ПРОТИВОВИРУСНОЕ СРЕДСТВО (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ Российский патент 2008 года по МПК A61K31/513 A61K31/7072 A61P31/18 

Изобретение предназначено для лечения вирусных инфекций и относится к комбинациям противовирусных агентов, обладающих активностью против ВИЧ, а именно к комбинации ламивудина (3ТС) с фосфазидом (5'-Н-фосфонат-3'-азидо-3'-дезокситимидин, натриевая соль; Никавир^®).

ВИЧ-инфекция - длительно текущая инфекционная болезнь, развивающаяся в результате инфицирования вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). При ВИЧ-инфекции прогрессирует поражение иммунной системы, приводящее к состоянию, известному под названием «синдром приобретенного иммунного дефицита» (СПИД), при котором у больного развиваются «оппортунистические заболевания»: тяжелые формы инфекций, вызванных условно-патогенными возбудителями, и некоторые онкологические заболевания.

Зараженный человек остается источником инфекции пожизненно. ВИЧ-инфекция без лечения прогрессирует в течение 3-20 лет и заканчивается гибелью зараженного лица.

Разнообразие клинических проявлений ВИЧ-инфекции и возникающих на ее фоне оппортунистических заболеваний, длительное течение болезни сделало актуальным разработку лекарственных препаратов для лечения ВИЧ-инфицированных и больных СПИДом. В настоящее время известны следующие группы препаратов: нуклеозидные, нуклеотидные и ненуклеозидные ингибиторы вирусной обратной транскриптазы; протеазные ингибиторы; ингибиторы фузии. В разработке находится ряд соединений, активных в отношении других участков жизнедеятельности ВИЧ.

Наиболее широкое применение нашли нуклеозидные ингибиторы вирусной обратной транскриптазы. В их числе - зидовудин (АЗТ), ламивудин (3ТС), диданозин (DDI) и др. Причем до сих пор наиболее широко применяется первый из разработанных препаратов - зидовудин.

Необходимость длительного, практически пожизненного применения препаратов приводит к токсическим проявлениям и развитию лекарственной устойчивости вируса (резистентности). По некоторым данным резистентность к АЗТ развивается через 6 инфекционных циклов, к 3ТС - через 4 инфекционных цикла. Известен препарат фосфазид (5'-Н-фосфонат-3'-азидо-3'-дезокситимидин, натриевая соль, Никавир^®) [Кравченко А.В. Применение Никавира в составе антиретровирусной терапии // Медицинская кафедра, 2004. - №2. - С.90-92, 166-172], применение которого характеризуется лучшей переносимостью и меньшей скоростью возникновения резистентности к нему по сравнению с зидовудином [Machardo J., Salomon H., Oliveiro M., et al. Antiviral activity and resistance profile of phosphazide, a novel prodrug of AZT. Nucleosides & Nucleotides; 1999; 18: 901-906]. Отмеченные преимущества могут быть объяснены данными по метаболизму фосфазида [Y. Skoblov et al. / Antiviral Research 63 (2004) 107-113].

Использование комбинаций противовирусных препаратов позволяет более эффективно воздействовать на ВИЧ за счет возникающего синергического эффекта. Так авторами патента [Патент RU №2139059] показано, что в сочетании со вторым компонентом, ламивудин (3ТС) либо усиливает действие второго компонента (синергический эффект), либо снижает цитотоксическое действие второго компонента, либо обладает и тем и другим из указанных свойств.

К недостаткам известной комбинации ламивудина с зидовудином можно отнести:

- токсичность, проявляющуюся в основном в развитии анемии, нейтропении и лейкопении;

- мутагенный эффект, проявляющийся в способности индуцировать генные мутации у индикаторных микроорганизмов в системе метаболической активации in vitro;

- недостаточная эффективность лечения.

Задачей изобретения является разработка комбинированного средства, обладающего активностью в отношении ВИЧ-инфекции, лишенного указанных недостатков.

Авторами настоящей заявки было установлено, что замена зидовудина на фосфазид в известной комбинации с ламивудином приводит к существенному снижению токсических проявлений, характерных для больных, получающих зидовудин, отсутствию мутагенного эффекта при учете генных мутаций на микроорганизмах и достоверному росту эффективности лечения. В связи с тем, что фосфазид в организме млекопитающего частично генерирует зидовудин [Y. Skoblov et al. / Antiviral Research 63 (2004) 107-113], его использование в известной комбинации вместо зидовудина не должно было приводить к перечисленным преимуществам. Поэтому полученные результаты могут быть отнесены к неожиданным, предсказать которые заранее было невозможно.

