СПОСОБ ВИДОВОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ СТРЕПТОКОККОВ ГРУППЫ В И ГРУППЫ D Российский патент 2008 года по МПК G01N33/48 C12Q1/14 

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии и эпидемиологии, и может быть использовано при бактериологической диагностике и эпидемиологическом анализе гнойно-септических, в том числе нозокомиальных инфекций, вызванных стрептококками группы В и группы D.

К стрептококкам группы В согласно классификации Лендсвильдта относится единственный вид - Streptococcus agalactiae. Он занимает ведущее место при внутриутробном инфицировании плода, в перинатальной патологии новорожденных и инфекционной патологии послеродового периода у родильниц (Зуева Л.И., Тотолян А.А., Савина В.А. Эпидемиология и профилактика заболеваний, вызываемых стрептококками группы В.// ИП, СПб, 2000, - 10 с.). Роль стрептококков группы D (энтерококков), включающих 16 видов: Е. dispar, E. malodoratus, E. seriolicida, E. solitarius, Е. casseliflavus, E. gallinarum, E. muntiditti, E.avium, E. cecorum, E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. raffinosus, E. saccharolyticus, E. durans, E. pseudoavium, в последнее время возрастает не только в связи с увеличением гнойно-септических инфекций, но и как к представителям госпитальной микрофлоры в учреждениях родовспоможения, в отделениях реанимации, интенсивной терапии и хирургии (Л.П.Зуева, Р.Х.Яфаев. Эпидемиология: Учебник. - СПб: ООО «Издательство ФОЛИАНТ», 2005. - С.562-640).

Из представленных видов стрептококков группы В и D классическими микробиологическими методами определяют лишь три: Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecalis, Enterococcuss faecium. При этом используют набор признаков: по изучению КАМП-теста, характер роста культуры в глюкозном бульоне, в присутствии желчи, в режиме инкубации при температуре 45°С, разложение метиленовой сини в молоке и теллурита калия (Приказ МЗ СССР №535 «Об унификации микробиологических методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений». - 1985 г. - С.45-56).

Недостатком данного метода является сложность постановки КАМП-теста, ведущего признака при идентификации стрептококка группы В и отсутствие возможности достоверно определить все виды стрептококков группы D.

Наиболее близким аналогом представленного в заявке метода является способ видовой дифференциальной диагностики стрептококков группы В и D согласно Определителю бактерий Берджи (John G., Holt, Noel R. Krieg, Peter H.A. Sneath, James Т Stanley T. Williams Bergey's Manual of determinative bacterioloji Ninth Edition - Baltimor-Philadelphia-Hon Kong-London et al. - 1997. - V.2. - P.547, 560). Принадлежность к роду и виду стрептококков группы В и D данным способом осуществляется по биологическим признакам в стандартном режиме инкубации с использованием у стрептококков группы D - 25 тестов, у стрептококков группы В - 28, среди которых: характер колоний, особенности роста на питательных средах в различных режимах и условиях культивирования, утилизации сахаров, спиртов, аминокислот и др. в течение 5-6 суток.

Его недостатком является большое количество дифференцирующих тестов, используемых при проведении исследований.

Техническим результатом изобретения является повышение степени достоверности видовой дифференциальной диагностики стрептококков группы В и D и сокращение сроков диагностики до 3-4 суток.

Определение биологических свойств стрептококков группы В и D с использованием ведущих дифференцирующих тестов (8 тестов) позволяет определить их видовую принадлежность.

Сущность изобретения заключается в следующем. Путем изучения биологических свойств стрептококков группы В и группы D, выделенных из клинического материала и внешней среды с использованием классических питательных сред и стандартного режима инкубации, исследуют тесты по определению характера роста на комбинированном трехсахарном агаре Олькеницкого и солевом агаре при температуре 37°С, на среде с теллуритом калия, в глюкозном бульоне при температуре 45°С, а также по разложению лактозы, сахарозы, ксилозы, маннита, сорбита и наличию аргининдекарбоксилазы. Это позволит идентифицировать стрептококк группы В и 16 видов стрептококков группы D.

Способ осуществляется следующим образом: исследуемую чистую культуру-колонию стрептококка со среды первичного посева (обычно это 5% кровяной агар) пересевают на комбинированный трехсахарный агар Олькеницкого. Учет проводят через 18 часов инкубации при 35-37°С. Разложение глюкозы и лактозы до кислоты без газа позволяет дифференцировать стрептококки группы В и D от остальных групп стрептококков, все представители которых не растут на трехсахарном агаре. Отличительным признаком стрептококков группы В от группы D является отсутствие роста на 6,5% солевом агаре (см. чертеж).

