СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 2024 года по МПК A61K36/185 B01D11/02 A61P29/00 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно, к получению средства из растительного сырья, обладающего противовоспалительной активностью.

Лекарственное растительное сырье и препараты на его основе продолжают играть важную роль в фармакотерапии многих хронических и вялотекущих заболеваний человека. Как показали исследования, фитопрепараты составляют около 20-25% от общего количества лекарственных средств, зарегистрированных в Российской Федерации [1, 2].

К основным преимуществам фитопрепаратов перед синтетическими относятся широкий спектр действия, низкий уровень токсичности, минимизация развития побочных эффектов, возможность длительного применения и ценовая доступность. Кроме того, данными преимуществами объясняется лояльность людей пожилого возраста, страдающих хроническими заболеваниями, к фитопрепаратам [1].

Воспаление относится к фундаментальным патологическим процессам, которые составляют патофизиологическую основу многих заболеваний человека [7]. Социальная значимость воспалительных заболеваний постоянно растет во всем мире. Это определяет необходимость разработки новых противовоспалительных препаратов. Сложность разработки эффективных и в то же время безопасных средств для лечения воспаления заключается в том, что это поливалентный процесс со множеством альтернативных и перекрещивающихся путей, существующих как на уровне внутриклеточных взаимодействий сигнальных каскадов, так и на уровне регуляции продукции медиаторов воспаления. В соответствие с этим, влияние только на одну мишень патогенеза либо не сопровождается достаточным фармакологическим эффектом, либо вызывает ряд побочных явлений. Таким образом, существует необходимость создания новых препаратов, способных регулировать функциональную активность не одной, а многих молекул, воздействующих на все этапы воспаления [6]. К таковым можно отнести растительные препараты, действие которых основано на множестве входящих в них суммы биологически активных веществ.

В качестве эффективных противовоспалительных издавна применяются лекарственные препараты на основе растительного сырья.

Так противовоспалительным действием обладают официнальные виды сырья - цветки ромашки аптечной, цветки календулы лекарственной, цветки липы, заготавливаемые от растений липы сердцевидной и липы широколистной, почки сосны обыкновенной, трава и цветки тысячелистника обыкновенного, трава череды трехраздельной, листья шалфея лекарственного, листья эвкалипта прутовидного. Основными биологически активными веществами этих растений, обеспечивающие противовоспалительный эффект, являются фенольные соединения (флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, дубильные вещества), эфирные масла.

Известен «Способ получения средства, обладающего противовоспалительной активностью» [Патент РФ №2637414. Авторы Пупыкина К.А., Казеева А.Р. и др.]. Способ заключается в следующем: измельченную до размера частиц 2,0 мм траву кровохлебки лекарственной троекратно экстрагируют при 90°С спиртом этиловым 70%-ным, полученное извлечение фильтруют, упаривают, концентрируют и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Средство проявляет противовоспалительную активность за счет дубильных веществ, которые при взаимодействии с воспаленной поверхностью, обеспечивают ее уплотнение и активное уменьшение площади воспалительного процесса.

Показан противовоспалительный эффект многокомпонентного средства «Лекарственное средство, обладающее противовоспалительным действием» [Патент RU №2636818, авторы Карнопольцева Т.В., Ботоева Е.А., Асеева Т.А.]. Лекарственное средство представляет собой полиэкстракт, состоящий из сухих экстрактов плодов облепихи крушиновидной, плодов перца длинного, корней солодки уральской, корней мордовника широколистного, плодов яблони ягодной, взятых в соотношении, массовых частей 2:2:1:1:1, полученных определенным способом. Данное лекарственное средство получено путем смешивания предварительно полученных сухих экстрактов из перечисленных видов растительного сырья. В данном случае высока вероятность развития побочных эффектов в виде аллергических реакций при непереносимости компонентов, а также с учетом противопоказаний при приеме препаратов корня солодки, плодов облепихи в случае наличия таких заболеваний как хронический гепатит, болезни печени с холестазом, циррозе печени, а также в детском возрасте [Справочник Видаль. Лекарственные средства, 2020].