Средство согласно изобретению может представлять собой фармацевтическую композицию, содержащую в качестве активного начала комбинацию нуклеозидных ингибиторов вирусной обратной транскриптазы ламивудина (а) и фосфазида (б) или набор, где компоненты (а) и (б), каждый, предложены в форме (которая может быть одинаковой или разной), подходящей для введения в сочетании друг с другом.

Выполненное по любому из вариантов средство содержит комбинацию ламивудина и фосфазида при соотношениях активных компонентов от 1:250 до 250:1, предпочтительно 1:5-50:1, а более предпочтительно около 1:10-10:1.

Предлагаемая в настоящем изобретении противовирусная комбинация может быть использована в способе лечения ВИЧ-инфекции. При этом оба соединения могут быть введены либо одновременно, в смеси или раздельно, либо последовательно. Как и в прототипе при последовательном введении промежуток времени между введением ингибиторов не должен быть слишком большим. Он может составлять от нескольких минут до 3 часов. Предпочтительным является одновременное введение. Количество ламивудина и фосфазида, необходимое для лечения, может варьироваться в зависимости от способа введения, особенностей протекания ВИЧ-инфекции, возраста и состояния пациента, и может быть определено в каждом конкретном случае лечащим врачом. При этом используемые дозы находятся в пределах от 2 до 750 мг на кг веса в день, предпочтительно в пределах 6-90 мг/кг/день, а наиболее предпочтительно 15-60 мг/кг/день каждого ингибитора.

Ламивудин и фосфазид могут быть использованы в терапевтических целях в виде субстанций: (2R, цис)-4-амино-1-(2-гидроксиметил-1,3-оксакисолан-5-ил)-(1Н)-пиримидин-2-он и 5'-Н-фосфонат-3'-азидо-3'-дезокситимидин, натриевая соль. Однако предпочтительно введение указанных ингибиторов в виде композиции с фармацевтически приемлемыми носителями.

В качестве приемлемых носителей могут быть использованы различные добавки, используемые при производстве готовых лекарственных форм (таблетки, капсулы, свечи, инфузионные растворы и др.), совместимые с другими ингредиентами препарата и не оказывающие неблагоприятное воздействие на пациента.

В силу свойств молекул ламивудина и фосфазида, особенностей механизма их воздействия на ВИЧ внутри клеток наибольший интерес представляют препараты для перорального, парентерального и ректального введения. Также препараты могут быть изготовлены любым из известных в фармацевтике способов, которые концептуально включают в себя ряд этапов: смешение и гранулирование ингибиторов с твердыми или жидкими носителями; формирование продукта в виде дискретных унифицированных лекарственных форм.

Для перорального введения могут использоваться таблетки, капсулы, растворы для приема внутрь и другие известные в фармацевтике стандартные лекарственные формы. Таблетки и капсулы могут содержать стандартные наполнители, необходимые как для технологии их изготовления, так и для достижения необходимых качественных и количественных показателей, отвечающих требованиям соответствующей фармакопеи. Примерами наполнителей могут быть лактоза, маннит, крахмалы, модифицированные крахмалы, целлюлоза и ее производные, желатин, стеариновая кислота или ее соли, увлажнители, отдушки, красители.

Пероральные жидкие препараты могут быть изготовлены либо в виде растворов (водные или масляные суспензии, растворы, эмульсии, сиропы и др.), либо в виде сухих продуктов, которые перед непосредственным применением подлежат разведению водой или другими растворителями.

Препараты для парентерального введения (например, для инфузий) могут быть изготовлены в виде стандартных флаконов, ампул, заполненных шприцев и др. Также лекарства должны изготавливаться в условиях стерильности и могут содержать различные консерванты, буферирующие агенты, стабилизаторы, изотонические агенты. Лиофилизованные формы перед использованием должны смешиваться с апирогенным стерильным растворителем.

Готовые лекарственные формы для ректального введения могут изготавливаться в виде суппозиториев в унифицированных формах. Также твердые формы изготавливаются, как правило, с использованием подходящего носителя путем смешения ингибитора с твердым или расплавленным носителем с последующим формованием из расплава при охлаждении.

Помимо отмеченного, фармацевтические композиции могут быть изготовлены с использованием модифицированных соединений, приводящих к пролонгированному высвобождению ингибиторов внутри организма.

Настоящее изобретение иллюстрируется, но не ограничивается, приводимыми далее примерами.

Пример 1.

Капсулы следующего состава:

Фосфазид 300 мг

Ламивудин 150 мг

Лактоза 240 мг

Стеарат магния 20 мг

Пример 2.

