ШТАММ БАКТЕРИЙ ALCALIGENES DENITRIFICANS - ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛАЗЫ Российский патент 2008 года по МПК C12N1/20 C12R1/05 

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения нового штамма бактерий Alcaligenes denitrificans ВКПМ В-9582 - продуцента фермента нитрилазы, катализирующего прямой гидролиз нитрилов карбоновых кислот в соответствующие кислоты.

В литературе описан целый ряд микроорганизмов, обладающих ферментом нитрилаза. Среди них есть представители грибов Fusarium [1]; грамположительных бактерий Rhodococcus [2], Nocardia [3], Corynebacterium [4], Arthrobacter [5] и грамотрицательных бактерий Alcaligenes [6], Klebsiella [7]. Однако большинство описанных нитрилаз способны гидролизовать только ароматические и гетероциклические нитрилы.

Способность к прямому гидролизу алифатических нитрилов с образованием соответствующих им карбоновых кислот описана для штаммов: Rhodococcus rhodochrous J-1 [8], Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40757 и NCIMB40833 [9], Rhodococcus rhodochrous К 22 [10], Alcaligenes sp. AK866N [11], Alcaligenes sp. ВКПМ B-6706 [12], Alcaligenes denitrificans C-32 VKM B-2243D [13].

Микроорганизмы, рекомендуемые к использованию в качестве биокатализаторов для промышленного получения карбоновых кислот, должны обладать высокой ферментативной активностью и способностью давать большой урожай клеток на простых, дешевых питательных средах.

Основные недостатки штаммов Rhodococcus rhodochrous J-1, Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40757, Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40833, Rhodococcus rhodochrous K 22 и Alcaligenes sp. ВКПМ B-6706 заключаются, прежде всего, в том, что в процессе культивирования необходимо использовать питательные среды, содержащие дорогостоящие компоненты (пептон, аминокислоты, витамины), вводить в среды индукторы - токсичные, легко летучие нитрилы. Кроме того, перечисленные штаммы отличаются незначительной удельной нитрилазной активностью. Так, штамм Rhodococcus rhodochrous J-1 требует для роста пептон и изовалеронитрил или ε-капролактам в качестве индуктора нитрилазной активности. При этом максимальная удельная активность штамма по отношению к акрилонитрилу составляет 3,5 ммоль/г·мин или 212,4 ммоль/г·ч при температуре реакции 20°С. При условии культивирования на среде, содержащей витамины и ацетонитрил в качестве индуктора, максимальная удельная активность штаммов Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40757 и Rhodococcus rhodochrous NCIMB 40833 составляет не более 1,4 ммоль/г·мин или 83,0 ммоль/г·ч при температуре реакции 30°С. Штамм Alcaligenes sp. В-6706 требует внесения в среду культивирования казаминовых кислот, а его удельная нитрилазная активность не превышает 3,9 ммоль/г·мин (234 ммоль/г·ч) при температуре реакции 30°С.

Клетки штамма Alcaligenes sp. AK866N при культивировании на среде, содержащей пептон, пропионитрил или ацетонитрил, проявляют высокую нитрилазную активность в отношении акрилонитрила - 8,4 ммоль/г·мин (506,0 ммоль/г·ч) в температурном интервале (0-30°С). Недостатком данного штамма является необходимость внесения в среду культивирования дорогостоящего пептона и дополнительных индукторов пропионитрила и ацетонитрила. Кроме того, низкая термостабильность фермента не позволяет проводить реакцию гидролиза нитрилов при температуре выше 30°С.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является штамм Alcaligenes denitrificans С-32 (RU 2177034 C1, 20.12.2001). Он не требует использования дорогостоящих компонентов сред и токсичных индукторов, но его удельная нитрилазная активность по отношению к акрилонитрилу не превышает 9,3 ммоль/г·мин (555,6 ммоль/г·ч) при 30°С и 5,7 ммоль/г·мин (342 ммоль/г·ч) при 20°С. Это делает использование биокатализатора на его основе в промышленных процессах получения акриловой кислоты низкорентабельным.

