Область техники
Настоящее изобретение относится к способу получения пуриновых нуклеозидов, таких как инозин, ксантозин и гуанозин, которые являются важными исходными реагентами для синтеза инозин-5'-фосфата, ксантозин-5'-фосфата и гуанин-5'-фосфата, и к новому микроорганизму, используемому для их продукции.
Предшествующий уровень техники
Традиционно пуриновые нуклеозиды (инозин, гуанозин, ксантозин) получают в промышленном масштабе методом ферментации с использованием штаммов, ауксотрофных по аденину, или этих же штаммов, которым в дальнейшем была придана устойчивость к различным соединениям, таким как пуриновые аналоги, сульфасоединения, аналоги метионина, антифолатные и полимиксиновые соединения и которые принадлежат либо к роду Bacillus (опубликованные патентные заявки Японии №38-23039 (1963), 54-17033 (1979), 55-2956 (1980) и 55-45199 (1980), выложенные патентные заявки Японии №56-162998 (1981), опубликованные патентные заявки Японии №57-14160 (1982) и 57-41915 (1982), выложенные патентные заявки Японии №59-42895 (1984), патентная заявка РФ №2002103333), либо к роду Brevibacterium (опубликованная патентная заявка Японии №51-5075 (1976) и 58-17592 (1972) и Agric.Biol.Chem., 42, 399 (1978)), либо к роду Escherichia (заявка РСТ W 09903988) и подобные им.
Получение указанных мутантных штаммов обычно состоит из обработки микроорганизмов мутагенными дозами ионизирующего излучения (УФ-излучение, рентгеновское излучение, гамма-излучение) и отбора нужного штамма с использованием соответствующей среды для селекции.
Добавление L-пролина в среду для ферментации усиливало продукцию инозинмонофосфата (ИМФ) штаммом-продуцентом ИМФ Corynebacterium ammoniagenes (Agr. Biol. Chem., 55, 2221-2225, (1991)). Более того, мутантные штаммы, устойчивые к 3,4-дегидро-DL-пролину, и, как предполагается, содержащие гамма-глутамилкиназу (первый фермент пути биосинтеза L-пролина), устойчивую к ингибированию L-пролином по принципу обратной связи, обладают более высокой продуктивностью ИМФ.
Увеличение продуктивности мутантных штаммов коррелировало с ростом концентрации L-пролина внутри клетки (Biosci. Biotech. Biochem., 56, 1347-1348, (1992)).
Способ продукции 5'-инозиновой кислоты штаммами Corynebacterium ammoniagenes, устойчивыми к 3,4-дегидро-DL-пролину, раскрыт (патентная заявка США 20030054504 А1).
Способ продукции 5'-ксантиловой кислоты штаммами Corynebacterium ammoniagenes, устойчивыми к 3,4-дегидро-DL-пролину, также раскрыт (патентная заявка США 20030148498 А1).
Способ получения рибофлавина штаммами Bacillus subtilis, устойчивым к аналогам пролина, таким как 3,4-дегидро-DL-пролин, раскрыт (патентная заявка США 20040110249 А1).
Однако в настоящее время отсутствуют какие-либо сообщения об использовании бактерий, принадлежащих к роду Bacillus и устойчивых к 3,4-дегидро-DL-пролину, для получения пуриновых нуклеозидов, таких как инозин, ксантозин и гуанозин.
Описание изобретения
Целью настоящего изобретения является увеличение продуктивности пуриновых нуклеозидов штаммами-продуцентами пуриновых нуклеозидов и предоставление способа получения пуриновых нуклеозидов, например инозина или гуанозина, с использованием указанных штаммов.
Для достижения этой цели авторы настоящего изобретения изучали бактерии-продуценты инозина и установили, что микроорганизмы, принадлежащие к роду Bacillus и несущие мутацию, которая придает бактериальной клетке устойчивость к 3,4-дегидро-DL-пролину, продуцируют и накапливают значительно большее количество пуриновых нуклеозидов в среде. Ранее не было общепризнанным, что продуктивность пуриновых нуклеозидов может быть улучшена в результате наделения микроорганизмов-продуцентов пуриновых нуклеозидов такими свойствами.
Поэтому для завершения настоящего изобретения работа была продолжена на основании этого наблюдения.
Таким образом, настоящее изобретение предоставляет микроорганизм, принадлежащий к роду Bacillus и обладающий повышенной способностью к продукции пуринового нуклеозида.