Наиболее близким является способ получения растительного многокомпонентного средства, обладающего противовоспалительной активностью, состоящее из черных листьев бадана, цветков ромашки аптечной, листьев мяты и травы тысячелистника обыкновенного [патент РФ №2331429. Авторы Лубсандоржиева П.-Н. Б., Ажунова Т.А. и др.]. Средство представляет собой сухой экстракт, полученный из растительного сырья черных листьев бадана, цветков ромашки аптечной, листьев мяты и травы тысячелистника обыкновенного (в соотношении 3:2,8:2,4:1,8). Полученный сухой экстракт содержит полифенолы (9,77%), каротиноиды (16,29 мг %), аскорбиновую кислоту (6,58 мг %), флавоноиды (0,14%), антоцианы (1,35%). Недостатками данного способа являются: необходимость использования четырех разных видов растительного сырья, при этом физико-химические свойства биологических соединений этих растений могут мешать выделению основной группы биологически активных веществ, обеспечивающих противовоспалительный эффект (флавоноидов и таннинов); применение поэтапной экстракции со сменой экстрагента - первоначально при комнатной температуре используется спирт этиловый 80%-ный с последующим экстрагированием в течение 2 часов дважды, затем - при температуре 90±5°С спирт этиловый 40%-ный, экстракцию сырья проводят в течение часа дважды. На первом этапе в случае применения 80% спирта этилового происходит преимущественно выход лиофобных компонентов - каротиноидов и хлорофилла. Хлорофилл содержится в листьях мяты, траве тысячелистника и хорошо извлекается 80% спиртом этиловым. В процессе получения экстракта сухого присутствие хлорофилла затрудняет проведение стадии очистки и сушки. На этапе экстрагирования при высокой температуре наблюдается значительное снижение содержания термолабильных биологически активных веществ, а также изменение их химической структуры. Использование данных способов снижает эффективность экстракции и выход действующих веществ в готовый продукт.

Экстракт сухой является одной из лекарственных форм, которая характеризуется высоким содержанием суммы биологически активных веществ. Экстракт сухой представляет собой концентрированную вытяжку из растительного сырья в виде порошка, обладающего хорошей сыпучестью, с содержанием остаточной влаги не более 5%. Экстракты сухие имеют выгодные отличительные особенности в сравнении с другими лекарственными формами - настойками, жидкими экстрактами и водными извлечениями. В сухих экстрактах отсутствует спирт, что позволяет значительно расширить область применения. Кроме того, они содержат больше биологически активных веществ и минимальное количество балластных, удобны при дозировании и применении, имеют большой срок годности за счет низкой контаминации.

Задачей настоящего изобретения является расширение ассортимента противовоспалительных лекарственных средств на основе лекарственных растений с высоким содержанием биологически активных веществ.

Технический результат - упрощение способа за счет применения одного вида лекарственного растительного материала и одного экстрагента, увеличение содержания биологически активных веществ в целевом продукте и увеличение его выхода, повышение противовоспалительной активности путем большего антиэкссудативного эффекта, проявления пролиферативного действия, уменьшения степени повреждения ткани.

Технический результат обеспечивается трехступенчатой экстракцией 50% спиртом этиловым одного вида растительного материала, при температуре +60°С, при времени контакта фаз на первой ступени экстракции 90 минут, на второй 60 минут, на третьей ступени экстракции 30 минут, проведением стадии очистки объединенных водно-спиртовых извлечений, в концентрировании очищенного извлечения и получении сухого остатка.

Новым в достижении технического результата является то, что в качестве растительного материала применяется надземная часть - трава аистника цикутового (Erodium cicutarium). Аистник цикутовый является однолетним травянистым растением, имеет облиственные стебли высотой до 20 см, обычно с несколькими нежелезистыми и мелкими железистыми волосками. Листья черешковые, почти дважды перистые. Цветки состоят из 5 лепестков, окрас от розового до бордового, собраны в соцветие зонтик. Характерными являются плодики с окаймленной ямкой на верхушке и недлинным (2,5-4,5 см) носиком. Аистник цикутовый распространен практически по всей территории России, а также в Евразии и в Северной Африке. Надземные органы аистника цикутового, по нашим данным, содержат флавоноиды - рутин, гиперозид, цинарозид, кемпферол, лютеолин, кверцетин, фенолкарбоновые кислоты - хлорогеновая, кофейная, неохлорогеновая. В траве аистника цикутового количественное содержание биологически активных соединений, извлекаемых спиртом этиловым 50% составляет: сумма флавоноидов (в пересчете на рутин) - 2,16%, фенолкарбоновых кислот (в пересчете на хлорогеновую кислоту) - 3,16%, каротиноидов в (в пересчете на β-каротин) - 0,34%, аскорбиновой кислоты -0,4%.

