировании на плотных питательных средах возможно только при условии, если они не подвергаются автоклавированию. Никотинамидадениндинуклеотид используется в качестве фактора роста для встречающегося в микробиоте влагалища Haemophilus influenzae. Данный компонент термолабилен и разрушается при стерилизации в автоклаве. Этим обусловлена раздельная стерилизация компонентов питательной среды.

Компонентный состав и возможность применения заявляемой среды для выращивания L. iners и других представителей вагинальной микробиоты (L. jensenii, L. gasseri, L. crispatus, G. vaginalis и др.) подтверждены в ходе проведенных испытаний с использованием клинических образцов мазков на бактериальный вагиноз и неизвестны из доступных источников информации.

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами:

Пример 1. Приготовление раствора компонентов 1. В 992 мл дистиллированной воды растворяют 8,0 г ферментативного гидролизата казеина, 9,0 г дрожжевого экстракта, 9,0 г L-лизина гидрохлорида, 4,5 г стимулятора роста гемофильных микроорганизмов, 4,5 г мальтодекстрина с декстрозным эквивалентом 18-20, 0,8 г натрия пирувата, 0,8 г полисорбата 80, 80 мг магния сульфата, 25 мг бромкрезолового пурпурового, 10,0 г агара. Раствор компонентов 1 стерилизуют в автоклаве при температуре (121±1) ±С в течение 15 мин и охлаждают до температуры (55±10) °С.

Приготовление раствора компонентов 2. В 20 мл дистиллированной воды последовательно растворяют 1,0 г L-цистеина гидрохлорида, 0,4 г L-глутамина и 4 мг никотинамидадениндинуклеотида. Раствор компонентов 2 стерилизуют методом мембранной фильтрации через стерильный мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм или 0,45 мкм.

Приготовление питательной среды. В стерильный охлажденный до температуры (55±10) °С раствор компонентов 1 добавляют 8 мл раствора компонентов 2, перемешивают взбалтыванием и разливают в чашки Петри.

Оценку специфической активности питательной среды (скорость роста микроорганизмов, дифференцирующие свойства и чувствительность питательной среды) осуществляют путем посева тест-штаммов Lactobacillus iners DSM 13335, Lactobacillus jensenii ATCC 25258, Lactobacillus gasseri ATCC 33323, Lactobacillus crispatus ATCC 33820, Gardnerella vaginalis DSM 14018, Escherichia coli ATCC 25922, Haemophilus influenzae ATCC 49247 и Candida albicans ATCC 60193. В качестве среды сравнения (прототип) используют кровяной агар, приготовленный на основе Колумбийского агара с добавлением 5 % крови бараньей дефибринированной.

Исходные микробные взвеси тест-штаммов готовят в 0,9% растворе хлорида натрия и доводят концентрацию до 10 единиц по стандартному образцу мутности ОСО 42-25-59-85 П. Из исходных взвесей готовят десятикратные разведения путем последовательного переноса 0,5 мл взвеси культуры в 4,5 мл 0,9% раствора хлористого натрия до разведения 10^-5. Проводят посев по 0,1 мл взвеси каждого из тест-штаммов из разведения 10^-5 на три чашки Петри с предлагаемой средой и на три чашки Петри со средой прототипом. Учет результатов проводят через 24 ч и 48 ч инкубации посевов при температуре (37±1) °С в микроаэрофильных условиях в атмосфере 5 % СО₂.

Результаты оценки специфической активности предлагаемой среды и среды прототипа представлены в таблице.

Пример 2. Приготовление раствора компонентов 1. В 990 мл дистиллированной воды растворяют 9,0 г ферментативного гидролизата казеина, 10,0 г дрожжевого экстракта, 10,0 г L-лизина гидрохлорида, 5,0 г стимулятора роста гемофильных микроорганизмов, 5,0 г мальтодекстрина с декстрозным эквивалентом 18-20, 1,0 г натрия пирувата, 1,0 г полисорбата 80, 100 мг магния сульфата, 50 мг бромкрезолового пурпурового, 12,0 г агара. Раствор компонентов 1 стерилизуют в автоклаве при температуре (121±1) °С в течение 15 мин и охлаждают до температуры (55±10) °С.