Набор в виде блистерной упаковки, содержащей два ряда капсул по 10 штук разного цвета.

1 ряд - капсулы желтого цвета следующего состава:

Фосфазид 300 мг

Кальция карбонат 170 мг

Целлюлоза микрокристаллическая 55 мг

Аэросил 20 мг

Магния стеарат 15 мг

2 ряд - капсулы белого цвета следующего состава:

Ламивудин 150 мг

Лактоза 85 мг

Стеарат магния 5 мг

Пример 3.

Набор в виде блистерной упаковки, содержащей два ряда таблеток по 10 штук разного цвета.

1 ряд - таблетки желтого цвета следующего состава:

фосфазид 100 мг

кальция карбонат 55 мг

целлюлоза микрокристаллическая 18 мг

аэросил 6 мг

магния стеарат 6 мг

хинолиновый желтый Е104

2 ряд - таблетки белого цвета следующего состава:

ламивудин 200 мг

лактоза 21 мг

гидроксипропилметилцеллюлоза 45 мг

повидон 12 мг

стеарат магния 2 мг

Пример 4

Раствор для инъекций

Ламивудин 200 мг

Фосфазид 20 мг

Бензиловый спирт 100 мг

Глюкофурол 75 1000 мг

Вода для инъекций до 3 мл

Пример 5

Свечи следующего состава:

Ламивудин 2 мг

Фосфазид 500 мг

Витепсол 1498 мг

Пример 6.

Испытания in vitro комбинации ламивудина с зидовудином и ламивудина с фосфазидом с целью оценки мутагенной активности.

Использовали метод учета способности соединения индуцировать генные мутации у индикаторных микроорганизмов в системе метаболической активации in vitro.

В качестве индикаторных микроорганизмов использовали ауксотрофные по гистидину штаммы Salmonella typhimurium ТА 98, ТА 100 и ТА1537.

Водные растворы веществ (ламивудин + зидовудин; ламивудин + фосфазид) в концентрациях каждого от 0,2 до 2000 мкг/чашку стерилизовали с помощью мембранных фильтров с диаметром пор 0,2 микрон фирмы GELMAN. Селективный полуобогащенный агар в пробирках в объеме 2 мл плавили на водяной бане при температуре 100°С, охлаждали в термостатируемой водяной бане до температуры 44-45°С. В пробирки с агаром вносили 100 мкл раствора веществ, 100 мкл суспензии ночной культуры бактерий, 100 мкл фракции 59 печени крысы и кофакторы. Микросомальную фракцию печени крысы, индуцированной Aroclor, получали в виде лиофилизата у фирмы Labsystems (Финляндия). Проводили опыт как с полной микросомальной активирующей смесью ПАМС, так и с неполной активирующей микросомальной смесью НАМС. Указанные смеси вносили после извлечения пробирок из термостатирующей бани и тут же наносили полужидкий агар на слой минимального агара на чашках Петри. После полного застывания агара чашки переносили в термостат при 37°С. На каждую дозу препарата делали 3 повторности с ПАМС и 3 повторности с НАМС. Учет прототрофных ревертантов производили через 48 часов инкубации при 37°С. Для каждого варианта рассчитывали среднее геометрическое число ревертантов

Xi=³N Xi₁ Xxi₂ Xxi₃

где Xi - число ревертантов в чашках Петри 1, 2, 3 на дозе i.

Для каждого опытного варианта находили кратность превышения среднего геометрического числа ревертантов в опыте над контролем и сравнивали с критическим значением (1.9 для штамма ТА 1537 и 1.5 для штамма ТА 98 и ТА 100).

Мутагенный эффект растворов с зидовудином выявлен для штаммов ТА 98 и ТА 1537 как в присутствии микросомальной смеси, так и без нее в дозах 2 мкг на чашку и выше.

Растворы ламивудина с фосфазидом не обладают мутагенным действием в тесте Эймса.

Пример 7.

В ФНМЦ СПИД проанализирована эффективность и безопасность противоретровирусной терапии, включающей в себя в том числе комбинацию фосфазида - 0,6 г в сутки и ламивудина - 0,3 г (в соотношении по примерам 1, 2) в сутки у 23 больных ВИЧ-инфекцией женщин. Ни в одном случае не было отмечено нежелательных явлений, связанных с применением фосфазида или ламивудина и потребовавших коррекции терапии.

