СПОСОБ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ Helicobacter pylori В СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКЕ ЖЕЛУДКА У ПАЦИЕНТОВ С ГАСТРОДУОДЕНАЛЬНОЙ ПАТОЛОГИЕЙ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/48 G01N33/53 

Изобретение относится к медицинской бактериологии и может быть использовано при бактериологической диагностике Helocobacter pylori-ассоциированных заболеваний желудка и двенадцатиперстной кишки человека.

В последние годы возрастает клиническое значение Helicobacter pylori-ассоциированных заболеваний гастродуоденальной зоны, которые можно рассматривать как частный случай геликобактериоза, где Helicobacter pylori (H. pylori) является одним из наиболее существенных этиопатогенетических факторов. Это в большей степени относится к пациентам гастроэнтерологического профиля и может привести к развитию язвы желудка и двенадцатиперстной кишки, острым и хроническим гастритам, эзофагитам.

Известен способ диагностики H. pylori в слизистой оболочке желудка (СОЖ) по результатам цитологического (обнаружение спиралевидных, изогнутых или кокковидных бактерий) и биохимического исследования (выработка фермента уреазы) [Сафронова Н.В., Жебун А.Б. и др. Гастрит, язвенная болезнь и хеликобактериоз. Рекомендации для врачей. - Санкт-Петербург, 1993. - 38 с.].

Недостатком данного способа является его низкая специфичность в силу присутствия в СОЖ других условно-патогенных штаммов микроорганизмов, в том числе схожих с H. pylori по морфологическим и биохимическим признакам.

Наиболее близким аналогом предлагаемого способа является развернутое бактериологическое исследование биоптата СОЖ, которое в настоящее время проводится только в сложных диагностических случаях [Хоулт Д., Криг Н., Снит П. и др. Определитель бактерий Берджи. Девятое издание. В двух томах. - 1997. - Т.1. - С.46, 51, 65]. Этот способ включает следующие этапы: посев биоптата на сердечно-мозговой (СМВ-агар) или шоколадный агар; определение характера роста колоний на питательных средах; изучение морфологии; ферментативных свойств; гидролиз жиров; декарбоксилирование аминокислот; ростовые особенности на селективных питательных средах (в том числе при наличии определенных добавок, различных уровнях рН-среды и температурном режиме). Всего исследуют 16 дифференцирующих признаков.

Развернутый метод культуральной диагностики Н. pylori не нашел широкого практического применения в силу недостатков: сложности исполнения из-за большого набора биохимических и ферментативных тестов, значительного расхода дорогостоящих питательных сред, как правило, импортного производства, длительным (более 5 суток) сроком анализа. Предлагаемый способ диагностики позволяет устранить перечисленные недостатки.

Признаки известного технического решения, совпадающие с признаками заявленного изобретения, заключаются в наличии операций определения культуральных и биохимических свойств возбудителя при посеве биологического материала на питательные среды, стандартного режима инкубации, установления тинкториальных и морфологических свойств исследуемого штамма, а также тестирования на каталазообразование, оксидазообразование, уреазообразование.

Задача, на решение которой направлено изобретение, заключается в повышении эффективности лабораторной диагностики Н. pylori.

Технический результат, обеспечивающий решение указанной задачи, состоит в сокращении сроков исследования и повышения достоверности диагностики.

Достигается технический результат тем, что в способе бактериологической диагностики Н. pylori-инфицирования слизистой оболочки желудка у больных с гастродуоденальной патологией, включающем определение культуральных и биохимических свойств возбудителя при посеве биологического материала на питательные среды, стандартного режима инкубации, установления тинкториальных и морфологических свойств исследуемого штамма, а также тестирование на каталазообразование, оксидазообразование, уреазообразование, согласно изобретению дополнительно проводят тестирование на разложение гиппурата натрия, х-фактор и кислотоустойчивость. При этом использование совокупности отличительных признаков позволяет значительно сократить время диагностики и повысить достоверность диагноза.

Выявление отличительных признаков Н. pylori: способности к разложению гиппурата натрия, отсутствие х-фактора и кислотоустойчивости служат диагностическими критериями при определении возбудителя от наиболее близких представителей условно-патогенной и нормофлоры (коринебактерий, гемофильной палочки, лактобактерий). Так, коринебактерии (Corynebacterium sp.) не различают гиппурат натрия, гемофильная палочка (Haemophilus influenzae) обладает высокой потребностью в гемине - наличие х-фактора, вокруг диска с сапонином наблюдается усиленный рост культуры. Лактобактерии (Lactobacillus sp.) кислотоустойчивы (растут на тиогликолевой среде с низким уровнем рН - 3,5) и не разлагают гиппурат натрия, стрептококки (Streptococcus sp.) - отсутствие х-фактора и кислотоустойчивости (таблица).

Новые признаки заявленного способа заключаются в применении тестов на х-фактор, кислотоустойчивость и разложение гиппурата натрия. Способ осуществляется следующим образом.