В частности, настоящее изобретение предоставляет микроорганизм, чья способность продуцировать пуриновый нуклеозид улучшена за счет мутации, придающей клеткам устойчивость к 3,4-дегидро-DL-пролину.
Далее настоящее изобретение предоставляет способ получения пуринового нуклеозида методом ферментации, включающей культивирование вышеупомянутого микроорганизма в питательной среде с целью продукции и накопления пуринового нуклеозида в среде и сбор пуринового нуклеозида.
ОПИСАНИЕ НАИБОЛЕЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение подробно описывается ниже.
(1) Бактерия-продуцент пуринового нуклеозида принадлежит к роду Bacillus.
Бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия-продуцент пуринового нуклеозида, принадлежащая к роду Bacillus и обладающая устойчивостью к 3,4-дегидро-DL-пролину.
Термин "бактерия-продуцент пуринового нуклеозида" означает бактерию, которая обладает способностью к продукции и выделению в питательную среду значительного количества пуринового нуклеозида в процессе выращивания бактерии в среде. Обычно это означает способность к накоплению не менее чем 50 мг/л пуринового нуклеозида в среде, предпочтительно не менее чем 0,5 г/л пуринового нуклеозида в условиях, описанных в Примерах (см. ниже).
Термин "пуриновый нуклеозид", используемый здесь, включает инозин, ксантозин, аденозин и гуанозин.
Термин "бактерия принадлежит к роду Bacillus" означает, что бактерия классифицируется как род Bacillus согласно классификации, известной специалисту в области микробиологии. Примерами микроорганизма, принадлежащего к роду Bacillus, использованного в настоящем изобретении, являются Bacillus subtilis (В. subtilis) и Bacillus amyloliquefaciens (В. amyloliquefaciens), но не ограничивается ими.
Примеры бактерий, принадлежащих к роду Bacillus, включают, но не ограничиваются ими, штамм Bacillus subtilis 168 Marburg (ATCC 6051), штамм Bacillus subtilis PY79 (Plasmid, 1984, 12, 1-9) и так далее, а примеры Bacillus amyloliquefaciens включают, но не ограничиваются ими, штамм Bacillus amyloliquefaciens Т (ATCC 23842), штамм Bacillus amyloliquefaciens N (ATCC 23845) и так далее.
Термин "бактерия, обладающая устойчивостью к ингибированию роста 3,4-дегидро-DL-пролином" означает бактерию, полученную из родительского штамма и обладающую генетическими свойствами, модифицированными таким образом, что она может расти в питательной среде, содержащей в своем составе 3,4-дегидро-DL-пролин. Твердая среда является предпочтительной.
Бактерия, принадлежащая к роду Bacillus, может быть также получена путем придания способности к продукции пуринового нуклеозида бактерии, модифицированной таким образом, что ингибирование роста 3,4-дегидро-DL-пролином снижено, что приводит к улучшению способности к продукции пуринового нуклеозида.
Бактерия, которая обладает устойчивостью к подавлению роста 3,4-дегидро-DL-пролином, проявляет лучшие ростовые качества по сравнению с родительским штаммом, когда культивируется в среде, содержащей 3,4-дегидро-DL-пролин. Например, бактерия, которая может образовывать колонии в течение 40 часов культивирования при температуре 34°С в чашках с минимальной средой М9, содержащей 0,4 г/л или более, предпочтительно 1,6 г/л 3,4-дегидро-DL-пролина, может считаться устойчивой к 3,4-дегидро-DL-пролину.
Вдобавок к уже упомянутым свойствам, бактерия может обладать другими специфическими свойствами, такими как потребность в различных питательных добавках, устойчивость или чувствительность к химическим реагентам и зависимость от химических соединений, не выходя при этом за границы настоящего изобретения.
Мутантные микроорганизмы, используемые в осуществлении настоящего изобретения, могут быть получены с помощью воздействия обычных мутагенных факторов, таких как УФ-облучение, рентгеновское облучение, радиоактивное облучение и обработки химическими мутагенами с последующим отбором методом реплик. Предпочтительным мутагеном является N-нитро-N'-метил-N-нитрозогуанидин (здесь и далее обозначается как НТГ).
