ШТАММ БАКТЕРИЙ ALCALIGENES SPECIES - ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛАЗЫ Российский патент 1997 года по МПК C12N9/78 C12P7/40 C12P13/02 C12N9/78 C12R1/05 

Описание патента на изобретение RU2081169C1

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения нового штамма бактерий Alcaligenes sp. 1b-3, обладающего нитрилазной активностью.

Нитрилаза фермент, катализирующий процесс гидролиза нитрилов карбоновых кислот в карбоновые кислоты.

Акриловая кислота служит исходным материалом для получения полимеров и сополимеров различного назначения. На ее основе изготовляют полипропиленовые пленки, звукопоглощающие материалы, клеевые композиции, латексы, акриловые эмульсии и краски.

Припионовая кислота используется при получении стойких пластмасс в качестве пластификатора, при изготовлении ядохимикатов. Многие производные пропионовой кислоты применяются как лекарственные вещества.

Масляная кислота используется в производстве ацетобутирата.

Уксусная кислота применяется в производстве ацетилцеллюлозы, при получении каучука, пластмасс, а также в производстве инсектицидов и компонентов моющих средств.

Никотиновая кислота и многие ее производные являются лекарственными препаратами. Никотиновая кислота обладает противопеллагрическими свойствами, улучшает углеводный обмен, оказывает сосудорасширяющее действие.

Известны штаммы Arthrobacter sp.[1] Alcaligenes faecalis [2] используя которые осуществляют гидролиз нитрилов до соответствующих кислот.

Недостатком данных штаммов является способность к гидролизу только ароматических нитрилов.

Известны штаммы Rhodococcus rhodochrous J-1 [3] Rhodococcus rhodochrous K22 [4] Alcaligenes sp. AK866N [5] способные к гидролизу алифатических нитрилов с образованием соответствующих кислот.

Недостатком данных штаммов является низкий выход кислот на единицу биокатализатора.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности является штамм Alcaligenes sp. AK866N, клетки которого при культивировании на среде, содержащей пропионитрил, изобутиронитрил или ацетонитрил, проявляют нитрилазную активность в интервале температур 0-30oC. Нитрилазная активность в отношении акрилонитрила составляет 509,0 единиц.

Целью изобретения является получение нового штамма с более высокой нитрилазной активностью, не требующего внесения в среду токсичных нитрилов и проявляющего нитрилазную активность в более широком диапазоне температур.

Заявляемый штамм Alcaligenes sp. 1b-3 депонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов ГНИИ "Генетика" под номером B-6706 и характеризуется следующими морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами:
Морфологические свойства: клетки штамма 1b-3 в возрасте 18-20 ч имеют форму коккопалочек, мелких (0,5 0,8 мкм), расположенных поодиночке, реже по две, цепочками. В старых культурах наблюдается полиморфизм. Грамнегативные. Спор и капсул не образуют. Подвижные. Некислотоустойчивые.

Культуральные свойства: хемоорганотроф. Аэроб. Оптимальная температура роста 28-30oC. Не растет при 42oC, 5o, при 37oC наблюдается слабый рост. Суточные колонии на мясо-пептонном агаре точечные, через 48 72 ч колонии увеличиваются в размерах до 5 8 мм в диаметре. Такие колонии имеют округлую форму, центр более темный, приподнят, края прозрачные, плоские, лопастные. Колонии блестящие, полупрозрачные в проходящем свете. Имеют мелкозернистую структуру, маслянистую консистенцию, легко снимаются с агара. При росте на мясо-пептонном бульоне наблюдается равномерное помутнение среды и осадок на дне, который при встряхивании легко разбивается. Оптимум роста при pH 7,0. Штамм способен расти в интервале pH 5 9.

Биохимические свойства: каталаза-, оксидазапозитивен. Желатиназу, липазу, лецитиназу, уреазу, аргинингидралазу, лизиндекарбоксилазу, орнитиндекарбоксилазу не образует. Не редуцирует нитраты в нитриты, не использует молекулярный азот. Образует фенилаланиндезаминазу. Ферментирует дульцит, сахарозу, с трудом ферментирует рамнозу, сорбит, лактозу, маннит. На OF-средах с мальтозой, галактозой, арабинозой, дульцитом, лактозой - щелочение. Окисляет ксилозу. Растет на среде, содержащей 2,5% NaCl, не растет на среде, содержащей 6,5% NaCl. В незначительных количествах утилизирует цитрат и малонат. Индол и сероводород не образует. Крахмал не гидролизует, глицерин не утилизирует. Не образует пигмент на средах Кинг A и Кинг B. При росте на кровяном агаре наблюдается гемолиз. Растет на средах Эндо, Плоскирева, висмут-сульфит агаре, но характер роста не спецефичен для представителей семейства Enterobakteriaceae.