Анализ динамики лабораторных маркеров эффективности противоретровирусной терапии (количества в крови РНК ВИЧ и СВ4-лимфоцитов) дал следующие результаты:

- Медиана уровня РНК ВИЧ (вирусная нагрузка) до начала лечения составляла 15500 копий в мл (4,19 log10), максимальное значение в группах - 136000 копий в мл (5,13 log10), минимальное - 1510 копий в мл (3,10 log10). Через 12 недель лечения - медиана - ниже уровня определения (<400 копий в мл - 2,6 log10), максимум - 28200 копий/мл (4,45 log10).

- Значимое снижение уровня «вирусной нагрузки» (более чем на 0,7 log10) к 12 неделе лечения было отмечено в 13 из 13 случаев (100%) в первой группе и в 9 случаев из 10 во второй (90%).

- Количество пациентов с относительно высоким уровнем «вирусной нагрузки» (>30000 копий в мл) до лечения было 8 из 23 (35%), причем у 2 (9%) пациентов вирусная нагрузка была очень высокой (более 100000 копий в мл). Через 12 недель лечения вирусная нагрузка ни в одном случае не превышала 30000 копий в мл.

- Вирусная нагрузка выше 1000 копий в мл (показание к родоразрешению ВИЧ-инфицированной беременной путем планового кесарева сечения) до лечения отмечалось у всех пациенток, через 12 недель лечения - у 4 (17%).

- Вирусная нагрузка ниже уровня определения (400 копий в мл), не встречавшаяся до лечения ни в одном случае, через 12 недель лечения отмечена у 16 (70%) пациентов.

- Медиана уровня СD4-лимфоцитов до начала лечения составляла 0,35 млрд/л, максимальное значение в группе - 0,8 млрд/л, минимальное - 0,19 млрд/л. Через 12 недель лечения - медиана - 0,4, максимум - 0,87, минимум 0,15.

- Повышение уровня СD4-лимфоцитов к 12 неделе лечения имело место у 16 (70%) пациентов, снижение у 7 (30%).

- Количество пациентов с относительным уровнем СD4-лимфоцитов менее 0,35 млрд/л до лечения - 11 человек (48%), через 12 недель лечения - 7 человек (30%).

Таким образом, в обеих группах пациентов к 12 неделе лечения отмечалось статистически достоверное снижение «вирусной нагрузки». У 22 из 23 пациентов терапия по критерию снижения «вирусной нагрузки» была эффективна.

Анти-ВИЧ-1 активность комбинации изучали на высокочувствительной к вирусу иммунодефицита человека культуре клеток МТ-4. Клетки МТ-4 заражали стоком вируса (штамм вич-1_EVK) с множественностью заражения 0,2-0,5 инфекционных единиц на клетку и инкубируют при 37° в течение 1 часа (адсорбция вируса). Суспензию инфицированных клеток разводили ростовой питательной средой RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки плода коровы фирмы "ICN" (США), 0,06% L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина и 60 мкг/мл линкомицина, до посевной концентрации 0,5×10⁶ клеток/мл и вносили в лунки 96-луночного культурального планшета. Экспериментальные (с препаратом) и контрольные (без препарата) инфицированные клетки и контрольные неинфицированные клетки (без препарата) культивируют при 37°С и 5% СО₂ в течение 4 суток. По окончании инкубации подсчитывают долю жизнеспособных клеток в камере Горяева после окрашивания 0,4%-ным раствором трипанового синего и контролируют уровень накопления вирусспецифического белка р24 иммуноферментным методом, как описано в [Федюк Н.В., Коновалов Е.Е., Локтев В.Б., Урываев Л.В., Куляндин С.А., Покровский А.Г. Выявление и количественное определение антигенов вируса иммунодефицита человека типов 1 и 2. Вопр. вирусол. (1992). №3: 135-138].

Экспериментальные данные приведены в таблицах.