Примеры способов выведения бактерии, принадлежащей к роду Bacillus и обладающей способностью к продукции пуринового нуклеозида, включают следующие способы. Например, способы, предусматривающие усиление внутриклеточной активности фермента, включенного в биосинтез пуринового нуклеозида (патентная заявка США 2004-0166575). Выражение "усиление внутриклеточной активности" означает усиление активности до уровня, более высокого, чем уровень в немодифицированной бактерии рода Bacillus, такой как дикий штамм бактерии Bacillus. Примеры включают, но не ограничиваются только ими, увеличение количества молекул фермента на одну клетку, усиление специфической активности на одну молекулу фермента и так далее.
Примеры фермента, участвующего в биосинтезе пуринового нуклеозида, включают, например, фосфорибозилпирофосфат (ФРПФ) амидотрансферазу, фосфорибозилпирофосфат (ФРПФ) синтетазу, аденозиндеаминазу и так далее.
Кроме того, примеры включают также снятие регуляции фермента, участвующего в биосинтезе инозина, особенно метод снятия ингибирования такого фермента по принципу обратной связи (WO 99/03988). Примеры способов снятия регуляции такого фермента, как отмечалось выше, участвующих в биосинтезе пуринового нуклеозида, включают, например, делецию пуринового репрессора (патент США №6284495). Примеры метода делеции пуринового репрессора включают метод разрушения гена, кодирующего пуриновый репрессор (purR, GenBank Accession No.Z99104).
Кроме того, способность к продукции пуринового нуклеозида может также быть усилена путем блокирования реакции, ответвляющейся от пути биосинтеза инозина и приводящей к другому метаболическому продукту (WO 99/03988). Примеры реакции ответвления от пути биосинтеза пуринового нуклеотида, приводящей к другому метаболическому продукту, включают реакции, катализируемые, к примеру, сукцинил-аденозин монофосфат (АМФ) синтетазой, инозин-гуанозинкиназой, 6-фосфоглюконатдегидразой, фосфоглюкоизомеразой и так далее. Сукцинил-аденозин монофосфат (АМФ) синтетаза кодируется геном purA (GenBank Accession No.Z99104).
Кроме того, способность к продукции пурина может быть также усилена путем снижения или удаления активности, вызывающей деградацию пуринового нуклеозида (WO 99/03998). Примеры такого метода снижения или удаления активности, вызывающей деградацию пуринового нуклеозида, включают метод разрушения гена, кодирующего фосфорилазу пуринового нуклеозида (ген deoD).
Таким образом, возможно подвергнуть любой известный штамм, принадлежащий к роду Bacillu и уже обладающий способностью к продукции пуринового нуклеозида, одной из вышеперечисленных процедур мутагенеза для получения мутантного штамма и затем протестировать мутантный штамм для того, чтобы определить, удовлетворяет ли он вышеперечисленным требованиям настоящего изобретения, касающегося устойчивости к подавлению роста 3,4-дегидро-DL-пролином, и поэтому пригодным для использования в настоящем изобретении. Полученные штаммы отбираются в процессе выращивания в питательной среде и штаммы, обладающие способностью к продукции пуринового нуклеозида в большем количестве, чем его родительский штамм, отбираются и используются в этом изобретении.
Штаммы, удовлетворяющие требованиям настоящего изобретения, могут быть получены также с помощью техники генетической рекомбинации, которая хорошо известна специалисту в данной области техники.
Вышеупомянутые свойства устойчивости могут комбинироваться в одном штамме с помощью последовательной селекции или техники генетической рекомбинации.
(2) Конкретные примеры бактерий, продуцирующих пуриновые нуклеозиды.
В качестве примеров микроорганизмов, принадлежащих к роду Bacillus и использованных в настоящем изобретении, должны быть отмечены Bacillus subtilis (В. subtilis), Bacillus amyloliquefaciens и подобные им. Типичными примерами штаммов, практически использованных в изобретении, являются Bacillus subtilis 43-142K (VKPM B-8998), Bacillus amyloliquefaciens 36-59H (VKPM B-8995). Штаммы Bacillus subtilis 43-142K и Bacillus amyloliquefaciens 36-59H были депонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 10 марта 2005 года с регистрационными номерами VKPM B-8998 и VKPM B-8995,соответственно.
Бактерия, которую предполагается использовать для продукции пуринового нуклеозида в соответствии с настоящим изобретением, имеет те же бактериологические свойства, что и родительский штамм за исключением устойчивости к 3,4-дегидро-DL-пролин и способности продуцировать большее количество пуринового нуклеозида. Штаммы Bacillus subtilis 51-53H и Bacillus amyloliquefaciens 23-68H были депонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 10 марта 2005 года с регистрационными номерами VKPM B-8997, VKPM B-8996, соответственно.
