СПОСОБ ВИДОВОЙ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/48 C12Q1/04 C12Q1/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии и эпидемиологии, и может быть использовано при бактериологической диагностике и эпидемиологическом анализе внебольничных и нозокомиальных кишечных и гнойно-септических инфекций, вызванных условно-патогенными энтеробактериями.

На современном этапе роль условно-патогенных энтеробактерий, включающих 27 родов представителей семейства Enterobacteriaceae, возрастает не только как возбудителей острых кишечных заболеваний, но как ведущего фактора при гнойно-септических инфекциях, внутрибольничных вспышках, в большей степени в учреждениях родовспоможения (Л.П.Зуева, Р.Х. Яфаев. Эпидемиология: Учебник. - СПБ: ООО «Издательство ФОЛИАНТ», 2005. - С.562-640).

Известен способ родового и видового типирования условно-патогенных энтеробактерий, включающий трехэтапную схему исследований, где на первом этапе определяют продукцию сероводорода, уреазу, способность к разложению лактозы и глюкозы, на втором - наличие капсулы, пигмента, феномена роения, фенилаланиндезаминазы, характер роста на трехсахарном агаре, утилизацию 10% лактозы, глюкозы, образование индола, цитрата, подвижность, на третьем - разложение глютаминовой кислоты, арабинозы, сорбита, муката, маннита, мальтозы и наличие орнитиндекарбоксилазы (Методические рекомендации «Значение условно-патогеных энтеробактерий в патологии и системы их идентификации». - Казань, 1991. - 21 с.). При этом используют 22 дифференциально-диагностических теста.

Недостатком данного метода является отсутствие возможности дифференцировать некоторые роды и многие виды условно-патогенных энтеробактерий (Klebsiella sp, Enterobacter sp, Serratia sp, Proteus sp), а также значительное время на производство анализа (6-7 суток), связанное с большим количеством этапов исследования.

Близким аналогом является метод определения условно-патогенных энтеробактерий, описанный в руководстве «Bergey,s Manual of Sustematic Bacreiology» (John G., Holt, Noel R. Krieg, Peter H.A. Sneath, James T Stanley T. Williams Bergeys Manual of determinative bacterioloji Ninth Edition - Baltimor-Philadelphia-Hon Kong-London et al. - 1997. - V.1. - P.211-229) по микробиологической диагностике возбудителей, выделенных от больных с гнойно-септической патологией, и из внешней среды путем изучения их биологических признаков. Родовую и видовую идентификацию микро-организмов данным способом осуществляют после определения их семейственной принадлежности по 44 биологическим тестам, изучая тинкто-риальные, культуральные и биохимические свойства.

Его недостатком является большое количество идентифицирующих признаков, необходимых при исследовании.

Техническим результатом изобретения является повышение степени достоверности родовой и видовой дифференциальной диагностики условно-патогенных энтеробактерий и сокращение сроков диагностики.

Определение 13 ведущих (из более чем 40) биологических признаков условно-патогенных энтеробактерий (способность к образованию сероводорода, индола, цитрата, наличие фенилаланиндезаминазы, желатиназы, уреазы, утилизация лизина, сорбита, орнитина и аргинина, характер реакции с метиловым красным, наличие пигмента и подвижности) позволяет гарантировать достоверность и сокращение сроков диагностики.

Сущность изобретения заключается в следующем. Путем определения ведущих биологических свойств (способность к продукции сероводорода и индола, наличие фенилаланиндезаминазы, желатиназы, уреазы, образование цитрата, характер реакции с метиловым красным, наличие подвижности и пигмента, разложение сорбита, аргинина, лизина, орнитина) условно-патогенные энтеробактерии формируют в группы. Они представлены на чертеже и включают: энтеробактерии, образующие сероводород; энтеробактерии, не образующие сероводород и обладающие фенилаланиндезаминазой; энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие фенилаланиндезаминазу и обладающие желатиназой; энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие фенилаланиндезаминазу, желатиназу и уреазу; энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие желатиназу, уреазу и образующие цитрат; энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие желатиназу, уреазу, не образующие цитрат, положительные в реакции с метиловым красным; энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие желатиназу, уреазу, не образующие цитрат, отрицательные в реакции с метиловым красным. Дальнейшую видовую идентификацию проводят по оставшимся неучтенным признакам уже внутри каждой группы.