Чувствительность к антибактериальным препаратам: штамм чувствителен к гентамицину, тетрациклину, карбенициллину.

Вирулентность культуры определяли на белых мышах. 100% -ная выживаемость и отсутствие патологических изменений во внутренних органах животных через 15 сут. после перитонеального введения взвеси бактерий в количестве 2•109 кл/мл позволяет сделать вывод об авирулентности штамма.

За единицу активности фермента нитрилазы принимали количество фермента, катализирующее образование 1 ммоля (mM) карбоновой кислоты за единицу времени (1 ч). За единицу удельной активности (УдА) принимали число единиц активности фермента, приходящихся на 1 г сухого веса клеток, mM/г•ч.

Штамм Alcaligenes species 1b-3 ВКПМ B-6706 обладает высокой активностью нитрилазы (124.7 mM/г•ч по отношению к пропионитрилу и акрилонитрилу соответственно) по сравнению со штаммом прототипом Alcaligenes sp. AK866N (8,0 mM/г•ч и 506,0 mM/г•ч соответственно). Клетки штамма Alcaligenes species 1b-3 способны катализировать гидролиз нитрилов в более широком интервале температур и не требуют внесения в состав среды культивирования токсичных нитрилов.

Пример 1. Выделение штамма Alcaligenes sp. 1b-3 был выделен из почвы производства акрилонитрила методом накопительной культуры с использованием ацетонитрила в качестве ростового субстрата. С этой целью навеску почвы (1 г) вносили в колбы Эрленмейера объемом 300 мл, заполненные на 1/3 часть объема синтетической средой состава, г: MgSO4 0,1, K2HPO4 0,1, ацетонитрил 1,0, дистиллированная вода 1000 мл, pH 7,2±0,2.

Колбы инкубировали при 28oC, круговом перемешивании. Раз в три дня культуральную жидкость наполовину обновляли. После 2-х месячного культивирования из экспериментальных колб отбирали по 0,1 мл культуральной жидкости, серийно разводили физиологическим раствором и высевали на поверхность агаризованной среды указанного состава. На 3 5 сут. культивирования при 28oC отбирали морфологически отличающиеся колонии и проверяли их однородность двукратным пересевом на мясо-пептонный агар. Все фенотипически отличающиеся колонии анализировали на способность трансформировать акрилонитрил в акриловую кислоту. С этой целью микроорганизмы выращивали в течение двух суток на среде состава, г: MgSO4 0,1, K2HPO4 0,1, глицерин 5,0, дрожжевой экстракт 5,0, ацетонитрил 5,0, дистиллированная вода 1000 мл, pH 7,2±0,2. Из колб отбирали по 5 мл клеточной суспензии, клетки отделяли центрифугированием, отмывали 0,1 М фосфатным буфером, pH 8,0 и ресуспендировали в 1 мл буфера того же состава, содержащего акрилонитрил в концентрации 2.5 г/л. Трансформацию нитрила проводили при перемешивании в интервале температур 20 25oC. Через 1 ч реакцию останавливали добавлением 0,05 мл 2H HCl. Количественное определение образовавшейся акриловой кислоты осуществляли методом газожидкостной хроматографии на хроматографе ЛХМ-80 с пламенно-ионизационным детектором, снабженном стальной колонкой (l=2 м, d=5 мм), заполненной сорбентом Инертон NAW HMDS с 15% Reoplex-400 (Chemapol, ЧССР).

В результате была выделена культура Alcaligenes sp. 1b-3, обладающая высокой нитрилазной активностью.

Пример 2. Использование штамма Alcaligenes sp. 1b-3, ВКПМ B-6706 для трансформации пропионитрила и акрилонитрила.