Целью данного изобретения является получение нового штамма, способного расти на простых полусинтетических питательных средах, не содержащих индукторы, с высоким выходом биомассы и нитрилазной активностью, превышающей известные аналоги. Это позволит улучшить количественные и качественные характеристики промышленного биокатализатора, используемого для получения растворов акриловой кислоты.

Поставленная цель достигается путем создания штамма Alcaligenes denitrificans Н8-18, обладающего высокой удельной нитрилазной активностью - 6,9 ммоль/г·мин (414 ммоль/г·ч) при 20°С, при сохранении остальных характеристик дикого штамма Alcaligenes denitrificans С-32.

Штамм Alcaligenes denitrificans Н8-18 получен из штамма Alcaligenes denitrificans С-32 с помощью мутагенеза и направленной селекции путем выделения мутантов, дефективных по нитрилазной активности и последующего отбора клонов с более высокой активностью.

Заявляемый штамм Alcaligenes denitrificans Н8-18 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-9582 и характеризуется следующими морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами.

Культурально-морфологические признаки. Клетки штамма Alcaligenes denitrificans ВКПМ В-9582 в возрасте 20-22 часов имеют палочковидную и овоидную формы; расположены поодиночке, реже попарно. Размер клеток 0.7-0.8×0.9-2.0 мкм. Грамнегативные. Спор и капсул не образуют. Подвижные.

При росте на мясопептонном агаре колонии округлой формы, 2-3 мм в диаметре, выпуклые, с возрастом растекаются по агару. Колонии блестящие, полупрозрачные в проходящем свете. Край неровный, консистенция пастообразная. На мясопептонном бульоне наблюдается равномерное помутнение всей среды с образованием пристенного кольца на поверхности.

Физиолого-биохимические свойства. Аэроб со строго респираторным типом метаболизма, способный к нитратному дыханию. Нитраты восстанавливают до нитритов. Оптимальная температура роста 30-32°С. Не растет при 42°С. Рост в широком диапазоне значения рН от 6,5 до 8,7. Каталаза- и оксидаза-положительный. Хемоорганотроф, использует различные органические кислоты и аминокислоты в качестве источника углерода. Растет на синтетических средах, содержащих ацетонитрил, пропионитрил и акрилонитрил в качестве единственного источника углерода и/или азота. Способен гидролизовать нитрилы без образования амида в качестве промежуточного продукта реакции. При росте на средах с органическими солями, нитрилами и амидами дает щелочную реакцию. В O/F тестах на среде с сахарами и многоатомными спиртами кислоту не образует. Крахмал и целлюлозу не гидролизует. Желатиназой не обладает. Не образует пигментов на средах "Кинг А" и "Кинг В". Дает слабый рост на среде, содержащей 6,5% NaCl. Индол и сероводород не образует.

Штамм нетоксичен и непатогенен для человека.

На основании перечисленных выше свойств в соответствии с определителем бактерий Берджи и анализом полиморфизма длин фрагментов рестрикции для гена 16S рибосомальной рибонуклеиновой кислоты штамм ВКПМ В-9582 отнесен к роду Alcaligenes виду denitrificans.

Для получения клеток с высокой активностью нитрилазы, штамм Alcaligenes denitrificans ВКПМ В-9582 культивировали в течение 72 часов при температуре 30°С на полусинтетических питательных средах.

Ферментативную активность клеток определяли с использованием в качестве субстрата нитрила акриловой кислоты. За единицу удельной нитрилазной активности принимали количество фермента, катализирующего образование 1 ммоль кислоты в единицу времени (1 час или 1 минута), содержащегося в 1 г сухого веса клеток.

Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами.

