СРЕДСТВО ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ВИРУСНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ВИРУСНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2008 года по МПК A61K38/08 A61P31/12 

Изобретение относится к области медицины, к средствам профилактики и лечения инфекционно-вирусных заболеваний. Изобретение расширяет арсенал противовирусных (грипп, герпес) средств.

Задача расширения ассортимента противовирусных средств остается актуальной. До настоящего времени вирусные заболевания, такие как грипп и герпес, являются наиболее широко распространенными и плохо контролируемыми инфекциями. Актуальна и задача поиска новых средств с нежелательными побочными эффектами.

Известен эндогенный пептид общей формулы Thr-Lys-Pro-Arg - тафтсин, обладающий иммуномодулирующими свойствами (Tuftsin-endogenous immunomodulator. Postepy Biochem. 2000; 46(4):327-35). Однако данный пептид неустойчив и быстро подвергается энзиматической деградации. Несмотря на многочисленные исследования, создать лекарственный препарат на его основе не удалось.

Известен гептапептид «Селанк» общей формулы (I): Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro в качестве нейротропного средства; анксиолитик пептидной природы (патент РФ №2155065). Однако возможность его использования в качестве средства профилактики и лечения вирусных инфекций ранее не описана.

Известен способ профилактики и лечения вирусных инфекций, включающий применение лекарственного средства [Ридостин, Циклоферон, Даларгин, Амиксин, Гриппферон, Арбидол-Лэнс, Ацикловир-Акри. Большая Российская энциклопедия лекарственных средств, из-во Ремедиум, г.Москва, 2001 г., т.2, стр.186, 560, 748; Антивирусные препараты. 2006. www.rlsnet.ru. Регистр лекарственных средств; immunology.ru, Энциклопедия модуляторов, Ершов Ф.И. Противовирусные препараты// М., «ГЭОТАР-Медиа», 2006]. Однако данный известный способ не во всех случаях эффективен.

Техническим результатом, достигаемым при реализации настоящего изобретения, является расширение ассортимента противовирусных лекарственных средств, повышение эффективности профилактики и лечения вирусных инфекций.

Указанный технический результат достигается тем, что гептапетид «Селанк» общей формулы (I) Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro применяют в качестве средства профилактики и лечения инфекционных заболеваний вирусной этиологии (грипп, герпес). Достигается указанный технический результат также за счет того, что в способе профилактики и лечения вирусных инфекций, предусматривающем применение лекарственного средства, где в качестве лекарственного средства используют гептапептид «Селанк» формулы (I) Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro путем введения его в суточной дозе 100-200 мкг/кг.

Собственными исследованиями было установлено, что известное анксиолитическое средство «Селанк», положительно влияющее на мнестические и когнитивные функции мозга, обладающее положительным вегетотропным и анксиолитическим действием, способно подавлять репродукцию вируса гриппа А (штамм H3N2), вируса простого герпеса (ВПГ) 1 и 2 типов, вирус энцефаломиокардита мышей (ЕМС), вирус гриппа А птиц (штамм H5N1) и может быть применено для профилактики и лечения инфекционных заболеваний, вызванных данными вирусами, не оказывая при этом неблагоприятного побочного действия.

На фиг.1 представлена диаграмма, демонстрирующая влияние гептапептида «Селанк» формулы (I) в концентрациях 10^-6 М, 10^-7 М и 10^-8 М на репродукцию вируса гриппа A/Aichi 2/68 (штамм H3N2) в тест-культуре клеточной линии фибробластов почки собаки (MDCK).

На фиг.2 представлена диаграмма, демонстрирующая влияние внутрибрюшинного введения гептапептида «Селанк» формулы (I) в дозе 100 мкг/кг и 200 мкг/кг на выживаемость животных, зараженных вирусом гриппа A/Aichi 2/68 (штамм H3N2).

На фиг.3 представлена диаграмма, демонстрирующая влияние гептапептида «Селанк» формулы (I) в концентрациях 10^-6 М, 10^-7 М и 10^-8 М на репродукцию вируса простого герпеса 2 типа (ВПГ-2) в тест-культуре клеток почки африканской зеленой мартышки (VERO).

