ШТАММ БАКТЕРИЙ ALCALIGENES SPECIES - ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛАЗЫ Российский патент 1997 года по МПК C12N9/78 C12P7/40 C12P13/02 C12N9/78 C12R1/05 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения нового штамма бактерий Alcaligenes sp. 1b-3, обладающего нитрилазной активностью.

Нитрилаза фермент, катализирующий процесс гидролиза нитрилов карбоновых кислот в карбоновые кислоты.

Акриловая кислота служит исходным материалом для получения полимеров и сополимеров различного назначения. На ее основе изготовляют полипропиленовые пленки, звукопоглощающие материалы, клеевые композиции, латексы, акриловые эмульсии и краски.

Припионовая кислота используется при получении стойких пластмасс в качестве пластификатора, при изготовлении ядохимикатов. Многие производные пропионовой кислоты применяются как лекарственные вещества.

Масляная кислота используется в производстве ацетобутирата.

Уксусная кислота применяется в производстве ацетилцеллюлозы, при получении каучука, пластмасс, а также в производстве инсектицидов и компонентов моющих средств.

Никотиновая кислота и многие ее производные являются лекарственными препаратами. Никотиновая кислота обладает противопеллагрическими свойствами, улучшает углеводный обмен, оказывает сосудорасширяющее действие.

Известны штаммы Arthrobacter sp.[1] Alcaligenes faecalis [2] используя которые осуществляют гидролиз нитрилов до соответствующих кислот.

Недостатком данных штаммов является способность к гидролизу только ароматических нитрилов.

Известны штаммы Rhodococcus rhodochrous J-1 [3] Rhodococcus rhodochrous K22 [4] Alcaligenes sp. AK866N [5] способные к гидролизу алифатических нитрилов с образованием соответствующих кислот.

Недостатком данных штаммов является низкий выход кислот на единицу биокатализатора.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности является штамм Alcaligenes sp. AK866N, клетки которого при культивировании на среде, содержащей пропионитрил, изобутиронитрил или ацетонитрил, проявляют нитрилазную активность в интервале температур 0-30^oC. Нитрилазная активность в отношении акрилонитрила составляет 509,0 единиц.

Целью изобретения является получение нового штамма с более высокой нитрилазной активностью, не требующего внесения в среду токсичных нитрилов и проявляющего нитрилазную активность в более широком диапазоне температур.

Заявляемый штамм Alcaligenes sp. 1b-3 депонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов ГНИИ "Генетика" под номером B-6706 и характеризуется следующими морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами:
Морфологические свойства: клетки штамма 1b-3 в возрасте 18-20 ч имеют форму коккопалочек, мелких (0,5 0,8 мкм), расположенных поодиночке, реже по две, цепочками. В старых культурах наблюдается полиморфизм. Грамнегативные. Спор и капсул не образуют. Подвижные. Некислотоустойчивые.

Культуральные свойства: хемоорганотроф. Аэроб. Оптимальная температура роста 28-30^oC. Не растет при 42^oC, 5^o, при 37^oC наблюдается слабый рост. Суточные колонии на мясо-пептонном агаре точечные, через 48 72 ч колонии увеличиваются в размерах до 5 8 мм в диаметре. Такие колонии имеют округлую форму, центр более темный, приподнят, края прозрачные, плоские, лопастные. Колонии блестящие, полупрозрачные в проходящем свете. Имеют мелкозернистую структуру, маслянистую консистенцию, легко снимаются с агара. При росте на мясо-пептонном бульоне наблюдается равномерное помутнение среды и осадок на дне, который при встряхивании легко разбивается. Оптимум роста при pH 7,0. Штамм способен расти в интервале pH 5 9.

Биохимические свойства: каталаза-, оксидазапозитивен. Желатиназу, липазу, лецитиназу, уреазу, аргинингидралазу, лизиндекарбоксилазу, орнитиндекарбоксилазу не образует. Не редуцирует нитраты в нитриты, не использует молекулярный азот. Образует фенилаланиндезаминазу. Ферментирует дульцит, сахарозу, с трудом ферментирует рамнозу, сорбит, лактозу, маннит. На OF-средах с мальтозой, галактозой, арабинозой, дульцитом, лактозой - щелочение. Окисляет ксилозу. Растет на среде, содержащей 2,5% NaCl, не растет на среде, содержащей 6,5% NaCl. В незначительных количествах утилизирует цитрат и малонат. Индол и сероводород не образует. Крахмал не гидролизует, глицерин не утилизирует. Не образует пигмент на средах Кинг A и Кинг B. При росте на кровяном агаре наблюдается гемолиз. Растет на средах Эндо, Плоскирева, висмут-сульфит агаре, но характер роста не спецефичен для представителей семейства Enterobakteriaceae.

Чувствительность к антибактериальным препаратам: штамм чувствителен к гентамицину, тетрациклину, карбенициллину.

Вирулентность культуры определяли на белых мышах. 100% -ная выживаемость и отсутствие патологических изменений во внутренних органах животных через 15 сут. после перитонеального введения взвеси бактерий в количестве 2•10⁹ кл/мл позволяет сделать вывод об авирулентности штамма.