Пример 1. Получение штамма Alcaligenes denitrificans ВКПМ В-9582

Штамм Alcaligenes denitrificans ВКПМ В-9582 был получен из штамма Alcaligenes denitrificans С-32 в ходе двухступенчатой селекции. На первой стадии клетки штамма С-32, выращенные в бульоне Хотингера в течение 18 часов при 30°С, обрабатывали нитрозогуанидином (50 мкг/мл, 5 мин при 37°С) и рассевали на плотную агаризованную среду с ацетатом аммония (г/л): Na₂HPO₄·12H₂O - 6.0, КН₂PO₄ - 2.0, MgSO₄·7H₂O - 0.25, дрожжевой экстракт - 2.0, ацетат аммония - 5.0. Среди выросших клонов отбирали клоны, утратившие нитрилазную активность, и не способные расти на среде с ацетонитрилом в качестве единственного источника азота и углерода (г/л): Na₂HPO₄·12H₂O - 6.0, КН₂PO₄ - 2.0, MgSO₄·7H₂O - 0.25, ацетонитрил - 2. На втором этапе отбирали клоны, способные расти на среде с бутиронитрилом в качестве единственного источника азота и углерода (г/л): Na₂HPO₄·12Н₂O - 6.0, КН₂PO₄ - 2.0, MgSO₄·7H₂O - 0.25, дрожжевой экстракт - 0.5, бутиронитрил - 1.5. Среди выросших клонов был обнаружен штамм, обозначенный Н8-18, обладающий более высокой нитрилазной активностью по сравнению с исходным штаммом С-32.

Пример 2. Сравнение удельной нитрилазной активности и урожая клеток штаммов Alcaligenes denitrificans ВКПМ В-9582 и Alcaligenes denitrificans С-32 при выращивании на плотной питательной среде.

Клетки штаммов Alcaligenes denitrificans ВКПМ В-9582 и Alcaligenes denitrificans С-32 в течение суток при температуре 28°С выращивали на плотной питательной среде следующего состава (г/л): триптический гидролизат кильки - 10,05; NaCl - 4,95; агар бактериологический 15,00; вода дистиллированная. Клетки собирали и ресуспендировали в 0,01М фосфатном буфере, рН 7,6 и разводили тем же буфером до оптической плотности 1,0. Концентрацию клеток определяли фотоколориметрическим методом (λ=540 нм, l=5,07 мм). Единица оптической плотности соответствовала 0,58 г/л (по сухому весу клеток).

Нитрилазную активность клеток оценивали следующим образом: по 1 мл клеточной суспензии переносили в герметичные пластиковые пробирки, помещали их в водяную баню с температурой 20°С и термостатировали в течение 5 минут. В пробы вносили акрилонитрил до конечной концентрации 20,0 г/л. Трансформацию проводили при постоянном перемешивании в течение 30 мин. Реакцию останавливали внесением в реакционную смесь 6 Н HCl в объеме 0,05 мл. Бактериальные клетки отделяли центрифугированием. Концентрацию акриловой кислоты в надосадочной жидкости определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 255 нм.

Удельная нитрилазная активность штамма Alcaligenes denitrificans ВКПМ В-9582 составила 3,6 ммоль/(г·мин), штамма Alcaligenes denitrificans С-32 - 2,4 ммоль/(г·мин). Конверсия субстрата в целевой продукт составила 100%.

Таким образом, на плотной богатой питательной среде полученный штамм обладал удельной нитрилазной активностью в 1,5 раза большей по сравнению с диким штаммом.

Пример 3. Сравнение удельной нитрилазной активности и урожая клеток штаммов Alcaligenes denitrificans ВКПМ В-9582 и Alcaligenes denitrificans С-32 при выращивании в колбах на жидкой питательной среде.

Клетки штаммов Alcaligenes denitrificans ВКПМ В-9582 и Alcaligenes denitrificans С-32 подращивали при 28°С в течение суток на скошенном агаре того же состава, что в примере 2.