Приготовление раствора компонентов 2. В 20 мл дистиллированной воды последовательно растворяют 1,0 г L-цистеина гидрохлорида, 0,4 г L-глутамина и 4 мг никотинамидадениндинуклеотида. Раствор компонентов 2 стерилизуют методом мембранной фильтрации через стерильный мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм или 0,45 мкм.

Приготовление питательной среды. В стерильный охлажденный до температуры (55±10) °С раствор компонентов 1 добавляют 10 мл раствора компонентов 2, перемешивают взбалтыванием и разливают в чашки Петри.

Оценка специфической активности питательной среды аналогична примеру 1.

Результаты оценки специфической активности предлагаемой среды и среды прототипа представлены в таблице.

Пример 3. Приготовление раствора компонентов 1. В 988 мл дистиллированной воды растворяют 10,0 г ферментативного гидролизата казеина, 11,0 г дрожжевого экстракта, 11,0 г L-лизина гидрохлорида, 5,5 г стимулятора роста гемофильных микроорганизмов, 5,5 г мальтодекстрина с декстрозным эквивалентом 18-20, 1,2 г натрия пирувата, 1,2 г полисорбата 80, 120 мг магния сульфата, 75 мг бромкрезолового пурпурового, 14,0 г агара. Раствор компонентов 1 стерилизуют в автоклаве при температуре (121±1) °С в течение 15 мин и охлаждают до температуры (55±10) °С.

Приготовление раствора компонентов 2. В 20 мл дистиллированной воды последовательно растворяют 1,0 г L-цистеина гидрохлорида, 0,4 г L-глутамина и 4 мг никотинамидадениндинуклеотида. Раствор компонентов 2 стерилизуют методом мембранной фильтрации через стерильный мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм или 0,45 мкм.

Приготовление питательной среды. В стерильный охлажденный до температуры (55±10) °С раствор компонентов 1 добавляют 12 мл раствора компонентов 2, перемешивают взбалтыванием и разливают в чашки Петри.

Оценка специфической активности питательной среды аналогична примеру 1.

Результаты оценки специфической активности предлагаемой среды и среды прототипа представлены в таблице.

Только при вышеперечисленном составе, данных концентрациях компонентов и последовательности действий при приготовлении питательной среды достигается указанный технический результат.