За единицу активности фермента нитрилазы принимали количество фермента, катализирующее образование 1 ммоля (mM) карбоновой кислоты за единицу времени (1 ч). За единицу удельной активности (УдА) принимали число единиц активности фермента, приходящихся на 1 г сухого веса клеток, mM/г•ч.

Штамм Alcaligenes species 1b-3 ВКПМ B-6706 обладает высокой активностью нитрилазы (124.7 mM/г•ч по отношению к пропионитрилу и акрилонитрилу соответственно) по сравнению со штаммом прототипом Alcaligenes sp. AK866N (8,0 mM/г•ч и 506,0 mM/г•ч соответственно). Клетки штамма Alcaligenes species 1b-3 способны катализировать гидролиз нитрилов в более широком интервале температур и не требуют внесения в состав среды культивирования токсичных нитрилов.

Пример 1. Выделение штамма Alcaligenes sp. 1b-3 был выделен из почвы производства акрилонитрила методом накопительной культуры с использованием ацетонитрила в качестве ростового субстрата. С этой целью навеску почвы (1 г) вносили в колбы Эрленмейера объемом 300 мл, заполненные на 1/3 часть объема синтетической средой состава, г: MgSO₄ 0,1, K₂HPO₄ 0,1, ацетонитрил 1,0, дистиллированная вода 1000 мл, pH 7,2±0,2.

Колбы инкубировали при 28^oC, круговом перемешивании. Раз в три дня культуральную жидкость наполовину обновляли. После 2-х месячного культивирования из экспериментальных колб отбирали по 0,1 мл культуральной жидкости, серийно разводили физиологическим раствором и высевали на поверхность агаризованной среды указанного состава. На 3 5 сут. культивирования при 28^oC отбирали морфологически отличающиеся колонии и проверяли их однородность двукратным пересевом на мясо-пептонный агар. Все фенотипически отличающиеся колонии анализировали на способность трансформировать акрилонитрил в акриловую кислоту. С этой целью микроорганизмы выращивали в течение двух суток на среде состава, г: MgSO₄ 0,1, K₂HPO₄ 0,1, глицерин 5,0, дрожжевой экстракт 5,0, ацетонитрил 5,0, дистиллированная вода 1000 мл, pH 7,2±0,2. Из колб отбирали по 5 мл клеточной суспензии, клетки отделяли центрифугированием, отмывали 0,1 М фосфатным буфером, pH 8,0 и ресуспендировали в 1 мл буфера того же состава, содержащего акрилонитрил в концентрации 2.5 г/л. Трансформацию нитрила проводили при перемешивании в интервале температур 20 25^oC. Через 1 ч реакцию останавливали добавлением 0,05 мл 2H HCl. Количественное определение образовавшейся акриловой кислоты осуществляли методом газожидкостной хроматографии на хроматографе ЛХМ-80 с пламенно-ионизационным детектором, снабженном стальной колонкой (l=2 м, d=5 мм), заполненной сорбентом Инертон NAW HMDS с 15% Reoplex-400 (Chemapol, ЧССР).

В результате была выделена культура Alcaligenes sp. 1b-3, обладающая высокой нитрилазной активностью.

Пример 2. Использование штамма Alcaligenes sp. 1b-3, ВКПМ B-6706 для трансформации пропионитрила и акрилонитрила.

Полученный штамм Alcaligenes sp. 1b-3 культивировали в колбах Эрленмейера объемом 300 мл, заполненных на 1/12 часть средой состава, г: KH₂PO₄ 0,5, Na₂HPO₄•12 H₂O 1,5, MgSO₄•7 H₂O 1,0, этанол 10,0, казаминовые кислоты 5,0, дистиллированная вода 1000 мл, pH 7,2±0,2, при 15-35^oC, лучше 28^oC, в течение суток, на качалке (число качаний 120 мин^-1).

Активность нитрилазы оценивали следующим образом: 5 мл культуральной жидкости центрифугировали, клетки отмывали 0,1 М фосфатным буфером и ресуспендировали в 1 мл 0,01 0,5 М (лучше 0,1 М) фосфатном буфере, pH 6,0 - 8,5, (лучше 8,0). Процесс трансформации может проводиться в других буферных системах (цитратный, трис-HCl буфер) и в воде, в интервале pH 4 9,5. К 1 мл клеточной взвеси в фосфатном буфере (1,17 г/л сухой массы клеток) добавляли нитрил, создавая концентрацию 1% Реакцию трансформации проводили на водяной бане, при 20^oC, перемешивании в течение 1 ч. Процесс останавливали добавлением 0,1 мл 2H HCl, бактериальные клетки отделяли центрифугированием. Концентрацию пропионовой и акриловой кислоты определяли методом газожидкостной хроматографии. Удельная активность нитрилазы в отношении пропионитрила достигала 124,7 mM/г•ч, в отношении акрилонитрила 180,9 mM/г•ч. Сравнительная характеристика активности заявляемого штамма и штамма-прототипа представлена в табл. 1.