Таблица 1
Анти-ВИЧ-1 активность комбинации никавира и ламивудина в отношении штамма ВИЧ-1_EVK в культуре клеток МТ-4ПрепаратКонцентрацияЖизнеспособностьСодержаниеИнгибирование препарата,клеток, %р24, нг/млр24, % мкг/мл   никавир592,26±0,96138,52±9,251891,39±0,58--191,21±0,27136,30±3,3991,52±0,21--0,594,76±2,00133,33±2,2291,71±0,14--0,194,36±1,54204,14±18,6687,31±1,16--0,0587,35±2,28508,24±103,3868,40±6,43--0,0142,9±6,331428,80±439,6311,16±27,34--0,00541,56±7,211614,28±97,47-0,38±6,06никавир-1+270,89±9,8379,26±14,8095,07±0,92ламивудин    --0,5+187,60±7,64101,48±5,1393,69±0,32--0,05+0,195,87±4,10312,01±26,7180,60±1,66--0,01+0,0257,58±8,84906,17±191,6843,65±11,92--0,005+0,0133,66±5,97981,93±110,9538,94±6,90ламивудин286,16±4,28163,07±1,0689,86±0,07--179,92±12,45171,52±13,9989,33±0,87--0,289,35±1,72538,91±56,6066,49±3,52--0,132,82±4,44845,36±38,9247,43±2,42--0,0231,00±6,28992,90±193,8438,26±2,42--0,0137,28±1,07911,15±53,8643,34±3,35--0,00246,47±3,96936,07±0,0041,79±0,00--0,00119,36±6,381161,37±68,8727,78±4,28МТ-4-95,62±1,96--МТ-4(ВИЧ1)-24,45±5,031608,21±221,91-

Таблица 2
Количественные характеристики ингибирования ВИЧ-1_EVK комбинацией никавира и ламивудинаПрепаратID₅₀, мкМFICиндивидуальнаяв смеси0,715никавир0,110,056 ламивудин0,0970,021 

Таким образом, в результате изучения анти-ВИЧ активности нуклеозидных ингибиторов фосфазида (никавира), ламивудина (3ТС) и их комбинаций в отношении штамма ВИЧ-1 ГКВ 4005 на культуре клеток МТ-4 установлено, что сочетания никавира и ламивудина проявляют синегризм в отношении ингибирования репродукции ВИЧ-1.

При пассировании вируса в описанных условиях установлено, что падение действующей концентрации фосфазида в присутствии ламивудина наступает на 60-70 дней позже по сравнению с использованием одного лишь фосфазида. Концентрации фосфазида в сравнительных опытах были идентичны.

Изобретение относится к области медицины, предназначено для лечения вирусных инфекций и касается комбинированного противовирусного средства, обладающего активностью против ВИЧ, а именно к комбинированному противовирусному средству, представляющему собой композицию, содержащую (2R, цис)-4-амино-1-(2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-1Н-пиримидин-2-он (ламивудин) и 5'-Н-фосфонат-3'-азидо-3'-дезокситимидин, натриевую соль (фосфазид) при соотношении от 250:1 до 1:250 по массе, и способу лечения ВИЧ-инфекции. Использование изобретения приводит к отсутствию мутагенного эффекта при учете генных мутаций на микроорганизмах и достоверному росту эффективности лечения при существенном снижении токсических проявлений. 3 н. и 9 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Комбинированное противовирусное средство, обладающее активностью в отношении ВИЧ-инфекции, характеризующееся тем, что оно представляет собой композицию, содержащую (2R, цис)-4-амино-1-(2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-1Н-пиримидин-2-он (ламивудин), и 5'-Н-фосфонат-3'-азидо-3'-дезокситимидин, натриевую соль (фосфазид) при соотношении от 250:1 до 1:250 по массе.2. Средство по п.1, характеризующееся тем, что отношение ламивудина к фосфазиду составляет от 1:10 до 10:1.3. Средство по п.1 или 2, характеризующееся тем, что композиция содержит дополнительно фармацевтически приемлемый носитель.4. Средство по п.3, характеризующееся тем, что оно предназначено для перорального введения.5. Средство по п.4, характеризующееся тем, что оно выполнено в виде таблетки.6. Средство по п.4, характеризующееся тем, что оно выполнено в виде капсулы.7. Комбинированное противовирусное средство, обладающее активностью в отношении ВИЧ-инфекции, характеризующееся тем, что оно представляет собой набор, состоящий из(2R, цис)-4-амино-1-(2-гидроксиметил-1,3-оксатиолан-5-ил)-1Н-пиримидин-2-она (ламивудина), и 5'-Н-фосфонат-3'-азидо-3'-дезокситимидина, натриевой соли (фосфазида) при соотношении от 250:1 до 1:250 по массе.8. Средство по п.7, характеризующееся тем, что, по меньшей мере, один активный компонент введен в фармацевтически приемлемый носитель.9. Способ лечения млекопитающего, включая человека, инфицированного или восприимчивого к ВИЧ-инфекции, характеризующийся тем, что ему вводят противовирусное средство по любому из пп.1-8 в эффективном количестве.10. Способ по п.9, в котором ламивудин и фосфазид вводят одновременно.11. Способ по п.10, в котором ламивудин и фосфазид вводят последовательно.12. Способ по п.11, в котором ламивудин и фосфазид вводят в форме единичной фармацевтической композиции.