Полученный штамм Alcaligenes sp. 1b-3 культивировали в колбах Эрленмейера объемом 300 мл, заполненных на 1/12 часть средой состава, г: KH2PO4 0,5, Na2HPO4•12 H2O 1,5, MgSO4•7 H2O 1,0, этанол 10,0, казаминовые кислоты 5,0, дистиллированная вода 1000 мл, pH 7,2±0,2, при 15-35oC, лучше 28oC, в течение суток, на качалке (число качаний 120 мин-1).

Активность нитрилазы оценивали следующим образом: 5 мл культуральной жидкости центрифугировали, клетки отмывали 0,1 М фосфатным буфером и ресуспендировали в 1 мл 0,01 0,5 М (лучше 0,1 М) фосфатном буфере, pH 6,0 - 8,5, (лучше 8,0). Процесс трансформации может проводиться в других буферных системах (цитратный, трис-HCl буфер) и в воде, в интервале pH 4 9,5. К 1 мл клеточной взвеси в фосфатном буфере (1,17 г/л сухой массы клеток) добавляли нитрил, создавая концентрацию 1% Реакцию трансформации проводили на водяной бане, при 20oC, перемешивании в течение 1 ч. Процесс останавливали добавлением 0,1 мл 2H HCl, бактериальные клетки отделяли центрифугированием. Концентрацию пропионовой и акриловой кислоты определяли методом газожидкостной хроматографии. Удельная активность нитрилазы в отношении пропионитрила достигала 124,7 mM/г•ч, в отношении акрилонитрила 180,9 mM/г•ч. Сравнительная характеристика активности заявляемого штамма и штамма-прототипа представлена в табл. 1.

Штамм-прототип выращивали на среде, содержащей 1% пропионитрила при 30oC, в течение 3 сут. Клетки отделяли центрифугированием, отмывали физиологическим раствором и использовали в реакции трансформации. Реакционная смесь представляла собой 0,05 М фосфатный буфер, pH 7,0 содержащий 2 г/л сухой массы бактериальных клеток и 2% нитрила. Реакцию проводили при 30oC в течение 20 мин. Активность клеток штамма в образовании монокарбоновой кислоты определяли в тех же единицах, что и в заявляемом штамме (mM/г•ч [5]
Пример 3. Влияние температуры на активность нитрилазы штамма Alcaligenes sp. 1b-3.

Изменение нитрилазной активности клеток штамма в зависимости от температуры реакции трансформации рассматривали на примере гидролиза акрилонитрила в акриловую кислоту.

Бактерии выращивали, как описано в примере 2. Для проведения процесса трансформации отбирали 5 мл культуральной жидкости, клетки отделяли центрифугированием, отмывали 0,1 М фосфатным буфером, pH 8,0 и ресуспендировали в 1 мл того же буфера. Реакцию трансформации проводили в течение 20 мин на водяной бане при различных температурах, перемешивании. В реакции использовали 0,67 г/л сухой массы бактериальных клеток, в качестве субстрата добавляли акрилонитрил, создавая концентрацию 1% Реакцию останавливали добавлением 0,1 мл 2H HCl, бактериальные клетки отделяли центрифугированием. Концентрацию акриловой кислоты определяли методом газожидкостной хроматографии. Изменение нитрилазной активности клеток штамма 1b-3 в зависимости от температуры проведения реакции представлены в табл. 2. Как видно из данных, представленных в таблице 2, активность клеток штамма Alcaligenes sp. 1b-3 в отношении акрилонитрила достигает 915.0 mM/г•ч и превышает активность штамма-прототипа (506.0 mM/г•ч) в 1,8 раз.

Кроме того, клетки штамма Alcaligenes sp. 1b-3 способны к гидролизу акрилонитрила в более широком диапазоне температур (2 65oC, температурный оптимум 50oC), чем клетки штамма-прототипа Alcaligenes sp. AK866N (0 30oC, температурный оптимум равен 30oC).

Пример 4. Использование штамма Alcaligenes sp. 1b-3 ВКПМ B-6706 для трансформации других алифатических нитрилов.

Клетки штамма культивировали как в примере 2, в состав среды дополнительно был введен дрожжевой экстракт (5 г/л). Активность нитрилазы оценивали аналогично примеру 2. В качестве субстрата использовали ацетонитрил, бутиронитрил, изобутиронитрил, изовалеронитрил в концентрации 1% Концентрацию образующихся кислот определяли методом газожидкостной хроматографии. Активность микроорганизма по отношению к различным нитрилам представлена в табл. 3.