Штамм-прототип выращивали на среде, содержащей 1% пропионитрила при 30^oC, в течение 3 сут. Клетки отделяли центрифугированием, отмывали физиологическим раствором и использовали в реакции трансформации. Реакционная смесь представляла собой 0,05 М фосфатный буфер, pH 7,0 содержащий 2 г/л сухой массы бактериальных клеток и 2% нитрила. Реакцию проводили при 30^oC в течение 20 мин. Активность клеток штамма в образовании монокарбоновой кислоты определяли в тех же единицах, что и в заявляемом штамме (mM/г•ч [5]
Пример 3. Влияние температуры на активность нитрилазы штамма Alcaligenes sp. 1b-3.

Изменение нитрилазной активности клеток штамма в зависимости от температуры реакции трансформации рассматривали на примере гидролиза акрилонитрила в акриловую кислоту.

Бактерии выращивали, как описано в примере 2. Для проведения процесса трансформации отбирали 5 мл культуральной жидкости, клетки отделяли центрифугированием, отмывали 0,1 М фосфатным буфером, pH 8,0 и ресуспендировали в 1 мл того же буфера. Реакцию трансформации проводили в течение 20 мин на водяной бане при различных температурах, перемешивании. В реакции использовали 0,67 г/л сухой массы бактериальных клеток, в качестве субстрата добавляли акрилонитрил, создавая концентрацию 1% Реакцию останавливали добавлением 0,1 мл 2H HCl, бактериальные клетки отделяли центрифугированием. Концентрацию акриловой кислоты определяли методом газожидкостной хроматографии. Изменение нитрилазной активности клеток штамма 1b-3 в зависимости от температуры проведения реакции представлены в табл. 2. Как видно из данных, представленных в таблице 2, активность клеток штамма Alcaligenes sp. 1b-3 в отношении акрилонитрила достигает 915.0 mM/г•ч и превышает активность штамма-прототипа (506.0 mM/г•ч) в 1,8 раз.

Кроме того, клетки штамма Alcaligenes sp. 1b-3 способны к гидролизу акрилонитрила в более широком диапазоне температур (2 65^oC, температурный оптимум 50^oC), чем клетки штамма-прототипа Alcaligenes sp. AK866N (0 30^oC, температурный оптимум равен 30^oC).

Пример 4. Использование штамма Alcaligenes sp. 1b-3 ВКПМ B-6706 для трансформации других алифатических нитрилов.

Клетки штамма культивировали как в примере 2, в состав среды дополнительно был введен дрожжевой экстракт (5 г/л). Активность нитрилазы оценивали аналогично примеру 2. В качестве субстрата использовали ацетонитрил, бутиронитрил, изобутиронитрил, изовалеронитрил в концентрации 1% Концентрацию образующихся кислот определяли методом газожидкостной хроматографии. Активность микроорганизма по отношению к различным нитрилам представлена в табл. 3.

Заявляемый бактериальный штамм 1b-3 ВКПМ B-6706 на основании таксономического изучения отнесен к роду Alcaligenes. Штамм обладает конституитивной нитрилазой, осуществляющей гидролиз алифатических нитрилов в соответствующие кислоты в интервале pH 4 9,5 и температур 2 65^oC и не требует внесения в среду культивирования индукторов нитрилов или амидов. Максимальная удельная активность нитрилазы в отношении акрилонитрила достигает 915.0 mM/г•ч. Важным технологическим преимуществом использования штамма Alcaligenes sp. 1b-3 ВКПМ В-6706 в качестве биокатализатора является высокая термостабильность нитрилазы. Максимальная активность фермента наблюдается при 50^oC.

Штамм Alcaligenes sp. 1b-3 ВКПМ В-6706 может быть рекомендован как продуцент фермента нитрилазы и использован в биотехнологическом процессе получения акриловой и других карбоновых кислот.

Использование: биотехнология и может быть использован в биотехнологическом процессе получения акриловой и других карбоновых кислот. Сущность изобретения: получение нового штамма бактерий - продуцента фермента нитрилазы, выделенного из почвы производства акрилонитрила методом накопительной культуры с использованием в качестве селектирующего агента ацетонитрила. По совокупности морфологических, культуральных, биохимических признаков штамм отнесен к роду Alcaligenes. Штамм Alcaligents species ВКПМ В-6706 обладает высокой активностью нитрилазы, достигающей 915 mM/г•ч в отношении акрилонитрила, 134,7 mM/г•ч в отношении пропионитрила и 58,5 mM/г•ч в отношении бутиронитрила. Штамм проявляет ферментативную активность в интервале pH 4-9,5, оптимальное значение pH 8,0. Температурный диапазон проявления нитрилазной активности клетками штамма Alcaligenes sp. 1в-3 ВКПМ В-6706 составляет 2-65^oC, максимальная активность клеток в отношении акрилонитрила проявляется при 50^oC. Штамм не требует внесения в среду культивирования токсичных нитрилов. 3 табл.

Штамм бактерий Alcaligenes species ВКПМ В-6706 продуцент нитрилазы.