Клетки смывали физиологическим раствором и засевали до оптической плотности 0,1 (λ=540 нм, l=5,07 мм), в жидкую питательную среду следующего состава (г/л): Na₂HPO₄×12Н₂O - 7,0; КН₂PO₄ - 2,0; MgSO₄×7H₂O - 1,0; CH₃COONH₄ - 10,0; кукурузный экстракт - 5,0; рН 7,7±0,1; вода дистиллированная. Культивировали в колбах Эрленмейера объемом 300 мл, заполненных на 1/6 часть, в течение 2 суток при круговом перемешивании на качалке (160 об/мин) при температуре 30°С.

После окончания культивирования концентрацию клеток и нитрилазную активность определяли, как описано в примере 2.

Урожай клеток на 48 часов культивирования составил для штамма Alcaligenes denitrificans ВКПМ В-9582 - 2,06 г/л, для штамма Alcaligenes denitrificans С-32 - 1,94 г/л.

Удельная нитрилазная активность штамма Alcaligenes denitrificans ВКПМ В-9582 составила 4,0 ммоль/(г·мин), что в 1,4 раза превышает активность штамма Alcaligenes denitrificans С-32, равную 2,8 ммоль/(г·мин).

Пример 4. Сравнение нитрилазной активности и урожая клеток штаммов Alcaligenes denitrificans ВКПМ В-9582 и Alcaligenes denitrificans С-32 при выращивании в лабораторном ферментере.

Клетки штаммов Alcaligenes denitrificans ВКПМ В-9582 и Alcaligenes denitrificans С-32 подращивали 1 сутки на скошенном агаре, пересевали в колбы Эрленмейера с тем же составом среды, как указано в примере 3, культивировали в течение 1 суток. Полученную культуральную жидкость использовали для засева лабораторного ферментера.

Ферментацию проводили в 3 литровом лабораторном ферментере, заполненном на 1/2 объема средой следующего состава (г/л):

Na₂HPO₄×12H₂O7,0КН₂PO₄2,0MgSO₄×7H₂O1,0CH₃COONH₄13,0Кукурузный экстракт10,0рН7,7±0,1

Вода дистиллированная.

Культивирование проводили при температуре 30°С, аэрации 1,5 мин^-1, постоянном перемешивании 560 об/мин.

В процессе ферментации, по мере истощения в среде ростового субстрата, по принципу обратной связи в ферментер вводили раствор уксусной кислоты.

В среду после 20-24 часов культивирования дополнительно вносили ростовой субстрат - CH₃COONH₄ в концентрации 10,0 г/л.

Периодически из ферментера отбирали пробы культуральной жидкости для определения урожая клеток и их нитрилазной активности. Концентрацию клеток и нитрилазную активность определяли, как указано в примере 2. Результаты ферментации приведены в таблице 1.

Сравнение нитрилазной активности и урожая клеток штаммов Alcaligenes denitrificans ВКПМ В-9582 и Alcaligenes denitrificans С-32 при выращивании влабораторном ферментереШтаммУрожай клеток, г/л (по сухому весу клеток)Удельная нитрилазная активность, ммоль/г·мин (при 20°С)* Общая нитрилазная активность, ммоль/л·мин (при 20°С)Alcaligenes denitrificans ВКПМ В-958214,06,996,6Alcaligenes denitrificans С-3212,05,768,4* Общая нитрилазная активность определяется как количество единиц активности, содержащееся в литре 1 культуральной жидкости.

Как видно из данных, приведенных в таблице, нитрилазная активность и урожай клеток штамма Alcaligenes denitrificans ВКПМ В-9582 выше, чем у клеток штамма Alcaligenes denitrificans С-32.

Общая нитрилазная активность штамма Alcaligenes denitrificans ВКПМ В-9582 в 1,8 раза превышает общую нитрилазную активность штамма С-32, описанную в патенте №2177034.

Штамм Alcaligenes denitrificans ВКПМ В-9582 может быть использован как высокоактивный продуцент фермента нитрилазы и рекомендован для производства биокатализатора в процессе получения карбоновых кислот.