Для видового типирования стертококков грппы В и D используют дифференцирующие признаки: образование кислоты из лактозы, сахарозы, ксилозы, аргинина, маннита, сорбита, наличие роста культуры в полужидкой среде для контроля стерильности (СКС) и восстановление теллурита из его соединения с калием (теллурита калия). Так Е. dispar и Е. malodoratus не растут при температуре 45°С. При этом Е. dispar в отличие от Е. malodoratus разлагает аргинин и восстанавливает теллурит, но не образует кислоту из маннита. Среди стрептококков группы D, растущих в режиме 45°С, только Е. seriolicida и Е. solitarius не разлагают лактозу. Эти два вида отличаются между собой способностью утилизировать сахарозу. У Е. solitarius этот признак положительный. В подгруппе стрептококков группы D, растущих при 45°С и разлагающих лактозу, лишь Е. durans и Е. pseudoavium не разлагают сахарозу. При этом Е. durans разлагает аргинин и не образует кислоту из маннита и сорбита, а Е. pseudoavium, напротив, утилизирует маннит и сорбит и не разлагает аргинин. В оставшейся группе стрептококков группы D, растущих при температуре 45°С, разлагающих лактозу и сахарозу, три вида (Е. casseliflavus, Е. gallinarum, E. muntiditti) образуют кислоту из ксилозы. Однако Е. gallinarum в этой подгруппе единственный микроорганизм, который не разлагает маннит, а Е. casseliflavus в отличие от Е. muntiditti восстанавливает теллурит.

Большую группу составляют стрептококки группы D, растущие при температуре 45°С, утилизирующие лактозу, сахарозу и не образующие кислоту из ксилозы (E.avium, Е. cecorum, Е. faecalis, Е. faecium, Е. hirae, Е. raffinosus, Е. saccharolyticus). Из них Е. faecalis, Е. faecium и Е. hirae аргининположительные, a E.avium, Е. cecorum, Е. raffinosus, E. saccharolyticus - аргининотрицательные. В подгруппе аргининположительных стрептококков группы D только Е. faecium не разлагает теллурит калия, а Е. faecalis в отличие от Е. hirae сбраживает маннит. У аргининотрицательных стрептококков группы D лишь Е. cecorum не разлагает маннит и сорбит, Е. avium не восстанавливает теллурит. Для дифференциальной диагностики Е. raffinosus, E. saccharolyticus дополнительно используют тест с глицерином. Стрептококк группы В не растет в режиме 45°С, разлагает аргинин, вариабельно - лактозу, теллурит калия, не утилизирует манит и сорбит. Оценка дифференцирующих тестов стрептококков группы В и стрептококков группы D представлена в таблице 1.

Таблица 1.
Дифференцирующие признаки стрептококков группы В и стрептококков группы Dрост на среде Олькеницкого (к/к)видрост с 6,5% NaClрост при 45°Cлакт.сах.ксил.арг.манн.сор.теллур. агарStreptococcus agalactiae--d......+--+Enterococcus dispar+-++...+-...+E. malodoratus+-++d-++-E. seriolicida++---+++-E. solitarius++-+-+++ E. casseliflavus+++++++-+E. gallinarum++++++--+E. munditii (желтый)+++++++d-E. avium++++--++-E. cecorum++++---- E. faecalis++++-++++E. faecium++++-++--E. hirae++++-+--+E. raffinosus*++++--++...E. saccharolyticus++++...-++...E. durans+++--+---E. pseudoavium+++---++...Примечание:
«+»- положительный признак
«-» - отрицательный признак
«d» - вариабельный признак (10-20% положительных находок)
«...»- нет данных
*Е. raffinosus - глицерин -
E. saccharolyticus - глицерин +

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1.

При посеве средней порции мочи у больного Б. (ист. бол. №35) с пиелонефритом на поверхности 5% кровяного агара после стандартного режима инкубации выросли серые колонии диаметром 1,5 мм, каталазоотрицательные. При микроскопии - короткие цепочки и грамположительные диплококки. После пересева колоний на комбинированную среду Олькеницкого и на агар с 6,5% NaCl через 18 часов инкубации на трехсахарном агаре произошло полное разложение углеводов (глюкозы и лактозы) до кислоты без газа с пожелтением среды и выявлен рост на агаре с солью (6,5% NaCl). При постановке тестов на способность к росту при 45°С, утилизацию лактозы, сахарозы, ксилозы, аргинина, маннита, сорбита и теллурита калия через 20 часов инкубации у штамма обнаружен рост на поверхности и в глубине среды СКС при 45°С, почернение колоний на среде с теллуритом калия, разложение до кислоты лактозы, сахарозы, маннита, сорбита, положительный тест с аргинином. Питательная среда, содержащая ксилозу, осталась без изменения цвета. В мазках из среды СКС обнаружены короткие цепочки грамположительных кокков.