В качестве родительских штаммов, которые необходимо улучшить для получения бактерии, в настоящем изобретении могут быть использованы бактериальные штаммы-продуценты инозина, принадлежащие к роду Bacillus, такие как штамм Bacillus subtilis AJ12707 (FERM Р-12951) (патентная заявка Японии JP 6113876), штамм Bacillus subtilis AJ3772 (FERM-P 2555) (патентная заявка Японии JP 62014794), Bacillus pumilus NA-1102 (FERM BP-289), Bacillus subtilis NA-6011 (FERM BP-291), Bacillus amyloliquefaciens ("Bacillus subtilis") G 1136 A (ATCC No.19222) (патент США 3575809), Bacillus subtilis NA-6012 (FERM BP-292) (патент США 4701413), В. pumilis Gottheil No.3218 (ATCC No.21005) (патент США 3616206), штамм В. amyloliquefaciens AS 115-7 (VKPM B-6134) (патент РФ №2003678) или подобные им. Also the В. subtilis strain KMBS16 may be used. This strain is a derivative of the known B. subtilis 168 trpC2 strain having mutations introduced intopurR gene coding for a purine represser (purR::spc), purA gene coding for succinyl-AMP synthase (purA::erm), and deoD gene coding for purine nucleoside phosphorylase (deoD::kan) (Russian Patent application No 2002103333).
(3) Метод придания бактериям рода Bacillus свойства снижать ингибирующее влияние 3,4-дегидро-DL-пролина.
Далее будет дано объяснение снижению ингибирующего влияния 3,4-дегидро-DL-пролина на рост бактерий рода Bacillus. Если в среде присутствует 3,4-дегидро-DL-пролин, то рост бактерий рода Bacillus ингибируется. Это означает, что если бактерии рода Bacillus культивируются в среде, содержащей 3,4-дегидро-DL-пролин, то бактерии не будут расти или их рост замедлится по сравнению с бактериями, которые культивируются в среде, не содержащей 3,4-дегидро-DL-пролин. В особенности, когда бактерии культивируются в твердой среде определенный период времени, диаметр колоний, к примеру, становится меньше в среде, содержащей 3,4-дегидро-DL-пролин, по сравнению с диаметром колоний, наблюдаемых в среде, не содержащей 3,4-дегидро-DL-пролин. С другой стороны, бактерии рода Bacillus согласно настоящему изобретению модифицированы таким образом, что вышеупомянутое ингибирование роста 3,4-дегидро-DL-пролином снижено.
У таких бактерий рода Bacillus, модифицированных таким образом, что ингибирование роста 3,4-дегидро-DL-пролином снижено как описано выше, способность продуцировать пуриновые нуклеозиды улучшена по сравнению с немодифицированным штаммом. Поэтому свойство 3,4-дегидро-DL-пролина может быть применено для выращивания бактерий рода Bacillus, продуцирующих пуриновые нуклеозиды. То есть, бактерии рода Bacillus, обладающие улучшенной способностью продуцировать пуриновый нуклеозид, могут быть получены путем отбора штаммов, проявляющих удовлетворительные ростовые качества в среде, содержащей 3,4-дегидро-DL-пролин, из популяции бактерий рода Bacillus и отбора из полученных штаммов штамма с высокой способностью к продукции пуринового нуклеозида.
Бактерия рода Bacillus в настоящем изобретении может быть получена как мутантный штамм, выведенный из бактерии рода Bacillus, выступающей в качестве родительского штамма. Мутагенная обработка для получения такого мутантного штамма не ограничена каким-либо образом и примеры поэтому включают, но не ограничиваются, обработкой УФ-облучением или обработкой мутагенным агентом, используемым для обычной мутагенной обработки, такими как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (НТГ) и азотистая кислота. Кроме того, могут быть также получены спонтанно-возникающие мутации.
Мутантный штамм, в котором ингибирование роста 3,4-дегидро-DL-пролином снижено, отбирается как штамм, проявляющий более успешные ростовые качества по сравнению с немодифицированным штаммом, например родительским штаммом, когда они культивируются в среде, содержащей, к примеру, 3,4-дегидро-DL-пролин. То есть, можно сказать, что у бактерии рода Bacillus в настоящем изобретении чувствительность к 3,4-дегидро-DL-пролину снижена или устойчивость к 3,4-дегидро-DL-пролину улучшена по сравнению с родительским штаммом.