Источники информации

1. Harper D.B. Fungal degradation of aromatic nitriles. Enzymology of C-N cleavage by Fuzarium solani//Biochem. J. - 1977. - V.167. N 3. - P.685-692.

2. Mathew CD., Nagasawa. Т., Kobayashi M., Yamada H. Nitrilase - catalized production of nicotinic acid from 3-cyanopyridine in Rhodococcus rhodochrous J1.//Appl. Environ. Microbiol. - 1988. - V.54, N 4. - P.1030-1032.

3. Collins P.A., Knowles C.J. The utilization of nitriles and amides by Nocardia rhodochrous//J. Gen. Microbiol. - 1983. - V.129, N 3. - P.711-718.

4. Fukuda Y., Fukui M., Harada Т., Izumi Y. Formation of α-aminoacid from -aminonitrile by cell suspensions of a strain of Corinebacterium//J. Ferment. Technol - 1971. - V.49, N 12. - P.1011-1016.

5. Bandyopadhyay A.K., Nagasawa Т., Asano Y., Fujishiro K., Tani Y,. Yamada H. Purification and characterization of benzonitrilases from Arthrobacter sp. strain J-l//Appl. and Inviron. Microbiol. - 1986. - V.51, N 2. - P.302-306.

6. Nagasava Т., Mauger J., Yamada H. A novel nitrilase. arylacetonitrilase. of Alcaligenes faecalis JM3. Purification and characterization//Eur. J. Biochem. - 1990. - V 194. N 3. - P.765-772.

7. Stalker D.M., Malyj L.D., Me.Bride K.E. Purification and properties of a nitrilase specific for the herbicide bromoxynil and corresponding nucleotide sequence analysis of the boon gene//J. Biol. Chem. - 1988. - V.263. N 13. - P.6310-6314.

8. Nagasawa Т., Nakamura Т., Yamada H. ε-Caprolactam, a new powerful inducer for the formation of Rhodococcus rhodochrous J1 nitrilase//Arch. Microbiol. - 1990. - V.155. - P.13-17.

9. Pat. 599818 USA, Int. Cl⁶ C12P 007/60, C12N 009/78, C12N 001/20. Nitrilase from Rhodococcus rhodochrous for converting acrylonitrile directly to acrylic acid//Armitage Y.C., Hughes J., Webster N.A. - 18 p.

10. Kobayashi M., Yanaka N., Nagasawa Т., Yamada H. Hyperinduction of an aliphatic nitrilase by Rhodococcus rhodochrous K22//FEMS Microbiol. Lett. - 1991, - V.77. - P.121-124.

11. Appl. 1-132392 JP, Int. Cl⁴ C12P 7/40, C12 R1:05. Microbiologocal production of monocarboxylic acid//Kawakami K., Tanabe Т., Inoue Sh. - 16 p.

12. Пат. RU 2081169 C1, МКИ⁶ C12N 9/78, C12P 7/40, 13/02, C12R 1:05. Штамм бактерий Alcaligenes species - продуцент нитрилазы/Забазная E.B., Козулин С.В., Куликова Л.К., Воронин С.П., - 10 с.

13. Пат. RU 2177034 C1, МКИ⁷ С12N 1/20, 9/78//(С12N 9/78, С12 R1:05). Штамм бактерий Alcaligenes denitrificans - продуцент нитрилазы / Полтавская С.В., Козулина Т.Н., Сингирцев И.Н., Козулин С.В., Воронин С.П. - 14 с.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Alcaligenes denitrificans ВКПМ В-9582 - продуцент нитрилазы и может быть использован в производстве биокатализатора в процессе получения карбоновых кислот. Изобретение позволяет повысить выход нитрилазы. 1 табл.

Штамм бактерий Alcaligenes denitrificans ВКПМ В-9582 - продуцент нитрилазы.