На фиг.4 представлена диаграмма, демонстрирующая влияние гептапептида «Селанк» формулы (I) в дозе 200 мкг/кг на титры вируса простого герпеса 1 типа (ВПГ-1) в тканях головного мозга инфицированных животных.

В табл.1 показан противовирусный эффект гептапептида «Селанк» формулы (I) на модели культуры перевиваемых клеток человека HeLa в сравнении с ридостином, амиксином и циклофероном.

В табл.2 показан противовирусный эффект гептапептида «Селанк» формулы (I) на модели культуры перевиваемых клеток человека А-549 в сравнении с ридостином, амиксином и циклофероном.

В табл.3 показан противовирусный эффект гептапептида «Селанк» формулы (I) в отношении инфекции, вызванной вирусом гриппа А птиц (штамм H5N1) в культуре клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ).

Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение. Исследования проведены на клеточных линиях и экспериментальных животных.

Пример 1. Активность гептапептида «Селанк» формулы (I) в отношении вируса гриппа A/Aichi 2/68 (штамм H3N2) оценивалась по его способности контролировать репродукцию вируса в тест-культуре клеточной линии фибробластов почки собаки (MDCK). Гептапептид «Селанк» формулы (I) вводили за 24 часа до заражения культуры вирусом (модель профилактической схемы применения), одновременно с заражением (модель лечебно-профилактического использования) и через 24 часа после заражения клеток вирусом гриппа (модель лечебной схемы использования препарата) в конечных концентрациях - 10^-6 М, 10^-7 М и 10^-8 М. В качестве препарата сравнения применяли рекомбинантный ИФН-α в концентрации 10⁴ МЕ/мл. Оценка противовирусной активности препаратов осуществлялась путем контроля репродукции вирусов реакцией гемагглютинации с вируссодержащей жидкостью по стандартной методике (Шубладзе А.К., Гайдамович С.Я., 1943 г.). Обнаружен выраженный дозозависимый противовирусный эффект гептапептида «Селанк» формулы (I). При этом в модели профилактической схемы введения гептапептид «Селанк» формулы (I) в концентрации 10^-6 М показал наибольшую эффективность, полностью подавляя репродукцию вируса гриппа А (штамм H3N2) в тест-культуре. Результаты приведены на фиг.1.

Пример 2. Исследования проводились на 80 белых беспородных мышах весом 14-16 г. Животных инфицировали вирусом A/Aichi 1/68 (штамм H3N2) в дозе 100 LD50, предварительно адаптированным к размножению в легких мышей. Гептапептид «Селанк» формулы (I) вводили внутрибрюшинно в дозе 100 мкг/кг и 200 мкг/кг массы тела. Применялись три схемы введения препарата - профилактическая (за 24 часа до заражения животных тест-вирусом), лечебно-профилактическая (одновременно с заражением) и лечебная схема (через 24 часа после заражения животных вирусом). Контрольную группу составляли мыши, зараженные вирусом и получавшие плацебо. Противовирусная активность гептапептида «Селанк» формулы (I) оценивалась по выживаемости животных. Обнаружено, что внутрибрюшинное введение гептапептида «Селанк» формулы (I) увеличивает выживаемость экспериментальных животных на 40% по сравнению с контрольной группой. Результаты приведены на фиг.2.

Пример 3. Изучение противогерпетической активности проводили в культуре клеток почки африканской зеленой мартышки (VERO). Гептапептид «Селанк» формулы (I) вводили одновременно с заражением (модель лечебно-профилактического использования) и через 24 часа после заражения клеток вирусом герпеса 2 типа (ВПГ-2) (модель лечебной схемы использования препарата) в конечных концентрациях 10^-6 М, 10^-7 М и 10^-8 М. В качестве препарата сравнения применяли известный индуктор интерферонов ридостин. Клетки заражали ВПГ-2 в дозе 0,1 ТЦЦ50 (тканевая цитопатическая доза). Оценка противовирусной активности препаратов осуществлялась через 48-72 часа после заражения по цитопатогенному действию (ЦПД) вируса. Согласно полученным результатам модель лечебной схемы введения гептапептида «Селанк» формулы (I) оказалась наиболее эффективной. При этой схеме применения противовирусная эффективность гептапептида «Селанк» формулы (I) в концентрации 10^-6 М и 10^-7 М была сравнима с эффективностью применяемого в медицинской практике индуктора интерферона ридостина. Результаты приведены на фиг.3.