Заявляемый бактериальный штамм 1b-3 ВКПМ B-6706 на основании таксономического изучения отнесен к роду Alcaligenes. Штамм обладает конституитивной нитрилазой, осуществляющей гидролиз алифатических нитрилов в соответствующие кислоты в интервале pH 4 9,5 и температур 2 65oC и не требует внесения в среду культивирования индукторов нитрилов или амидов. Максимальная удельная активность нитрилазы в отношении акрилонитрила достигает 915.0 mM/г•ч. Важным технологическим преимуществом использования штамма Alcaligenes sp. 1b-3 ВКПМ В-6706 в качестве биокатализатора является высокая термостабильность нитрилазы. Максимальная активность фермента наблюдается при 50oC.

Штамм Alcaligenes sp. 1b-3 ВКПМ В-6706 может быть рекомендован как продуцент фермента нитрилазы и использован в биотехнологическом процессе получения акриловой и других карбоновых кислот.

Похожие патенты RU2081169C1

название год авторы номер документа
ШТАММ БАКТЕРИЙ ALCALIGENES DENITRIFICANS-ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛАЗЫ 2001
  • Полтавская С.В.
  • Козулина Т.Н.
  • Сингирцев И.Н.
  • Козулин С.В.
  • Воронин С.П.
RU2177034C1
Способ конструирования на основе бактерий рода Rhodococcus штамма-биокатализатора, обладающего нитрилазной активностью и повышенной операционной стабильностью, рекомбинантный штамм бактерий Rhodococcus rhodochrous, полученный таким способом, способ синтеза акриловой кислоты с использованием этого штамма в качестве биокатализатора 2018
  • Яненко Александр Степанович
  • Воронин Сергей Петрович
  • Новиков Андрей Дмитриевич
  • Глинский Сергей Алексеевич
  • Лавров Константин Валерьевич
  • Минасян Рубен Арменович
RU2731289C2
Штамм бактерий RноDососсUS RноDоснRоUS - продуцент нитрилгидратазы 1990
  • Яненко Александр Степанович
  • Полякова Инга Николаевна
  • Астаурова Ольга Борисовна
  • Пауков Владимир Николаевич
  • Козулин Сергей Владимирович
  • Синолицкий Максим Константинович
  • Моисеева Татьяна Николаевна
  • Воронин Сергей Петрович
  • Дебабов Владимир Георгиевич
SU1731814A1
ШТАММ БАКТЕРИЙ ALCALIGENES DENITRIFICANS - ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛАЗЫ 2007
  • Козулин Сергей Владимирович
  • Воронин Сергей Петрович
  • Глинский Сергей Алексеевич
  • Козулина Татьяна Николаевна
  • Леонова Татьяна Евгеньевна
  • Новиков Андрей Дмитриевич
  • Полтавская Светлана Викторовна
  • Рябченко Людмила Евгеньевна
  • Сингирцев Игорь Николаевич
  • Яненко Александр Степанович
RU2337954C1
ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS SPECIES - ДЕСТРУКТОР ОКСИЭТИЛИРОВАННЫХ СПИРТОВ 1993
  • Турковская О.В.
  • Панченко Л.В.
RU2083662C1
ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS PUTIDA - ДЕСТРУКТОР НЕИОНОГЕННЫХ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ 1993
  • Турковская О.В.
  • Панченко Л.В.
RU2069691C1
ШТАММ БАКТЕРИЙ RHODOCOCCUS RHODOCHROUS - ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛГИДРАТАЗЫ 1993
  • Яненко А.С.
  • Астаурова О.Б.
  • Воронин С.П.
  • Герасимова Т.В.
  • Кирсанов Н.Б.
  • Пауков В.Н.
  • Полякова И.Н.
  • Дебабов В.Г.
RU2053300C1
ШТАММ БАКТЕРИЙ CORYNEBACTERUM SPECIES-ДЕСТРУКТОР АРОМАТИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ 1993
  • Сингирцев И.Н.
  • Крестьянинов В.Ю.
  • Корженевич В.И.
RU2061752C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКРИЛОВЫХ МОНОМЕРОВ И ШТАММ БАКТЕРИЙ RHODOCOCCUS RHODOCHROUS ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ 2006
  • Яненко Александр Степанович
  • Ларикова Галина Андреевна
  • Герасимова Татьяна Васильевна
  • Леонова Татьяна Евгеньевна
  • Полякова Инга Николаевна
  • Дебабов Владимир Георгиевич
RU2304165C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИТРИЛОВ АЛИФАТИЧЕСКИХ КИСЛОТ С УГЛЕВОДОРОДНОЙ ЦЕПЬЮ C-C В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ 1997
  • Рогачева С.М.
  • Игнатов О.В.
  • Игнатов В.В.
RU2112978C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 081 169 C1

