НОВЫЕ ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ СКРИНИРОВАНИЯ ШИЗОФРЕНИИ И СПОСОБ ЕЕ СКРИНИРОВАНИЯ Российский патент 2008 года по МПК C12Q1/68 C12N15/11 

Область техники, к которой относится изобретение.

Настоящее изобретение относится к новым праймерам, пригодным для идентификации и скринирования нонсенс-мутации по кодону TGG, кодирующему аминокислоту триптофан, замещенному нонсенс-кодоном TAG по нуклеотиду №825 экзона 2 гена синаптогирина 1 из хромосомы 22q11-13, детектирующим при этом предрасположенность к шизофрении у части больных, и к способу ее скринирования.

Уровень техники

Шизофрения является распространенным и обширным заболеванием, поражающим, по меньшей мере, 1% людей во всем мире. Характерные симптомы включают нарушение восприятия и умозаключения (галлюцинации и мании), аномалии устной речи, поведения и двигательной функции (дезорганизованная речь, эксцентричное поведение и кататония), а также оскудение эмоциональной активности и влечения (аффективная сглаженность, ангедония и безволие).

Сообщается, что при шизофрении аномальная нейропередача затрагивает системы дофамина, серотонина, глутамина, гамма-аминомасляной кислоты и холецистокинина (Wolf и соавт., 1993). Данные аномалии могут затрагивать гены, участвующие в метаболизме нейромедиаторов, таких, например, как катехол-о-метилтрансфераза (СОМТ) (Lachman и соавт., 1996) и тирозингидроксилаза (Ref); рецепторы нейромедиаторов, таких как дофаминовые рецепторы (Seeman и соавт., 1993), рецептор N-метил-D-аспартат (NMDA) (Nudmamud и соавт., 2001) и рецепторы серотонина (Chiu и соавт., 2001); а также переносчики нейромедиаторов, такой как переносчик дофамина (Persico и соавт., 1997).

Аномалии нейроразвития сильно осложняются при шизофрении, о чем сообщается при рассмотрении дефектов цитоскелета нейронов (Arnold и соавт., 1991), цитоархитектуры нейронов (Arnold и соавт., 1997) и миграции, клеточной полярности, а также синаптического формирования (Arnold, 1999). Таким образом, при шизофрении, по меньшей мере, два процесса являются аберрантными: нейропередача и развитие нейронов, влияющие прежде всего на последние стадии образования синапса.

К сожалению, не существует объективного лабораторного теста на шизофрению, и диагноз ставят по результатам клинического обследования. Поскольку и поныне существует необходимость в создании способов диагностики и новых способов лечения таких заболеваний, предпринимаются попытки охарактеризовать и получить информацию о генах, ответственных за шизофрению.

В попытке разработать способ диагностики шизофрении, Meloni и соавт. (USPT-6.210.879) для обнаружения связи с шизофренией применили микросателлитный маркер HUMTH01, представленный в первом интроне гена тирозингидроксилазы. Данный маркер состоит из повторяющихся тетрамерных TCAT-мотивов. Наиболее часто встречаемый аллель данного маркера включает 10 повторяющихся мотивов и делецию одной пары оснований в пятом повторяющемся мотиве, который обладает последовательностью CAT. Однако при осуществлении анализа связи данного повтора с шизофренией они наблюдали, что этот полный повтор (без делеции) оказался редким и присутствовал только у пациентов с шизофренией.

Несмотря на то, что о причине шизофрении известно мало, это заболевание обладает сильной генетической компонентой. При изучении генетики шизофрении обнаружено, что данное заболевание является гетерогенным и представляет собой "комплексное генетическое" заболевание, то есть в этиологии этого заболевания могут участвовать несколько генов.

В нескольких генетических исследованиях показано существенное сцепление для некоторых хромосомных областей, которые включают lq21-22, 6р24-22, 7q, 8р22-21, 10р14-13, 13q32, 18р и 22q11-13 (Riley and McGuffin, 2000).

Среди них одна из наиболее интенсивно изученных областей включает несколько локусов на хромосоме 22. Первый широкий поиск маркеров для шизофрении разными группами исследователей дает основание предполагать возможное сцепление для маркеров на хромосоме 22q, несмотря на то, что ни одна из этих групп не получила статистически значимых результатов (Schwab и соавт., 1999; Coon и соавт., 1994; Pulver и соавт., 1994).