Таблица Характер роста тест-штаммов при посеве из разведения 10^-5 на предлагаемой питательной среде и среде-прототипе через 24 и 48 ч инкубирования при температуре (37±1) °C в атмосфере 5-10 % CO₂ Тест-штамм Предлагаемая питательная среда, приготовленная по примерам 1-3 Среда прототип (кровяной агар) 1 2 3 L. iners DSM 13335 24 ч - малозаметные колонии диаметром 0,2 мм.
48 ч - уплощенные круглые ровные блестящие колонии диаметром 0,6-0,8 мм, изменение цвета среды в зоне роста с пурпурно-красного на желтый. 24 ч - рост отсутствует.
48 ч - малозаметные колонии 0,2 мм. L. crispatus ATCC 33820 24 ч - малозаметные колонии диаметром 0,2 мм.
48 ч - уплощенные серовато-коричневые блестящие колонии в r-форме диаметром 1,5-2,0 мм, изменение цвета среды в зоне роста с пурпурно-красного на желтый. 48 ч - рост отсутствует. L. gasseri ATCC 33323 24 ч - уплощенные серовато-коричневые блестящие колонии в r-форме диаметром 1,0-1,4 мм, изменение цвета среды в зоне роста с пурпурно-красного на желтый. 24 ч - уплощенные серовато-коричневые блестящие колонии в r-форме диаметром 1,0-1,2 мм, β-гемолиз. L. jensenii ATCC 25258 24 ч - выпуклые ровные серовато-белые блестящие колонии диаметром 0,8-1,0 мм, изменение цвета среды в зоне роста с пурпурно-красного на желтый. 24 ч - выпуклые ровные серовато-белые блестящие колонии диаметром 0,8-1,0 мм, β-гемолиз. G. vaginalis ATCC 1408 24 ч - малозаметные колонии диаметром 0,2 мм.
48 ч - выпуклые круглые ровные блестящие колонии коричневато-желтого цвета диаметром 0,6-0,8 мм, изменение цвета среды в зоне роста с пурпурно-красного на желтый. 24 ч - рост отсутствует.
48 ч - малозаметные колонии диаметром 0,2 мм. C. albicans ATCC 60193 24 ч - плоские матовые темно-серые колонии в r-форме диаметром 1,6-1,8 мм, изменение цвета среды с пурпурно-красного на синий. 24 ч - выпуклые ровные серовато-белые блестящие колонии диаметром 1,2-1,4 мм. E. coli ATCC 25922 24 ч - выпуклые ровные колонии белого цвета диаметром 1,2-1,4 мм, изменение цвета среды с пурпурно-красного на синий. 24 ч - выпуклые ровные колонии белого цвета диаметром 1,2-1,4 мм. H. influenzae ATCC 49247 24 ч - выпуклые ровные колонии серовато-белого цвета диаметром 1,0-1,2 мм, изменение цвета среды отсутствует. 48 ч - рост отсутствует.

Таким образом, преимущества питательной среды заключаются в том, что она превосходит кровяной агар по чувствительности, скорости роста микроорганизмов, обладает дифференцирующими свойствами и не требует дополнительного внесен

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой питательную среду для выделения и культивирования при следующем количественном соотношении компонентов г/л: ферментативный гидролизат казеина 8,0-10 г, дрожжевой экстракт9 ,0-11,0 г, L-лизина гидрохлорид 9,0-11,0 г, стимулятор роста гемофильных микроорганизмов 4,5-5,5 г, мальтодекстрин с декстрозным эквивалентом 18-204,5-5,5 г, натрия пируват 0,8-1,2 г, полисорбат 800,8-1,2 г, L-цистеина гидрохлорид 400-600 мг, L-глутамин 160-240 мг, магния сульфат 80-120 мг, бромкрезоловый пурпуровый 25-75 мг, никотинамидадениндинуклеотид 1,6-2,4 мг, агар 10,0-14,0 г, вода дистиллированная 1 л. Изобретение превосходит кровяной агар по чувствительности, скорости роста микроорганизмов, обладает дифференцирующими свойствами и не требует дополнительного внесения крови. 1 табл., 3 пр.

Питательная среда для выделения и культивирования Lactobacillus iners и других представителей вагинальной микробиоты, содержащая ферментативный гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, агар, отличающаяся тем, что дополнительно содержит L-лизина гидрохлорид, стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, полисорбат 80, магния сульфат, мальтодекстрин с декстрозным эквивалентом 18-20, натрия пируват, бромкрезоловый пурпуровый, L-цистеина гидрохлорид, L-глутамин, никотинамидадениндинуклеотид при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:

Ферментативный гидролизат казеина 8,0-10 г Дрожжевой экстракт 9,0-11,0 г L-лизина гидрохлорид 9,0-11,0 г Стимулятор роста гемофильных микроорганизмов 4,5-5,5 г Мальтодекстрин с декстрозным эквивалентом 18-20 4,5-5,5 г Натрия пируват 0,8-1,2 г Полисорбат 80 0,8-1,2 г L-цистеина гидрохлорид 400-600 мг L-глутамин 160-240 мг Магния сульфат 80-120 мг Бромкрезоловый пурпуровый 25-75 мг Никотинамидадениндинуклеотид 1,6-2,4 мг Агар 10,0-14,0 г Вода дистиллированная 1 л