Экспериментально установлены оптимальные параметры для процесса максимального выхода из травы аистника цикутового биологически активных веществ, определяющих противовоспалительную активность - флавоноидов и фенолкарбоновых кислот. Экстрагент - 50% спирт этиловый, который позволяет экстрагировать гликозиды и агликоны флавоноидов. Размер частиц сырья - 3 мм. Максимальный выход флавоноидов, фенолкарбоновых кислот и экстрактивных веществ происходит при использовании соотношения сырье-экстрагент 1:14. На выход биологически активных веществ и качество готового продукта значительное влияние оказывает температура и динамические процессы в экстракционной смеси. Оптимальной температурой процесса экстракции является температура +60°С, обеспечивающей наибольший выход и сохранность биологически активных веществ. Максимальный выход флавоноидов, фенолкарбоновых кислот и экстрактивных веществ из растительного сырья аистника цикутового происходит при первом контакте фаз 90 минут, втором - 60 минут, третьем - 30 минут (процесс экстракции осуществляется при перемешивании) (табл. 1).

На повышенное содержание основных биологически активных веществ в экстракте сухом аистника цикутового влияет проведение стадии очистки от балластных веществ отстаиванием объединенного спирто-водного извлечения при температуре +6°С в течение трех суток с последующим фильтрованием.

Получение экстракта сухого из травы аистника цикутового.

Пример.

Экстрагирование сырья осуществляли методом мацерации в динамических условиях с трехкратным контактом фаз при температурном режиме +60°С. При первом контакте фаз 10,0 г предварительно измельченного сырья до размера частиц 3,0 мм заливали 140 мл 50% спирта этилового. Экстракцию проводили в течение 90 минут. Полученное водно-спиртовое извлечение сливали через фильтр в сборник в объеме 110 мл, после чего восполняли потерю экстрагента в том же объеме (110 мл) 50% спирта этилового и переносили в экстрактор. Экстракцию при втором контакте фаз проводили при аналогичных условиях в течение 60 минут. Полученное водно-спиртовое извлечение сливали через фильтр в объеме 86 мл и переносили в сборник. При проведении третьего контакта фаз восполняли потерю растворителя в объеме 86 мл 50% спирта этилового и переносили в экстрактор, продолжали экстракцию еще в течение 30 минут. Сливали водно-спиртовое извлечение в объеме 83 мл, отжимая сырье. Объединенные водно-спиртовые извлечения выдерживали в течение 3 суток при температуре +6°С. Затем фильтровали через друк-фильтр, упаривали в вакуум-выпарном аппарате, сепарировали. Сушку полученного объединенного извлечения осуществляли при температурном режиме +50°С в течение 8 часов. Сухой остаток содержал остаточное количество влаги 4,8%, его измельчали, просеивали до однородного сыпучего состояния.

Экстракт сухой аистника цикутового представляет собой порошок светло-коричневого цвета, количественное содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин составляет 5,52%, суммы фенолкарбоновых кислот в пересчете на хлорогеновую кислоту - 6,57%, каротиноидов в пересчете на β-каротин - 0,51%, аскорбиновой кислоты - 0,77%. Выход экстракта сухого от сырья составляет 37,88±1,50%. По данной технологической схеме дополнительно из 3-х партий сырья аистника цикутового были получены три серии экстракта сухого с содержанием суммы флавоноидов - 5,47%, 5,71%, 5,59%; фенолкарбоновых кислот - 6,46%, 6,54%, 6,91%; каротиноидов - 0,47%, 0,41%, 0,48%; аскорбиновой кислоты - 0,74%, 0,72%, 0,77%. Рекомендуемое минимальное значение биологически активных веществ, обеспечивающих противовоспалительную активность экстракта сухого аистника цикутового: суммы флавоноидов не менее 5%, фенолкарбоновых кислот не менее 6%.