Совместное проведение анализа нарушения (нейро)передачи и сцепления D22S278 в 574 семьях еще больше повышает вероятность чувствительности локуса на хромосоме 22q (Совместная группа сцепления для шизофрении на хромосоме 22). Дополнительное доказательство участия хромосомы 22 в шизофрении получено при обследовании пациентов с врожденным пороком развития, названным Velo Cardio Facial Syndrome (VCFS). Известно, что VCFS вызывается делециями в области 22q11.2-q11.23 и пациенты, страдающие от этого нарушения, демонстрируют высокую распространенность психических заболеваний, включая как биполярное нарушение, так и шизофрению (Arnold, 2001). Взятые вместе эти доказательства, независимо полученные из цитогенетических исследований и из анализа сцепления, дают основание полагать, что хромосома 22 действительно может содержать локусы, чувствительные к заболеванию шизофренией.

Помимо исследований по сцеплению альтернативный подход, который вызывает большой интерес в последние годы, заключается в изучении увеличения числа тринуклеотидных повторов при биполярном расстройстве и шизофрении (Vincent и соавт., 2000). Изучение анонимных CAG-повторов с использованием метода выявления увеличения числа повторов (RED) демонстрирует протяженные повторы при шизофрении и биполярном расстройстве с существенным перекрытием у пораженной и контрольной группы (O'Donovan и соавт., 1996; Morris и соавт., 1995).

Предпринимаются крупные усилия по идентификации локусов, содержащих тринуклеотидные повторы, в качестве генов-кандидатов по этим заболеваниям. Однако подход с использованием кандидатов-генов оказался неспособен продемонстрировать большое увеличение числа тринуклеотидных повторов в ряду повторов, выявленных для данных заболеваний, обусловленных увеличением триплетных повторов у пациентов, страдающих шизофренией и биполярным расстройством (Vincent и соавт., 2000).

Невозможность наблюдать большое увеличение повторов привело к предположению о том, что целесообразно изучить умеренное увеличение числа повторов у пациентов, страдающих данными заболеваниями (Petronis и соавт., 1996).

Ранее заявители предположили, что разница в размере аллелей или "аллельной ширине" для таких полиморфных тринуклеотидных повторяющихся локусов также может иметь место при биполярном расстройстве и шизофрении (Saleem и соавт., 1998; Saleem и соавт., 2000).

Поскольку хромосома 22 часто органически связана с биполярным расстройством и шизофренией, чувствительные локусы на этой хромосоме могут содержать увеличенное число CAG-повторов, участвующих в патогенезе этих заболеваний. Для того, чтобы идентифицировать такие локусы на хромосоме 22, идентифицировали CAG-повторы, содержащие более пяти повторов и картирующие на хромосоме 22 чувствительные к шизофрении локусы, и изучали их связь с данным заболеванием. Было показано, что один из таких маркерных CAG-повторов, 22СН3, представленный на хромосоме 22q11-13, ассоциируется в Индийской популяции с шизофренией (Saleem и соавт., 2001). Данный локус является двухаллельным с 7 и 8 CAG-пов торами. Аллель с 8 повторами в данном локусе представлен значительно чаще у пациентов с шизофренией при сравнении с соответствующим этническим контролем. Кроме того, заявители идентифицировали гены вблизи данного локуса. Из них Синаптогирин 1 был выбран в качестве гена-кандидата, маркирующего шизофрению, поскольку он играет существенную роль в высвобождении нейромедиатора, поэтому мутации по данному гену во многом могут объяснить определенные дефекты (нарушения), наблюдаемые при шизофрении.

В двух недавних исследованиях сообщается об обнаружении мутаций по двум разным генам у больных шизофренией. Одна из них представляет собой мутацию сдвига рамки считывания в гене KCNN3, расположенном на хромосоме 1q21-22, и обнаружена только у одного больного шизофренией (Bowen и соавт., 2001). Обнаруженная мутация, которая ассоциирована с шизофренией, представляет собой миссенс-мутацию в гене WKL 1 на 22q11-13 и, как установлено, сегрегирует с шизофренией только в одной большой семье (Meyer и соавт., 2001). Так как шизофрения представляет собой расстройство, находящееся под контролем множества генов, то весьма вероятно, что данная область может также нести некоторые другие гены, мутации которых могут приводить к возникновению шизофрении.

При анализе профиля экспрессии микроматриц из префронтальной области коры у пациентов из отобранных двух групп, с шизофренией и здоровых индивидуумов, обнаружено, что транскрипты, кодирующие белки, участвующие в регуляции пресинаптической функции, менее интенсивны у всех больных шизофренией (Mirnics, 2000).

Кроме того, у двойных "нокаутных" мышей по генам Синаптогирин 1 и синаптофизин обнаруживается дефицит долговременной и кратковременной синаптической лабильности (Roger и соавт., 1999). Данные исследования свидетельствуют, что Синаптогирин 1 предположительно является геном-кандидатом, который обеспечивает подверженность к шизофрении.