Реферат патента 1997 года ШТАММ БАКТЕРИЙ ALCALIGENES SPECIES - ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛАЗЫ

Использование: биотехнология и может быть использован в биотехнологическом процессе получения акриловой и других карбоновых кислот. Сущность изобретения: получение нового штамма бактерий - продуцента фермента нитрилазы, выделенного из почвы производства акрилонитрила методом накопительной культуры с использованием в качестве селектирующего агента ацетонитрила. По совокупности морфологических, культуральных, биохимических признаков штамм отнесен к роду Alcaligenes. Штамм Alcaligents species ВКПМ В-6706 обладает высокой активностью нитрилазы, достигающей 915 mM/г•ч в отношении акрилонитрила, 134,7 mM/г•ч в отношении пропионитрила и 58,5 mM/г•ч в отношении бутиронитрила. Штамм проявляет ферментативную активность в интервале pH 4-9,5, оптимальное значение pH 8,0. Температурный диапазон проявления нитрилазной активности клетками штамма Alcaligenes sp. 1в-3 ВКПМ В-6706 составляет 2-65oC, максимальная активность клеток в отношении акрилонитрила проявляется при 50oC. Штамм не требует внесения в среду культивирования токсичных нитрилов. 3 табл.

Формула изобретения RU 2 081 169 C1

Штамм бактерий Alcaligenes species ВКПМ В-6706 продуцент нитрилазы.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 1997 года RU2081169C1

Печь для непрерывного получения сернистого натрия 1921
  • Настюков А.М.
  • Настюков К.И.
SU1A1
Bandyopadhuau A.K
al
Purification and characteriration of benzonitrilases from Artrhobacter sp., strain j-1
Appl and Environ
Microbiol
Пневматический водоподъемный аппарат-двигатель 1917
  • Кочубей М.П.
SU1986A1
Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов 1917
  • Гордон И.Д.
SU2A1
Nagasawa T., Mayger J., Yamada H.A
novel
Nitrilase, arylacetonitrilase, of Alcaligenes jaecalis
Способ сопряжения брусьев в срубах 1921
  • Муравьев Г.В.
SU33A1
Eur
J
Biochem
Способ приготовления консистентных мазей 1919
  • Вознесенский Н.Н.
SU1990A1
Кран машиниста для автоматических тормозов с сжатым воздухом 1921
  • Казанцев Ф.П.
SU194A1
Переносная печь для варки пищи и отопления в окопах, походных помещениях и т.п. 1921
  • Богач Б.И.
SU3A1
Деревообрабатывающий станок 1972
  • Цыплаков Григорий Иванович
SU444640A1
Очаг для массовой варки пищи, выпечки хлеба и кипячения воды 1921
  • Богач Б.И.
SU4A1
Kobauashi M., et al
Машина для добывания торфа и т.п. 1922
  • Панкратов(-А?) В.И.
  • Панкратов(-А?) И.И.
  • Панкратов(-А?) И.С.
SU22A1
J
Bacteriol
Способ приготовления консистентных мазей 1919
  • Вознесенский Н.Н.
SU1990A1
Приспособление для воспроизведения изображения на светочувствительной фильме при посредстве промежуточного клише в способе фотоэлектрической передачи изображений на расстояние 1920
  • Адамиан И.А.
SU172A1
Кипятильник для воды 1921
  • Богач Б.И.
SU5A1
Заявка Японии N 1132393, кл.C 12 P 7/62, 1989.

RU 2 081 169 C1

Авторы

Забазная Е.В.

Козулин С.В.

Куликова Л.К.

Воронин С.П.

Даты

1997-06-10Публикация

1995-09-19Подача