Пример 4. Исследования проводились на 40 белых беспородных мышах весом 14-16 г. Животных инфицировали вирусом простого герпеса 1 типа (ВПГ-1) в дозе 100 LD50. Гептапептид «Селанк» формулы (I) вводили внутрибрюшинно в концентрации 200 мкг/кг массы тела. Применялись две схемы введения препарата - лечебно-профилактическая (одновременно с заражением) и лечебная схема (через 24 часа после заражения животных вирусом). Контрольную группу составляли мыши, зараженные вирусом и получавшие плацебо. Инфицированные животные забивалась на 7-е сутки для определения титров ВПГ-1 в тканях головного мозга. Определение титров ВПГ-1 в тканях мозга опытных и контрольных мышей проводили в 3-х повторах на клетках VERO, обработанных 10-кратным разведением суспензии мозга. Наблюдение и учет титров вируса осуществляли на 3-4 день после контакта с инфекционным материалом. Обнаружено, что препарат оказывал преимущественно лечебное действие средней степени выраженности. Титр вируса, полученного от контрольных мышей, составил 4,0 lg. Применение гептапептида «Селанк» формулы (I) по лечебной схеме снижало инфекционность ВПГ-1 на 2,0 lg по сравнению с контролем. Результаты приведены на фиг.4.

Пример 5. Изучение специфической активности гептапептида «Селанк» формулы (I) проводили in vitro на культуре перевиваемых клеток человека HeLa (клетки, выделенные от больной раком шейки матки), которая используется для определения антивирусной активности препаратов и для титрования ИФН-α/ИФН-γ. Клетки в концентрации 200000 клеток/мл высевались в 96-луночные плоскодонные культуральные планшеты в среде ИГЛА с добавлением 10% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота, глутамина (300 мкг/мл) и антибиотика (100 Ед/мл пеницилина). Основной задачей исследования являлась проверка противовирусного действия гептапептида «Селанк» формулы (I). В качестве препаратов сравнения использовали известные индукторы интерферона и антивирусные препараты: Ридостин (НПО "Вектор", Новосибирск, Россия), Амиксин (ЗАО "Лэнс", Москва, Россия), Циклоферон ("Полисан", С.-Петербург, Россия). Для выявления антивирусного эффекта использовали вирус энцефаломиокардита мышей (ЕМС). Противовирусный эффект оценивался по минимально эффективной концентрации (максимально эффективное разведение) препарата, защищающей 50% клеток от цитопатогенного действия вируса ЕМС (ЦПД₅₀/мл). Препарат, обладающий противовирусным эффектом, считается соединением, подавляющим размножение вируса в культуре клеток на 1,7-2,0 lg. Для определения ЦПД вируса использовали инвертированный микроскоп (фирмы Leitz). Каждый исследуемый препарат в культуральных планшетах с клетками раститровывали с шагом 1:2 в 24 лунках в 3 повторах. Эксперименты повторяли 3 раза. В исследованиях in vitro показано, что гептапептид «Селанк» формулы (I) обладает выраженной противовирусной активностью в различных концентрациях от 0,009 до 0,15 мкг/мл. Полученные результаты представлены в табл.1.

Таблица 1
Противовирусный эффект гептапептида «Селанк» формулы (I) на модели культуры перевиваемых клеток человека HeLa в сравнении с ридостином, амиксином и циклофероном.ПРОТИВОВИРУСНЫЙ ЭФФЕКТ (токсичность*; разведение**; мкг/мл***)ПРЕПАРАТЫHeLa Опыт 1HeLa Опыт 2Гептапептид «Селанк» формулы (I) (9,45 мкг/мл)1/8
(1,2 мкг/мл)*
1/64-1/1024**
0,15-0,009***1/4
(2,4 мкг/мл)
1/16-1/128
0,59-0,074Ридостин (1,0 мг/мл)О.т.
1/256 до
3,906О.т.
1/1024
до 0,977Амиксин (2,5 мг/мл)-1/128
(19,5 мкг/мл)
1/256-1/512
9,766-4,883Циклоферон (6,0 мг/мл)О.т.
1/8
до 750,0О.т.
1/32
до 187,5Примечание: *Токсичность препаратов определялась до разведения (концентрации) О.т. - отсутствие токсичности.