В дальнейшем заявители выяснили роль гена Синаптогирина 1 в обеспечении подверженности к шизофрении в Индийской популяции. Ген человека SYNGR1 обнаруживает три (SYNGR1a, SYNGR1b, SYNGR1c) альтернативные транскрипционные формы, соответственно 4.5, 1.3 и 0.9 т.п.н. Наиболее распространенным является транскрипт SYNGR1, в виде 4.5 т.п.н., который соответствует RATSYNGR1, и более всего экспрессируется в нейронах центральной нервной системы, но гораздо меньше - в других тканях, что определено гистохимически с помощью гибридизации in situ. Уровни транскриптов SYNGR1b и SYNGR1c низкие и ограничиваются сердцем, скелетной мышцей, яичником и печенью плода (Kedra и соавт., 1997).

Шизофрения представляет собой болезнь, контролируемую множеством генов, поэтому необходима идентификация большого количества генов-кандидатов, кроме уже известных генов, для прогнозирования предрасположенности к шизофрении, а не только для диагноза, когда уже проявились ее симптомы. Это должно помочь в разработке изменений образа жизни и создать среду для индивидуумов, предрасположенных к данному заболеванию, что должно оказаться полезным для облегчения тяжести заболевания шизофренией.

Настоящее изобретение относится к способу идентификации мутации по гену Синаптогирин 1 для выявления предрасположенности к шизофрении. Польза настоящего изобретения заключается в обнаружении мутации по гену Синаптогирин 1, который считают ответственным за подверженность к шизофрении. Настоящее изобретение полезно также для создания терапевтических средств для лечения шизофрении, а также для создания трансгенных животных, экспрессирующих данный мутантный ген. Установлено, что маркерный CAG-повтор (22СН3) на хромосоме 22q11-13 ассоциирован у представителей Индийской популяции с шизофренией. Вблизи данной хромосомной области лежит ген Синаптогирин 1, который играет ключевую роль в нейропередаче. В частности, настоящее изобретение относится к способу идентификации мутаций по гену Синаптогирин 1. В настоящем изобретении созданы также специфичные праймеры, которые можно использовать для детекции мутации в гене Синаптогирин 1. Настоящее изобретение относится также к способу диагностики и выявления носителей мутации по гену Синаптогирин 1.

Цель настоящего изобретения

Главная цель настоящего изобретения заключается в создании зондов и/или праймеров, специфичных по отношению к сайту мутации у больных шизофренией.

Другая не менее важная цель настоящего изобретения заключается в создании способа идентификации генетической мутации при шизофрении.

Еще одна цель настоящего изобретения заключается в разработке метода скринирования пациентов, страдающих шизофренией.

Следующая цель настоящего изобретения заключается в создании специфичных олигонуклеотидных праймеров для амплификации мутации, включающей участок ДНК у больных шизофренией.

Следующая цель настоящего изобретения заключается в установлении природы мутации у больных шизофренией.

Следующая цель настоящего изобретения заключается в установлении местоположения мутации в человеческом геноме.

Следующая цель настоящего изобретения заключается в идентификации мутации с разными аллелями у больных шизофренией.

Следующая цель настоящего изобретения заключается в установлении характера наследования шизофрении в пораженных семьях.

Следующая цель настоящего изобретения заключается в подтверждении функционального участия генной мутации ткани головного мозга человека.

Наконец, еще одна цель настоящего изобретения заключается в создании диагностического набора для идентификации и скрининга предрасположенности к шизофрении.

Краткое изложение существа настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к новым праймерам, пригодным для идентификации и скринирования нонсенс-мутации в кодоне TGG, кодирующем аминокислоту триптофан, замещенному на нонсенс-кодон TAG по нуклеотиду № 825 экзона 2 гена синаптогирин 1 из хромосомы 22q11-13, и, таким образом, выявляющему предрасположенность части пациентов к шизофрении.

Подробное описание настоящего изобретения

В соответствии с этим настоящее изобретение относится к новым праймерам, используемым для идентификации и скрининга нонсенс-мутации в кодоне TGG, кодирующем аминокислоту триптофан, замещенном на нонсенс-кодон TAG по нуклеотиду № 825 экзона 2 гена синаптогирина 1 из хромосомы 22q11-13 и таким образом выявляющем предрасположенность подгруппы пациентов к шизофрении (См. фигуру 4, на которой показаны праймеры с SEQ ID No.1-9).

В варианте осуществления настоящего изобретения праймеры представлены SEQ ID No.1 и 2.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения праймер представлен SEQ ID No.3.

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения праймеры и/или зонды представлены SEQ ID No.4-7.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения указанные праймеры используются для амплификации экзона 2 гена синаптогирина 1.

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный праймер используется для скринирования нонсенс-мутации по кодону TGG, кодирующему аминокислоту триптофан, замещенному нонсенс-кодоном TAG в нуклеотиде № 825 с 5'-конца экзона 2 гена синаптогирина 1 хромосомы 22q11-13.