Способ осуществляется следующим образом.

У культуры-колонии микроорганизма, выросшей на среде первичного посева (обычно это 5% кровяной агар, агар Эндо, Плоскирева, Левина и др.) вместе с определением признаков семейства (при микроскопии грамотрицательные палочки, положительный тест с каталазой, окисление и ферментация глюкозы на среде Хью-Лейфсона) изучают особенности роста на комбинированном трехсахарном агаре Олькеницкого после инкубации в стандартном режиме. Питательный агар Олькеницкого одновременно служит средой накопления и средой по определению продукции сероводорода, что позволит ориентироваться в дальнейшем ходе исследований. В набор дифференцирующих тестов входят: определение фенилаланиндезаминазы, желатиназы, образование кислоты из сорбита, реакция с метиловым красным на среде Кларка, образование индола, определение подвижности, утилизация цитрата натрия на агаре Симонса, разложение лизина, орнитина, аргинина, уреазы, наличие и характер пигмента. Оценку проводят после 18-20 часовой инкубации при температуре 35-37°С. Наличие или отсутствие признаков включают представителя энтеробактерий в одну из групп: энтеробактерии, образующие сероводород; энтеробактерии, не образующие сероводород и обладающие фенилаланиндезаминазой; энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие фенилаланиндезаминазу и обладающие желатиназой; энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие фенилаланиндезаминазу, желатиназу, обладающие уреазой; энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие желатиназу, уреазу и образующие цитрат; энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие желатиназу, уреазу, не образующие цитрат, положительные в реакции с метиловым красным; энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие желатиназу, уреазу, не образующие цитрат, отрицательные в реакции с метиловым красным. Дальнейшую идентификацию проводят по оставшимся неучтенным признакам внутри каждой группы с помощью дифференцирующих таблиц (1-9).

Таблица 1Энтеробактерии, образующие сероводородВидДифференцирующие биохимические тестыфенил.желат.сорб.метил. крас.инд.подв.Сим.лиз.орн.арг.уреаз.Пигм.Proteus mirabilis++-+-+D-+-+ Proteus vulgaris++-+++----+ Proteus renneri+D-+ +----+ Erwinia chrysanthemi-++-++............- Erwinia ananas-++-.....................Желт.Erwinia caratovora-++-..................... Serratia entomophila-+-(-).................... Erwinia nigrifluens--+--+............+ Erwinia * quercina rhapontici psidii salicis tracheiphila--+--+............- Erwinia rubrifaciens--++-+............- Citrobacter freundii--++-++-(-)DD Edwardsiella tarda---+++-++-- Pragia fontium---+-+(+)---- Leminorella richardii----------- Примечание:«+» - положительный признак«-» - отрицательный признак«D» - вариабельный признак (10-20% положительных находок)«...» - не определен**внутривидовая идентификация Erwinia quercina, E. Rhapontici, E. Psidii, E. Salicis, E. Tracheiphila проводится по дополнительным биохимическим тестам и не входит в представленный набор дифференцирующих признаков ввиду чрезвычайно редкой встречаемости данного рода энтеробактерий в гнойно-септической патологии у человека, т.к. их представители в основном обитают у растений.