Пример 6. Изучение специфической активности гептапептида «Селанк» формулы (I) проводили in vitro на культуре перевиваемых клеток человека А-549 (клетки, выделенные от больного карциномой легких), которая используется для определения антивирусной активности препаратов и для титрования ИФН-α/ИФН-γ. Клетки в концентрации 200000 клеток/мл высевались в 96-луночные плоскодонные культуральные планшеты в среде ИГЛА с добавлением 10% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота, глутамина (300 мкг/мл) и антибиотика (100 Ед/мл пеницилина). Основной задачей исследования являлась проверка противовирусного действия гептапептида «Селанк» формулы (I). В качестве препаратов сравнения использовали известные индукторы интерферона и антивирусные препараты: Ридостин (НПО "Вектор", Новосибирск, Россия), Амиксин (ЗАО "Лэнс", Москва, Россия), Циклоферон ("Полисан", С.-Петербург, Россия). Для выявления антивирусного эффекта использовали вирус энцефаломиокардита мышей (ЕМС). Противовирусный эффект оценивался по минимально эффективной концентрации (максимально эффективное разведение) препарата, защищающей 50% клеток от цитопатогенного действия вируса ЕМС (ЦПД₅₀/мл). Препарат, обладающий противовирусным эффектом, считается соединением, подавляющим размножение вируса в культуре клеток на 1,7-2,0 lg. Для определения ЦПД вируса использовали инвертированный микроскоп (фирмы Leitz).

Каждый исследуемый препарат в культуральных планшетах с клетками раститровывали с шагом 1:2 в 24 лунках в 3 повторах. Эксперименты повторяли 3 раза. В исследованиях in vitro показано, что гептапептид «Селанк» формулы (I) обладает выраженной противовирусной активностью в различных концентрациях от 0,009 до 0,15 мкг/мл. Результаты представлены в табл.2.

Таблица 2
Противовирусный эффект гептапептида «Селанк» формулы (I) на модели культуры перевиваемых клеток человека А-549 в сравнении с ридостином, амиксином и циклофероном.ПРОТИВОВИРУСНЫЙ ЭФФЕКТ(токсичность*; разведение**; мкг/мл***)ПРЕПАРАТЫА-549Гептапептид «Селанк» формулы (I)1/8(9,45 мкг/мл)(1,2 мкг/мл) 1/16-1/512 0,59-0,019Ридостин (1,0 мг/мл)О.т. 1/4 250,0Амиксин (2,5 мг/мл)1/64 (39,1 мкг/мл) 1/512-1/2048 4,883-1,221Циклоферон (6,0 мг/мл)О.т. 1/4 1500Примечание: *Токсичность считается до разведения (концентрации).

Пример 7. Для изучения противовирусной активности гептапептид «Селанк» формулы (I) в исследованиях использовали высокопатогенный штамм вируса гриппа А птиц (H5N1), выделенный нами во время эпизоотии среди домашних птиц в июле 2005 года в Новосибирской области. Вируссодержащий материал представлял собой культуральную жидкость, собранную из зараженных вирусом гриппа A (H5N1) культур клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) на высоте развития цитопатических проявлений. В опытах использовали дозу вируса, равную 1,0 ТЦД50. Исследования противовирусной активности гептапептида «Селанк» формулы (I) проводили в культурах клеток СПЭВ, выращенных в виде однодневного монослоя в 24-луночных панелях. Для определения цитотоксических свойств гептапептида «Селанк» формулы (I) использовали гептапептид «Селанк» формулы (I) в разведении 1:10, добавляли в питательную среду культур клеток СПЭВ, после чего на протяжении 4-х суток наблюдали за жизнеспособностью и пролиферативной активностью клеток. Учет результатов проводили по регистрации % жизнеспособных клеток и их пролиферативной активности. Для изучения противовирусных свойств гептапептида «Селанк» формулы (I) в виде раствора использовали в разведении 1:10. Культуры клеток СПЭВ обрабатывали различными разведениями гептапептида «Селанк» формулы (I) за 1 час до заражения клеток, сразу после адсорбции вируса и через 1 час после заражения клеток.