Фармакологические исследования противовоспалительной активности полученного экстракта сухого аистника цикутового проведены в соответствии с документами «Об утверждении правил лабораторной практики» (МЗ РФ, приказ от 19 июня 2003 г. №267), Good Laboratory Practice for Nonclinical Laboratory Studies (FDA, 21 CFR Part 58, 22.12.1978), OECD Principles on Good Laboratory Practice (OECD, ENV/ МС/ CHEM (98) 17, 1977). Оценка результатов обработана статистически и представлена в виде «средняя величина (М) ± средняя квадратичная ошибка (m)». Достоверность устанавливалась согласно t-критерию Стьюдента [3].

Эксперименты проведены на 90 белых крысах линии Wistar обоего пола массой 180-200 г. Для экспериментов отбирали животных со средней двигательной активностью, преобладающих в популяции, проявляющие наиболее типичные реакции на любое воздействие. Животных содержали в условиях вивария (с естественным режимом освещения; при температуре 22-24°С), а также, свободным доступом к воде и пище. Перед экспериментом животные проходили карантин в течение 10-14 дней [8].

Контрольная группа животных получала воду. Экспериментальная группа получала экстракт сухой в дозе 150 мг/кг, который перед введением растворяли в воде. Воду и исследуемый препарат вводили внутрижелудочно с помощью специального зонда в объеме 2 мл. Исследования противовоспалительной активности сводились к оценке влияний их на экссудативную фазу воспаления по Ю.Е. Стрельникову [9] (первая серия опытов), на фазу пролиферации - по Ф.П. Тринусу [4] (вторая серия опытов) и на процесс альтерации - по И.А. Ойвину [5] (третья серия опытов).

В первой серии опытов антиэкссудативное действие изучали на модели острого воспалительного отека. Отек вызвали субплантарным введением в заднюю лапку крыс 0,1 мл 2% водного раствора формалина. Изучаемый экстракт и воду вводили животным за 2 часа до введения и через 5 и 18 часов после введения формалина. Измерение объема лапок проводили с помощью онкометра. Активность выражали в процентах угнетения отека.

Во второй серии опытов изучали влияние на процессы пролиферации. Для этого имплантировали стерильные ватные шарики массой около 15 мг под кожу крыс в области спины в асептических условиях. Изучаемый экстракт и воду вводили крысам 1 раз в сутки в течение 7 дней. Через 7 суток гранулемы извлекали и устанавливали разницу в массе до и после высушивания. Взвешивание производили на аналитических весах, высушивали шарики при температуре 70°С в течение 24 часов (до постоянного веса).

В третьей серии опытов изучали влияние на процессы альтерации и регенерации в очаге воспаления. Воспаление инициировали путем подкожного введения 0,5 мл 9% раствора уксусной кислоты в область спины крыс с предварительно выстриженной шерстью. При этом одновременно вводился раствор декстрана внутрибрюшинно в дозе 300 мг/кг. Первое введение исследуемого экстракта и воды осуществляли за 1 час до введения 9% раствора уксусной кислоты, затем ежедневно 1 раз в сутки в течение 25 дней. На 9 и 25 сутки эксперимента рассчитывали площадь некротизированной ткани путем нанесения контура некроза на прозрачную пленку.

В результате исследований установлено, что экстракт сухой аистника цикутового в первой серии опытов снижает формалиновый отек на 25% эффективнее, чем в контрольной группе, что указывает на антиэкссудативное действие (табл. 3).

Во второй серии опытов на фоне введения животным изучаемого сухого экстракта наблюдали отграничение очага асептического воспаления и стимуляцию грануляционной ткани на 7 сутки. Масса сухой гранулемы сформировавшейся вокруг стерильного шарика больше на 15,2%, чем в контрольной группе животных (табл. 3).

В третьей серии экспериментов установлено, что исследуемый сухой экстракт уменьшает степень повреждения ткани. В частности, на 9 сутки у крыс, получавших исследуемый сухой экстракт, площадь некротизированной ткани была на 13% меньше, чем у крыс контрольной группы. Экстракт сухой аистника цикутового стимулирует регенераторные процессы, следствием чего являлось уменьшение площади альтерации на 25 сутки опыта на 26,5% по сравнению с контролем (табл. 4).