Таблица 2Энтеробактерии, не образующие сероводород, обладающие фенилаланиндезаминазойВидДифференцирующие биохимические тестыОрнит.Сорб.ИндМетил красн.Цитрат Симм.Подв.УреазаЛизинАрг.Желат.Пигм.Morganella morganii+-++-++--- Rhanella aquatilis-+-++----- Providensia rettgeri--+++++--- Providensia alcalifaciens--++++---- Providensia rustigianii--++-DD--- Providensia heimbachae---+-D---- Tatumella ptyseos---------- Pantoea agglomeransD--D++----Желтый

Таблица 3Энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие фенилаланиндезаминазу, обладающие желатиназойВидДифференцирующие биохимические тестыаргин.орнит.сорбитцитрат Симон.индолподв.метил. красн.уреазализинпигментEnterobacter nimipressuralis++++-+--- Serratia grimesii++++-++-+ Serratia liquefaciens-+++-++-+ Serratia marcescens-+++-+--4-Красн.Serratia odorifera (б.1)-+++D++-+ Serratia proteamaculans-+++-+D-4- Serratia odorifera (б.2)--++D++-+ Erwinia ananas--+...++...--Желт.Erwinia uredevora--+...++...--Желт.Serratia ficaria--++-+D-- Serratia rubideae---+-+--DКрасн.Xenorabdus luminescens---DD+---Желт.Xenorabdus nematophilus----D+---Желт.Erwinia amylovora......D...-+...-  Arsenophonus nasoniae............---......Корич.

Таблица 4Энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие фенилаланиндезаминазу и желатиназу, уреазоположительныеВидДифференцирующие биохимические тестылизинсорбитподвиж.метил. красн.цитрат СимонсаиндоларгининорнитинпигментEnterobacter gergoviae+++-+--+ Klebsiella oxytoca++--++-- Klebsiella planticola+-t--++--- Klebsiella pneumoniae++--+--- Serratia fonticola+++++--+ Budvicia aquatica--D+---- Enterobacter hormaechei--+D+-++ Leclercia(Escherichia) adecarboxylata--++-+--Желт.Xenorabdus luminescens--+-DD--Желт.Enterobacter cloacae-++-+-++ Enterobacter dissolvens-++-+--+ Citrobacter freundii-++++-D- Citrobacter diversus-+++++D+ Citrobacter amalonaticus-+++++++ Enterobacter asburiae-+-++--- 

Таблица 5Энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие желатиназу и уреазу, образующие цитрат, орнитинотрицательныеВидДифференцирующие биохимические тестыподвиж.сорбитметиловый красныйиндоллизинаргининпигментCitrobacter freundii+++--D Cedecea neteri+++--+ Erwinia persicinus++----Красн.Enterobacter amnigenus(61)+----- Pantoae agglomerans+-D---Желт.Pantoae dispersa+-D---Желт.Ervinia cacticida+----... Ervinia mallotivora+---...... Buttauxella agrestis+-+--- Xenorhabdus luminescens+--D--Желт.Klebsiella terrigena-+D-+- Ervinia stewartii-++---Желт.Klebsiella ozaenae-D+-D- Ewingella americanaD-+--- Serratia plymuthicaDD+---Красн.Cedecea lapagei+-...--+ 

Таблица 6Энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие желатиназу и уреазу, орнитинположительныеВидДифференцирующие биохимические тестыподвиж.лизинсорбитиндолметиловый красныйаргининпигментEnterobacter asburiae--+-+- Klebsiella terrigena-++-D- Escherichia blattae-+--+- Klebsiella mobilis+++--- Serratia fonticola+++-+- Kluyvera ascorbata++D++- Escherichia fergusonii++-++- Yokenella regensburgei++--+- Enterobacter amnigenus (6.2)+-+-DD Enterobacter cloacae+-+--+ Enterobacter intermedius+-+-+- Citrobacter freundtt+-+-+D Citrobacter amalonaticus+-++++ Citrobacter diversus+-+++D Enterobacter sakazakii+----+Желт.Enterobacter taylorae+----+ Enterobacter hormaechei+---D+ Enterobacter amnigenus (6.1)+----- Cedecea divisae+---+D Pantoae agglomerans+---D-Желт.Kluyvera cryocrescens+-D++- Erwinia mallotivora+ --...... 