Исследуемый материал (биоптат слизистой оболочки желудка) засевают на чашки со стандартной средой - СМВ-агар. В случае роста на питательной среде через 72-96 часов инкубации при температуре 35-37°С и повышенном содержании СО₂ мелких (диаметром 0,5-1,0 мм) бесцветных колоний с гладкой поверхностью проводят их микроскопию. При обнаружении в мазке тонких грамвариабельных палочек или кокковидных форм выросшие колонии исследуют на каталазообразование, оксидазообразование, уреазообразование, определяют способность к разложению гиппурата натрия, отсутсвие х-фактора (отсутствие потребности в гемине) и кислотоустойчивости (отсутствие роста в тиогликолевой среде с рН-3,5).

При обнаружении на СМВ-агаре мелких полупрозрачных каталазоположительных, оксидазоположительных, уреазоположительных колоний диаметром 0,5-1,0 мм, в мазках - полиморфных палочек или коккобактерий, разлагающих гиппурат натрия, не обладающих х-фактором и кислотоустойчивостью, микроорганизм относят к Н. pylori.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. Пациент Б., 62 года (ист. бол. №3529) клинический диагноз: гастроэзофагальная болезнь, недостаточность кардиального жома, дивертикул антрального отдела желудка, дуодено-гастральный рефлюкс. Жалобы: на дискомфорт в правой половине живота и гастродуоденальной зоне постоянного характера. Объективно: состояние удовлетворительное, язык покрыт белым налетом. Пальпаторно: живот мягкий безболезненный, печень увеличена на 2 см. Заключение фиброгастроскопии: поверхностный антрум-гастрит (легкие изменения). Невыраженная недостаточность кардиального жома. Дивертикулоподобное образование антрального отдела желудка. Цитология из дивертикулоподобного образования антрального отдела желудка: эритроциты покрывают все поле зрения, нейтрофилы - 2-5 в п/зрения, хеликобактерии в большом количестве, пласты и скопления клеток покровно-ямочного эпителия без признаков атипии. Рентгеноскопия желудка, заключение: недостаточность кардиального жома, дивертикул 7×5 мм, в антральном отделе желудка дуодено-гастральный рефлюкс. Лабораторные исследования: общий анализ крови - без патологии, общий анализ мочи - без патологии. Биохимический анализ крови: общий белок 84 г/л, мочевина 7,0 ммоль/л, холестерин 7,5 ммоль/л, триглицериды 2,67 ммоль/л, билирубин 34,2 ммоль/л (связанный 4,9 ммоль/л, свободный 29,4 ммоль/л), альфа-амилаза 124 ед./л, щелочная фосфатаза 129 ед./л, тимоловая проба 2,5. Иммуноферментный анализ крови выявил титр антител к CagA-антигену HP 1:80 (резкоположительный результат), IgA (гелико-экспресс)-слабоположительный результат, гелико А и G - положительный результат. При бактериологическом посеве биоптата слизистой оболочки желудка на поверхности среды СМВ-агар через 72 часа инкубации при повышенном содержании СО₂ (в эксикаторе) и при температуре 37°С были обнаружены мелкие бесцветные колонии; общее микробное число 10³ КОЕ/мл. При микроскопии - грамвариабельные тонкие изогнутые подвижные палочки. При постановке дифференцирующих тестов Х-фактор отсутствует. Проба с 3%-раствором перекиси водорода положительная (тест на каталозообразование), оксидазный тест и тест с гиппуратом натрия - положительный. Микроорганизм активно разлагает мочевину и не обладает кислотоустойчивостью. Таким образом, у пациента с клиническим диагнозом эрозивного антрум-гастрита и косвенными признаками Н. pylori-инфицирования (цитологическим и иммунологическим методом), бактериологическим способом выделен Н. pylori.

Пример 2. Пациент Ш., 73 года (ист. бол. №931) клинический диагноз: хронический эрозивный гастродуоденит, стадия обострения. Хронический вторичный панкреатит. Гипертоническая болезнь 2 степени. Жалобы: на периодические боли в верхней половине живота, вздутие живота в вечернее время, эпизоды крови (алого цвета) в кале. Объективно: состояние удовлетворительное. Язык обложен белым налетом. Живот мягкий, болезненный в эпигастрии и левом подреберье, увеличен в размере за счет вздутия. Заключение ФГС: эрозивный антрум-гастрит, эрозивный бульбит. Цитологическое исследование биоптата слизистой оболочки желудка: эритроциты в большом количестве, нейтрофилы 0-2 в п/зрения. Небольшие скопления клеток покровно-ямочного эпителия без признаков атипии. Лабораторные исследования: общий анализ крови: эритроциты 4,7*10¹²/л, гемоглобин 140 г/л, лейкоциты 10,35*10⁹, из них эозинофилы 8%, палочкоядерные 3%, сегментоядерные 54%, лимфоциты 17%, моноциты 17%, СОЭ 7 мм/ч. Общий анализ мочи без патологии. Биохимический анализ крови без патологии. Исследование крови на H. pylori: IgA-положительный, IgG-положительный, антитела к CagA HP - слабоположительный результат. При посеве биоптата слизистой оболочки желудка на среде СМВ-агар через 72 часа инкубации при повышенном содержании СО₂ и при температуре 37°С были обнаружены мелкие бесцветные колонии; общее микробное число 10³ КОЕ/мл. При видовой идентификации выделенный штамм был каталазо- и оксидазоположительный, разлагал мочевину, не обладал Х-фактором и кислотоустойчивостью. Тест с гиппуратом натрия сработал положительно.