Показано, что гептапептид «Селанк» формулы (I) в разведении 1:10 не обладает цитотоксическими свойствами при всех вариантах его введения в культуры клеток СПЭВ.

В дальнейших исследованиях при изучении противовирусной активности использовали рекомендованную дозу гептапептида «Селанк» формулы (I), равную 1:10. Показано, что гептапептид «Селанк» формулы (I) обладает способностью подавлять репликацию вируса гриппа А птиц (H5N1) в культурах клеток СПЭВ как в случае обработки клеток за 1 час до заражения клеток вирусом, в момент инфицирования, так и через 1 час после заражения культур клеток вирусом гриппа А птиц (H5N1). Однако максимальный противовирусный эффект гептапептида «Селанк» формулы (I) проявлялся в случае, когда его вносили в разведении 1:10 в момент заражения клеток СПЭВ. В этих условиях гептапептид «Селанк» формулы (I) вызывал более чем 80% подавление репродукции патогенного варианта вируса гриппа в клетках. Гептапептид «Селанк» формулы (I) оказался активным и при профилактическом его применении, когда до 70% клеток было защищено от заражения вирусом гриппа А птиц (H5N1). В меньшей степени гептапептид «Селанк» формулы (I) проявлял антивирусные свойства, когда его вводили уже через 1 час после заражения клеток вирусом гриппа А птиц (H5N1). В этих условиях гептапептид «Селанк» формулы (I) в разведении 1:10 вызывал защиту 50% клеток монослоя.

Показано, что гептапептид «Селанк» формулы (I) в разведении 1:10 обладает выраженными лечебно-профилактическими свойствами в отношении инфекции, вызванной высокопатогенным штаммом вируса гриппа птиц A (H5N1) в культурах клеток СПЭВ. Максимальные антивирусные свойства гептапептида «Селанк» формулы (I) обнаружены при обработке клеток СПЭВ сразу же после адсорбции вируса гриппа птиц A (H5N1). Полученные результаты представлены в табл.3.

Таблица 3
Противовирусная активность гептапептида «Селанк» формулы (I) в отношении инфекции, вызванной вирусом гриппа а птиц (H5N1) в культурах клеток СПЭВ.Сроки введения гептапептида «Селанк» формулы (I)Вирусиндуцированная гибель зараженных вирусом гриппа птиц a (H5N1) клеток при лечебно-профилактическом применении гептапептида «Селанк» формулы (I) (в %)гептапептид «Селанк» формулы (I) 1:10Контроль вируса гриппа птиц a (H5N1)До заражения вирусом гриппа А птиц (H5N1)3095В момент
инфицирования клеток1595Через 1 час после заражения клеток5085

Таким образом, изобретение позволяет использовать гептапептид «Селанк» формулы (I) в качестве противовирусного средства для эффективной профилактики и лечения заболеваний, вызванных вирусом гриппа А, инфекции, вызванной вирусом простого герпеса (ВПГ), вирусом энцефаломиокардита мышей (ЕМС).

Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии, и касается профилактики и лечения вирусных заболеваний. Для этого используют гептапептид «Селанк» формулы Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro. Изобретение позволяет предотвратить или купировать вирусную инфекцию за счет выраженного противовирусного действия препарата. 2 н.п. ф-лы, 3 табл., 4 ил.

1. Применение гептапептида «Селанк» формулы (I) Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro в качестве средства профилактики и лечения вирусных заболеваний.2. Способ профилактики и лечения инфекционных заболеваний вирусной этиологии, предусматривающий применение лекарственного средства, отличающийся тем, что в качестве лекарственного средства используют гептапептид «Селанк» формулы (I) Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro путем введения его в суточной дозе 100-200 мкг/кг.