Таблица 7Энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие желатиназу и уреазу, не образующие цитрат, положительные в реакции с метиловым красным, лизинположительныеВидДифференцирующие биохимические тестыподвижностьиндолсорбиторнитинаргининпигментKlebsiella terrigena--+-- Escherichia blattae---+- Escherichia coli (неак.)-++-- Escherichia coli+++D- Escherichia fergusonii++-+- Edwardsiella tarda (б.1)++-+- Kluyvera cryocrescens++D+- Edwardsiella hoshinae+--+- Escherichia vulneris+---DЖелт.Erwinia mallotivora+--...... Hafnia alvei+--+- 

Таблица 8Энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие желатиназу и уреазу, не образующие цитрат, положительные в реакции с метиловым красным, лизинотрицательныеВидДифференцирующие биохимические тестыподвижностьиндолсорбиторнитинаргининпигментCitrobacter amalonaticus++-++ Escherichia hermannii++-+-Желт.Kluyvera cryocrescens++D+-Желт.Escherichia vulneris+---D Erwinia mallotivora+--...... Enterobacter intermedius+-++- Erwinia stewartii--+--Желт.Klebsiella rhinoscleromatis--+-- Escherichia coli (неактивная.)-++-- Moellerella wisconsensis----- Leclercia adecarboxylata++---Желт.Budvicia aqvaticaD---- Serratia plymuthicaD-D--Красн.

Таблица 9Энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие желатиназу и уреазу, не образующие цитрат, отрицательные в реакции с метиловым краснымВидДифференцирующие биохимические тестылизинсорбитподвижностьорнитинагринининдолпигментKlebsiella terrigena++-+-- Obesumbacterium proteus+--+-- Hafhia alvei+-++-- Edwardsiella ictaluri+--D-- Xenorabdus luminescens--+--DЖелт.Xenorabdus nematophilus--+--DЖелт.Erwinia stewartii-+----Желт.Erwinia mallotivora...-+......- 

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1.

При посеве крови у больного Р. (ист. бол. №455) с деструктивной госпитальной пневмонией через 48 часов инкубации на поверхности агара из комбинированной двойной среды выросли колонии микроорганизмов и произошло помутнение бульона. После пересева культуры на чашку кровяного агара и 18-часовой инкубации в режиме 37°С обнаружили образование крупных серых слизистых колоний с зоной гемолиза диаметром 4 мм, склонных к сливному росту. При микроскопии - грамотрицательные палочки, окруженные капсулой. Проба с каталазой отрицательная. После пересева культуры на среду Олькеницкого произошло окисление глюкозы с образованием большого количества газа. Лактоза не разложилась, образование сероводорода не произошло. На среде Хью-Лейфсона - полное окисление и ферментация глюкозы. После постановки дифференцирующих тестов через 18 часов инкубации: отрицательный тест с фенилаланином, желатиной, положительный - с мочевиной. Культура неподвижная. Произошло разложение лизина, сорбита, цитрата с изменением цвета среды. Тесты на образование индола, проба с метиловым красным, аргинином и орнитином были отрицательными.

Таким образом, у больного Р. с деструктивной пневмонией из крови был выделен возбудитель из семейства энтеробактерий, не образующий сероводород, не обладающий фенилаланиндезаминазой и желатиназой, уреазоположительный, разлагающий лизин, сорбит и цитрат натрия, неподвижный, не образующий индол, не утилизирующий аргинин и орнитин, что позволяет его отнести к роду Klebsiella, виду К.pneumoniae (sub. pneumoniae)

Пример 2.

У больного М. (ист. бол. №569) с перитонитом после посева содержимого дренажной трубки из брюшной полости через 20 часов инкубации на поверхности агара Эндо обнаружен «вуалеобразный» рост микроорганизмов с гнилостным запахом, затянувший всю чашку с питательным агаром. При пересеве колоний на среду Олькеницкого прозошло образование сероводорода без разложения глюкозы и лактозы. Положительный O/F тест (на среде Хью-Лейфсона). Из дифференцирующих признаков: положительные тесты с фенилаланином, желатиной, метиловым красным, орнитином и мочевиной. Отрицательные - с сорбитом, индолом, цитратом, лизином, аргинином.