Примеры вышеупомянутой среды включают минимальные среды, но не ограничиваются ими. Примеры минимальных сред включают, в частности, минимальную среду М9 (Sambrook, J., Fritsch E.F. and Maniatis T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).
В настоящем изобретении минимальная среда может содержать, если необходимо, питательные вещества, требующиеся для роста. Например, многие из инозинпродуцирующих бактериальных штаммов являются ауксотрофными по аденину, и поэтому аденин добавляется в среду в концентрации, необходимой для роста. Однако, если количество аденина слишком велико, продуктивность бактерии-продуцента инозина может быть снижена и поэтому количество аденина желательно ограничить. Более точно, концентрация около 0.1 г/л является предпочтительной.
Отбор целевого мутантного штамма или оценка подавления роста 3,4-дегидро-DL-пролином для полученного мутантного штамма может проводиться как в жидкой, так и в твердой среде. В случае использования твердой среды, к примеру, мутантный штамм и родительский штамм выращиваются в жидкой среде до достижения ими логарифмической фазы роста или стационарной фазы роста, затем культуральный бульон разводится средой, содержащей раствор хлорида натрия или подобным раствором, полученная клеточная суспензия переносится на твердую среду, содержащую 3,4-дегидро-DL-пролин, и мутантный штамм и родительский штамм культивируются в одинаковых условиях. Инкубация обычно проводится при температуре, близкой к оптимальной температуре роста, например 34°С, от одного до трех дней. Затем, если колонии мутантного штамма, которые появились, больше по размеру, чем колонии родительского штамма, это может быть расценено как то, что рост мутантного штамма более успешный, чем рост родительского штамма и ингибирование роста 3,4-дегидро-DL-пролином у него снижено. Количество 3,4-дегидро-DL-пролина, добавляемого в среду, составляет, к примеру, 0.4 г/л или более, предпочтительно около 1.6 г/л.
Более того, при использовании жидкой среды клеточные суспензии мутантного штамма и родительского штамма культивируются и разводятся тем же способом, как описано ранее и каждый переносится в жидкую среду, содержащую 3,4-дегидро-DL-пролин и клетки культивируются при температуре, приближенной к оптимальной температуре роста, например 34°С, от нескольких часов до одного дня, предпочтительно около 6 часов. Количество 3,4-дегидро-DL-пролина, добавленного к среде, к примеру, 0.4 г/л или более. Затем, если мутантный штамм проявляет более высокую оптическую плотность (OD) или мутность среды, по крайней мере, либо в логарифмической фазе роста, либо в стационарной фазе роста, по сравнению с родительским штаммом, это расценивается как то, что рост является успешным. Более точно, если клетки быстрее достигают логарифмической фазы роста или если максимальное значение OD является более высоким, то рост более успешен. Вышеупомянутая логарифмическая фаза роста означает период, в который количество клеток логарифмически увеличивается на кривой роста. Стационарная фаза означает период после окончания логарифмической фазы роста, когда деление и рост клеток останавливается и увеличение количества клеток больше не наблюдается (Dictionary of Biochemistry, 3rd Edition, Tokyo Kagaku Dojin).
При использовании жидкой среды выявить различие в ингибирование роста 3,4-дегидро-DL-пролином может быть более трудно, чем при использовании твердой среды. В настоящем изобретении даже, если различие в ингибирование роста 3,4-дегидро-DL-пролином не может быть выявлено с использованием жидкой среды, мутантным штаммом является штамм, проявляющий успешный рост, как отмечалось в настоящем изобретении, при условии, что установлено, что этот мутантный штамм обладает более успешным ростом на твердой среде по сравнению с родительским штаммом.