Таким образом, у больного Б. с клиническим диагнозом «пиелонефрит» из мочи был выделен стрептококк, способный к росту на среде с повышенным содержанием соли и при высокой температуре, разлагающий теллурит калия, образующий кислоту из лактозы, сахарозы, аргинина, маннита, сорбита и не образующий - из ксилозы, что позволяет его отнести к группе стрептококков группы D (энтерококков), виду Enterococcus faecalis.

Пример 2.

У беременной З. (ист. бол. №490) при бактериологическом исследовании отделяемого из цервикального канала из клинического материала через 20 часов инкубации на поверхности 5% кровяного агара сплошным газоном выросли серые колонии диаметром 1 мм, окруженные зоной β-гемолиза, каталазоотрицательные. В мазках обнаружены короткие цепочки грамположительных кокков. После посева культуры-колонии на среду Олькеницкого и солевой агар выявлено полное разложение углеводов на трехсахарном агаре до кислоты и отсутствие роста на среде с 6,5% хлорида натрия. Тесты с маннитом, сорбитом, ксилозой отрицательные, с аргинином - положительный. Рост при 45°С отсутствовал.

Таким образом, у беременной З. из цервикального канала выделен стрептококк, растущий на среде Олькеницкого, не дающий рост на солевом агаре, не разлагающий маннит, сорбит, ксилозу, обладающий аргининдекарбоксилазой, не растущий в режиме 45°С, что позволяет его отнести к стрептококку группы В, Streptococcus agalactiae.

Используемый алгоритм видовой дифференциальной диагностики стрептококков группы В и группы D (энтерококков), указанный в заявке, проверен на штаммах Streptococcus agalactiae №6175 (полученного из Lister Institute, London), Streptococcus pneumoniae ATCC 49619, Enterococcus faecalis ATCC 29212, других контрольных штаммах НИИ им. Тарасовича и более чем на 500 культурах стрептококков и энтерококков, выделенных из клинического материала от больных с гнойно-септической патологией и из внешней среды лечебно-профилактических учреждений.

Предложенный способ видовой дифференциальной диагностики стрептококков группы В и D информативен и позволяет идентифицировать 16 видов стрептококков группы D и стрептококк группы В. Он достоверен, не удлиняет сроки производства анализа, может быть отнесен к классическим методам исследования, так как проводится на стандартных питательных средах, не требует для производства дорогостоящего оборудования, удобен при постановке, несложен в методическом плане. Поэтому без значительных материальных затрат и в короткие сроки может быть внедрен в работу любой бактериологической лаборатории.

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии и эпидемиологии, и может быть использовано при бактериологической диагностике. Способ характеризуется тем, что определяют биологические свойства стрептококков группы В и группы D, выделенных из клинического материала и внешней среды с использованием классических питательных сред и стандартного режима инкубации. Определяют характер роста на комбинированном трехсахарном агаре Олькеницкого и солевом агаре при температуре 37°С, на среде с теллуритом калия, в глюкозном бульоне при температуре 45°С, а также ведут определение по разложению лактозы, сахарозы, ксилозы, маннита, сорбита и наличию аргининдекарбоксилазы. Это позволяет идентифицировать стрептококк группы В и 16 видов стрептококков группы D. Изобретение позволяет повысить степень достоверности видовой дифференциальной диагностики стрептококков группы В и D, сократить сроки диагностики до 3-4 суток. 1 табл., 1 ил.

Способ видовой дифференциальной диагностики стрептококков группы В и группы D, выделенных от больных с гнойно-септической патологией и из внешней среды, путем определения биологических признаков стрептококков с использованием стандартных питательных сред и стандартного режима инкубации, отличающийся тем, что биологические признаки стрептококков определяют по способности их к росту на комбинированном трехсахарном агаре Олькеницкого, солевом агаре при температуре 37°С, в глюкозном бульоне при температуре 45°С, к утилизации лактозы, сахарозы, ксилозы, маннозы, сорбита, аргинина и восстановлению теллурита калия, по которым устанавливают видовую принадлежность стрептококков группы В и D.