Таким образом, у больного М. с клиническим диагнозом «перитонит» из содержимого дренажа брюшной полости был выделен высокоподвижный представитель семейства энтеробактерий, образующий сероводород, имеющий фенилаланиндезаминазу, желатиназу, уреазу, орнитиндекарбоксилазу, положительный в реакции с метиловым красным, не утилизирующий аргинин, лизин и цитрат натрия, что позволило его отнести к роду Proteus, виду Р.mirabilis.

Используемый метод видовой дифференциальной диагностики энтеробактерий, указанный в заявке, проверен на штаммах Escherichia coli АТСС 29212, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, других контрольных штаммах НИИ им. Тарасевича и более чем на 800 культурах энтеробактерий, выделенных из клинического материала от больных с кишечными, гнойно-септическими инфекциями и с объектов внешней среды стационаров лечебно-профилактических учреждений.

Предложенный способ видовой дифференциальной диагностики условно-патогенных энтеробактерий информативен, так как позволяет отнести микроорганизм к одному из 27 родов и 85 видов семейства. Он достоверен, укорачивает сроки проведения анализа (2-3 дня вместо 4-5 дней при использовании прототипа), так как предполагает одновременную постановку и оценку всех идентифицирующих признаков. Относится к классическим бактериологическим методам исследования, не требует при постановке и идентификации дорогостоящего оборудования, удобен в работе, несложен в методическом плане. Поэтому без значительных материальных затрат и в короткие сроки может быть внедрен в работу любой бактериологической лаборатории.

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии и эпидемиологии. Сущность способа видовой микробиологической диагностики условно-патогенных энтеробактерий, выделенных от больных с гнойно-септической патологией и из внешней среды: после определения принадлежности к семейству у возбудителей изучают биологические признаки: способность к образованию сероводорода, индола, цитрата, наличие фенилаланиндезаминазы, желатиназы, уреазы, утилизацию лизина, сорбита, орнитина и аргинина, характер реакции с метиловым красным, наличие пигмента и подвижности. Исходя из результатов в тестах на способность к образованию сероводорода, цитрата, наличие фенилаланиндезаминазы, желатиназы, уреазы, характер реакции с метиловым красным представителя энтеробактерий относят к одной из групп. Дальнейшую видовую идентификацию внутри каждой группы проводят по оставшимся неучтенным признакам. Использование способа обеспечивает повышение степени достоверности видовой дифференциальной диагностики условно-патогенных энтеробактерий и сокращение сроков диагностики. 9 табл., 1 ил.

Способ видовой микробиологической диагностики условно-патогенных энтеробактерий, выделенных от больных с гнойно-септической патологией и из внешней среды путем изучения их биологических признаков, определяющих принадлежность к семейству с использованием питательных сред и режима культивирования, отличающийся тем, что после определения принадлежности к семейству у возбудителей изучают биологические признаки: способность к образованию сероводорода, индола, цитрата, наличие фенилаланиндезаминазы, желатиназы, уреазы, утилизацию лизина, сорбита, орнитина и аргинина, характер реакции с метиловым красным, наличие пигмента и подвижности, и при наличии или отсутствии признаков представителя энтеробактерий включают в одну из групп: энтеробактерии, образующие сероводород; энтеробактерии, не образующие сероводород и обладающие фенилаланиндезаминазой; энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие фенилаланиндезаминазу и обладающие желатиназой; энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие фенилаланиндезаминазу, желатиназу, обладающие уреазой; энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие фенилаланиндезаминазу, желатиназу, уреазу и образующие цитрат; энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие фенилаланиндезаминазу, желатиназу, уреазу, не образующие цитрат, положительные в реакции с метиловым красным; энтеробактерии, не образующие сероводород, не имеющие фенилаланиндезаминазу, желатиназу, уреазу, не образующие цитрат, отрицательные в реакции с метиловым красным, дальнейшую идентификацию проводят по оставшимся неучтенным признакам внутри каждой группы с определением видовой принадлежности возбудителя.