Более того, степень подавления роста 3,4-дегидро-DL-пролином может также быть оценена путем перенесения суспензии мутантного штамма на твердую среду, содержащую 3,4-дегидро-DL-пролин, и на твердую среду, не содержащую 3,4-дегидро-DL-пролин, и сравнения размера колоний, которые появляются после культивирования в тех же условиях, как описано ранее. Например, когда штамм KMBS16, содержащий три мутации в генах purR, pur А и deoD, полученный из штамма Bacillus subtilis 168 Marburg, культивировался в присутствии 3,4-дегидро-DL-пролина, относительная степень роста, рассчитанная согласно вышеупомянутому уравнению, не превышала 5% при сроке культивирования приблизительно 18 часов, тогда как мутантный штамм, полученный в разделе Примеры настоящего изобретения, проявлял относительную степень роста не более 50% при времени культивирования приблизительно 18 часов и при том же содержании 3,4-дегидро-DL-пролина. Более того, использование относительной степени роста в качестве индекса позволяет оценить ингибирование роста 3,4-дегидро-DL-пролином без процедуры сравнения с родительским штаммом. Однако ингибирование роста 3,4-дегидро-DL-пролином можно также оценить путем сравнения относительной степени роста родительского штамма и мутантного штамма.
(4) Метод получения пуринового нуклеозида путем ферментации микроорганизма, обладающего улучшенной способностью продуцировать пуриновый нуклеозид, описывается ниже.
Для продукции пуринового нуклеозида может быть использована обычная питательная среда, содержащая источник углерода, азота, неорганических ионов и других органических компонентов по необходимости. В качестве источника углерода могут быть использованы сахариды, такие как глюкоза, лактоза, галактоза, фруктоза, арабиноза, мальтоза, ксилоза, трехалоза, рибоза и гидролизаты крахмала; могут быть использованы спирты, такие как глицерол, маннитол и сорбитол; органические кислоты, такие как глюконовая кислота, фумаровая кислота, лимонная кислота и янтарная кислота и подобные им. В качестве источника азота может быть использованы неорганические соли аммония, такие как сульфат аммония, хлорид аммония и фосфат аммония; может быть использован органический азот, такой как гидролизат бобов сои, газ аммиак, жидкий аммиак и подобные им. Желательно, чтобы витамины, такие как витамин В1, необходимые компоненты, например, нуклеиновые кислоты, такие как аденин и РНК, или дрожжевой экстракт и подобные им, содержались в необходимых количествах, в качестве следовых количествах неорганических питательных веществ. В отличие от этих малые количества фосфата кальция, сульфата магния, ионов железа, ионов магния и подобные им могут быть добавлены по необходимости.
Инкубирование предпочтительно проводить в аэробных условиях в течение 16-72 часов и температура культуры в процессе культивирования контролируется в пределах от 30 до 45°С, а pH в пределах от 5 до 8. Значения pH могут достигаться с использованием неорганических или органических кислот или щелочных субстанций, таких как газ аммиак.
Пуриновый нуклеозид может быть извлечен из жидкости для ферментации любым методом или комбинацией обычных методов, таких как методы выделения на ионнообменных смолах и методы преципитация.
ПРИМЕРЫ
В дальнейшем, настоящее изобретение будет разъяснено более детально со ссылкой на следующие примеры, не ограничивающие рамки настоящего изобретения.
Пример 1. Отбор мутанта Bacillus subtilis штамма-продуцента инозина, устойчивого к 3,4-дегидро-DL-пролину.
3,4-Дегидро-DL-пролин является аналогом пролина, который, как известно, является ингибитором гамма-глутамилкиназы - первого фермента в биосинтезе L-пролина. Среди мутантов, устойчивых к аналогу, могут быть найдены мутанты, нечувствительные к ингибиции L-пролином по принципу обратной связи и избыточно продуцирующие L-пролин. Кроме того, были отобраны мутанты В. subtilis KMBS16, устойчивые к ингибиции роста реагентом.
Клетки штамма В. subtilis KMBS16 в количестве приблизительно 108 были помещены в минимальной среде М9 (Sambrook, J., Fritsch E.F. and Maniatis T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) в чашки с агаризованной средой (агар - 20 г/л), содержащей глюкозы - 2%, L-триптофана - 50 мг/л и 0.1 или 0.2 г/л 3,4-дегидро-DL-пролина (Fluka, Швейцария). Инокулированные чашки инкубировали при 34°С в течение 5 дней. Из числа появившихся колоний-спонтанных мутантов был выбран штамм Bacillus subtilis 43-142K (VKPMB-8998).
Устойчивость этого штамма, также как и родительского штамма к 3,4-дегидро-DL-пролину, оценивалась путем помещения их в агаризованную минимальную среду М9 с глюкозой, как описано выше, содержащую ступенчатую концентрацию аналога. Рост штаммов наблюдали через 40 часов (Таблица 1).
Как следует из Таблицы 1, мутантный штамм В. subtilis 43-142 K проявлял более высокий уровень устойчивости к 3,4-дегидро-DL-пролину по сравнению с родительским штаммом.