Таким образом, изучаемый экстракт сухой аистника цикутового обладает противовоспалительной активностью.

Литература

1. Акамова, А.В. Многовекторный маркетинговый анализ российского рынка фитопрепаратов / А.В. Акамова, О.Д. Немятых, И.А. Наркевич // Разработка и регистрация лекарственных средств. - 2017. - №4(21). - С. 276-280.

2. Бойко Н.Н. и др. Фитопрепараты, анализ фармацевтического рынка Российской Федерации // Научные результаты биомедицинских исследований. - 2017. - Т. 3. - №. 4. - С. 30-38.

3. Медик В.А. Статистика в медицине и биологии: руководство в 2-х томах. / Медик В.А., Токмачев М.С., Фишман Б.Б.; под ред. Ю.М. Комарова; Москва: Медицина, 2000-2001. Т. 1: Теоретическая статистика. - 455 с: Т. 2: Прикладная статистика здоровья. - 352 с.

4. Нестероидные противовоспалительные средства: монография / Ф.П. Тринус, Н.А. Мохорт, Б.М. Клебанов. - Киев: Здоров'я, 1975. - 240 с.

5. Ойвин И.А., Шетель С.Л. Методика изучения местных нарушений капиллярной проницаемости // Материалы по патогенезу воспаления и патологии белков крови. - Душанбе, 1961. - 49. - №5. - 167 - 173.

6. Рыдловская А.В. Противовоспалительные свойства нового растительного препарата артрофлекс и анализ механизма его действия: дис. - Институт токсикологии, 2007.

7. Серебренникова С.Н. и др. Воспаление - фундаментальный патологический процесс: Лекция 2 (Клеточные реакции) // Байкальский медицинский журнал. - 2023. - Т. 2. - №. 2. - С. 53-64.

8. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М, 2005. - 832 с.

9. Стрельников Ю.Е. Сравнительная характеристика противовоспалительного действия некоторых пиримидиновых производных // Фармакология и токсикология - 1969. - №6. - С. 526-531.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения растительного средства, обладающего противовоспалительным действием. Способ получения растительного средства, обладающего противовоспалительным действием, путем экстрагирования растительного материала водно-спиртовым раствором методом дробной мацерации при перемешивании, удаления экстрагента и получения сухого остатка, отличается тем, что в качестве растительного материалы применяют траву аистника цикутового с размером частиц сырья 3 мм, экстрагирование проводят трехэтапно 50% спиртом этиловым при соотношении сырье:экстрагент 1:14 и температуре +60°С, время контакта фаз: первый - 90 минут, второй - 60 минут, третий - 30 минут, отстаивание объединенного водно-спиртового извлечения осуществляют при температуре +6°С в течение 3-х суток, проводят измельчение и просеивание сухого остатка, сухой остаток содержит суммы флавоноидов не менее 5%, суммы фенолкарбоновых кислот не менее 6%. Указанный способ позволяет упростить способ за счёт применения одного вида лекарственного растительного материала и одного экстрагента, увеличить содержание биологически активных веществ в целевом продукте и его выход, повысить противовоспалительную активность средства путем большего антиэкссудативного эффекта, проявления пролиферативного действия, уменьшения степени повреждения ткани. 4 табл., 1 пр.

Способ получения растительного средства, обладающего противовоспалительным действием, путем экстрагирования растительного материала водно-спиртовым раствором методом дробной мацерации при перемешивании, удаления экстрагента и получения сухого остатка, отличающийся тем, что в качестве растительного материала применяют траву аистника цикутового с размером частиц сырья 3 мм, экстрагирование проводят трехэтапно 50% спиртом этиловым при соотношении сырье:экстрагент 1:14 и температуре +60°С, время контакта фаз: первый - 90 минут, второй - 60 минут, третий - 30 минут, отстаивание объединенного водно-спиртового извлечения осуществляют при температуре +6°С в течение 3-х суток, проводят измельчение и просеивание сухого остатка, сухой остаток содержит суммы флавоноидов не менее 5%, суммы фенолкарбоновых кислот не менее 6%.