Таким образом, у пациента с клиническим диагнозом эрозивного антрум-гастрита бактериологическим методом было подтверждено H. pylori-инфицирование.

Пример 3. Пациент П., 53 года (ист. бол. №1249). Клинический диагноз: язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки, холецистит. Объективно: состояние удовлетворительное, температура 36,6 С. Заключение фиброгастроскопии: рефлюкс-эзофагит 1 ст., эрозивный антрум-гастрит на фоне гиперплазии участка слизистой оболочки. Иммуноферментный анализ крови: IgG-положительный результат, антитела к CagA антигену не выявлены. Лабораторные исследования: общий анализ крови - без патологии. Общий анализ мочи: удельный вес 1019, реакция нейтральная, белок отр., фосфаты ++++. Биохимический анализ крови: мочевина 8,6 ммоль/л, креатинин 115 ммоль/л, общий билирубин 14,7 ммоль/л, АЛТ 56 ммоль/ч/л, ACT 42 ммоль/ч/л. При посеве биоптата СОЖ на СМВ-агаре через 96 часов инкубации были выявлены точечные бесцветные колонии, оксидазоположительные, каталазоположительные, разлагающие мочевину и гиппурат натрия и не имеющие Х-фактора. При посеве культуры возбудителя в тиогликолевую среду с уровнем рН 3,5 роста нет, что свидетельствует об отсутствии кислотоустойчивости. Таким образом, у пациента, имеющего клинические признаки эрозивного антрум-гастрита, при культуральной диагностике был выделен Н. pylori.

Данным способом были изучены 15 клинических штаммов Н. pylori, выделенных от больных с «язвенной болезнью желудка» и подтвержденных другими методами лабораторной диагностики (клиническим, иммунологическим, развернутым микробиологическим). Контрольную группу составили 50 больных с различной патологией и практически здоровых пациентов, из клинического материала у которых выделялись схожие по тинкториальным свойствам представители микрофлоры - Corynebacterium sp., Haemophilus sp., Lactobacillus sp., Streptococcus sp. Родовая и видовая принадлежность у этих микроорганизмов также была подтверждена методом развернутой культуральной диагностики.

Предложенный способ диагностики Н. pylori при гастродуоденальной патологии информативен, достоверен, укорачивает сроки проведения анализа (до 3-4 суток), проводится на стандартных питательных средах, не требует для производства дорогостоящего оборудования, удобен при постановке, несложен в методическом плане. Поэтому без значительных материальных затрат и в короткие сроки может быть внедрен в работу любой бактериологической лаборатории. Способ может быть рекомендован для более точной этиологической диагностики гастроэнтерологических заболеваний человека.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при бактериологической диагностике Helicobacter pylori-ассоциированных заболеваниях желудка и двенадцатиперстной кишки человека. Способ бактериологической диагностики Helicobacter pylori в слизистой оболочке желудка осуществляется следующим образом. Исследуемый материал (биоптат слизистой оболочки желудка) засевают на чашки Петри со стандартной средой СМВ-агар. В случае роста на питательной среде через 72-96 часов инкубации при температуре 36,0±1,0°С и повышенном содержании CO₂ мелких (диаметром 0,5-1,0 мм) бесцветных колоний с гладкой поверхностью проводят их микроскопию. При обнаружении в мазке тонких грамвариабельных палочек или кокковидных форм выросшие колонии исследуют на каталазообразование, оксидазообразование, уреазообразование, определяют способность к разложению гиппурата натрия, отсутствие х-фактора (потребность в гемине) и кислотоустойчивости (отсутствие роста в тиогликолевой среде с рН-3,5). Использование изобретения сокращает сроки исследования и повышает достоверность диагностики Helicobacter pylori-инфицирования. 3 пр., 1 табл.

Способ бактериологической диагностики Helicobacter pylori - инфицирования слизистой оболочки желудка у больных с гастродуоденальной патологией, включающий определение культуральных и биохимических свойств возбудителя при посеве биологического материала на питательные среды, стандартного режима инкубации, установления тинкториальных и морфологических свойств исследуемого штамма, а также тестирование на каталазообразование, оксидазообразование, уреазообразование, отличающийся тем, что дополнительно проводят тестирование на х-фактор, кислотоустойчивость и разложение гиппурата натрия.