Пример 2: Влияние мутации, обуславливающей устойчивость к 3,4-дегидро-DL-пролину, на продукцию инозина штаммом-продуцентом инозина В. subtilis.
Штамм В. subtilis 43-142 K и родительский штамм В. subtilis KMBS16 каждый культивировали при температуре 34°С с аэрацией в течение 18 часов в L-бульоне. Затем 0.3 мл полученной культуры переносили в 3 мл среды для ферментации, имеющей следующий состав (см. ниже), в пробирки 20×200 мм и инкубировали при 34°С в течение 72 часов на роторной качалке.
Состав среды для ферментации: (г/л)
Глюкоза и сульфат магния стерилизовались раздельно. СаСО3 стерилизовали сухим жаром в режиме 180°С в течение 2 часов, рН доводили до 7.0.
После выращивания количество инозина и гуанозина, накопленного в среде, определяли с помощью ВЭЖХ. Образец культуральной среды (500 мкл) центрифугировали при 15000 об/мин в течение 5 минут, супернатант разводили в 100 раз водой и анализировали с помощью ВЭЖХ.
Условия анализа с помощью ВЭЖХ:
Колонка: Luna С18(2) 250×3 мм, 5u (Phenomenex, США). Буфер: 2% (v/v) C2H5OH; 0.8% (v/v) триэтиламин, 0.55% (v/v) уксусная кислота (ледяная), pH 4.5. Температура: 30°С. Скорость потока: 0.3 мл/мин. Объем пробы: 5 мкл. УФ-детектор: UV 250 нм.
Время удерживания (мин):
Результаты представлены в Таблице 2.
Как видно из Таблицы 2, штамм В. subtilis 43-142 накапливал больше инозина, чем родительский штамм.
Пример 3. Селекция и проверка мутантного штамма Bacillus amyloliquefaciens - продуцента инозина, устойчивого к 3,4-дегидро-DL-пролину.
Клетки штамма Bacillus amyloliquefaciens AS 115-7 в количестве приблизительно 108 были помещены в чашки с агаризованной средой М9, как в Примере 1, содержащей 0.1, 0,2 или 0.4 мг/л 3,4-дегидро-DL-пролина. Инокулированные чашки инкубировали при 34°С в течение 5 дней. Из числа появившихся колоний спонтанных мутантов был выбран штамм Bacillus amyloliquefaciens 36-59H (VKPM В-8995).
Штамм В. amyloliquefaciens 36-59H и родительский штамм В. amyloliquefaciens AS 115-7 каждый культивировали при температуре 34°С в течение 18 часов в L-бульоне. Затем 0.3 мл полученной культуры переносили в 3 мл среды для ферментации из Примера 2, содержащей 0.04 г/л гистидина и 0.04 г/л тирозина вместо триптофана, в пробирки размером 20×200 мм и культивировали при температуре 31°С в течение 72 часов на роторной качалке. После культивирования накопленное количество инозина в среде определяли с помощью ВЭЖХ как в Примере 2.
Состав среды для ферментации, г/л:
Глюкоза и сульфат магния стерилизовались раздельно. СаСО3 стерилизовали сухим жаром в режиме 180°С в течение 2 часов, рН доводили до 7.0.
Результаты представлены в Таблице 3.
Как видно из Таблицы 3, штамм В. amyloliquefaciens 36-59H, устойчивый к 3,4-дегидро-DL-пролину, накапливает больше инозина, чем родительский штамм.
Изобретение относится к биотехнологии. Инозин получают методом ферментации, который включает в себя выращивание бактерий-продуцентов инозина в питательной среде и выделение его из культуральной жидкости. В качестве продуцентов используют мутантные штаммы бактерий Bacillus subtilis ВКПМ-8998 и Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ-9789, обладающие устойчивостью к ингибированию роста 3,4-дегидро-DL-пролином. Полученные мутантные штаммы и способ позволяют продуцировать инозин с высоким выходом. 3 н.п. ф-лы, 3 табл.
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНОЗИНА И ИНОЗИН 5'-МОНОФОСФАТА, ШТАММ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ BACILLUS - ПРОДУЦЕНТ ИНОЗИНА (ВАРИАНТЫ) | 2002 |
|
RU2260040C2 |
| Переносная печь для варки пищи и отопления в окопах, походных помещениях и т.п. | 1921 |
|
SU3A1 |