В очередном варианте осуществления настоящего изобретения указанный праймер конструируют по предпоследнему положению перед указанной нонсенс-мутацией.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный праймер обладает GC-содержанием в диапазоне 40-60%.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения указанные праймеры и/или зонды используются для скринирования аллельных вариантов нонсенс-мутации по кодону TGG, кодирующему аминокислоту триптофан, замещенному нонсенс-кодоном TAG по нуклеотиду № 825 с 5'-конца экзона 2 гена синаптогирин 1 в хромосоме 22q11-13.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения праймеры и/или зонды с SEQ ID No.4 и 5 конструируют с мутированным основанием, занимающим 3'-положение в зонде и/или праймере с SEQ ID No.5.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения праймеры и/или зонды с SEQ ID No.6 и 7 конструируют с мутированным основанием, занимающим центральное положение в зонде и/или праймере с SEQ ID No.7.

В следующем варианте настоящего изобретения осуществляют способ скринирования людей для выявления предрасположенности к шизофрении путем идентификации нонсенс-мутации по кодону TGG, кодирующему аминокислоту триптофан, замещенному нонсенс-кодоном TAG по нуклеотиду № 825 с 5'-конца экзона 2 и в его аллельных вариантах в гене синаптогирина 1 из хромосомы 22q11-13.

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения выделяют ДНК из лейкоцитов крови.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения амплифицируют выделенную ДНК с помощью ПЦР, используя специфичные для экзонов гена синаптогирина 1 праймеры с SEQ ID No.1 и/или 2, представленными в списке последовательностей.

В очередном варианте осуществления настоящего изобретения амплифицированную ДНК секвенируют.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения секвенированную ДНК сравнивают с ДНК нормального гена синаптогирина 1.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения указанную мутацию идентифицируют.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения сконструированный олигонуклеотидный праймер и/или зонд с SEQ ID No.3, представленной в списке последовательностей, удлиняют по ее 3'-концу до предпоследнего участка указанной мутации.

В следующем варианте настоящего изобретения осуществляют скринирование указанной нонсенс-мутации с использованием праймера и/или зонда с SEQ ID No.3.

В следующем варианте настоящего изобретения осуществляют скринирование указанной аллельной вариации указанной нонсенс-мутации с использованием соответствующих аллель-специфичных олигонуклеотидных зондов и/или праймеров, выбранных из группы, включающей SEQ ID No.4-7 из представленного списка последовательностей.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения указанный способ используют для понимания характера наследования в семьях, подвергнутых шизофрении.

В соответствии со следующим вариантом настоящего изобретения ранняя детекция способствует возможности начала борьбы с заболеванием до его физиологического проявления.

В соответствии со следующим вариантом осуществления настоящего изобретения пораженные болезнью индивидуумы с указанной мутацией находятся в гетерозиготном состоянии.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения используют диагностический набор для скринирования людей по выявлению предрасположенности к шизофрении, который включает праймеры с SEQ ID No.1-2, и зонды и/или праймеры с SEQ ID No.3-7, а также другие ингредиенты, выбранные из ферментов рестрикции, обратных транскриптаз, полимераз, лигаз, линкеров, нуклеозидтрифосфатов в качестве субстрата, подходящих буферов, меток и/или иных вспомогательных компонентов, и с их помощью идентифицируют нонсенс-мутацию кодона TGG, кодирующего аминокислоту триптофан, замещенного по нуклеотиду № 825 нонсенс-кодоном TAG на 5'-конце экзона 2 и в его аллельных вариантах гена синаптогирин 1 из хромосомы 22q11-13.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения факультативно используют иммобилизованные зонды по указанному субстрату.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения используют ферменты рестрикции, выбранные из группы, включающей HpaII, HaeIII, BamHI, HpaI, EcoRI, HindIII и PvuII.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения используют линкеры, которые выбраны из линкеров обоих видов - с липким и тупым концом.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения используют нуклеотидтрифосфаты, которые выбраны из группы, включающей аденинтрифосфаты, гуанинтрифосфаты, цитозинтрифосфаты и тиминтрифосфаты.

В следующем варианте настоящего изобретения осуществляют прямое секвенирование экзонов данного гена из образцов больных людей одной шизофренической семьи для обнаружения нонсенс-мутации во втором экзоне. У пораженных индивидуумов данной семьи кодон TGG, который кодирует аминокислоту триптофан, оказался замещен на TAG, который является нонсенс-кодоном.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения указанная мутация у пораженных индивидуумов присутствует в гетерозиготном состоянии, что должно привести к гаплоидной недостаточности продукта гена Синаптогирин 1.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения, поскольку Синаптогирин 1 участвует в передаче нервного импульса в синапсах, нонсенс-мутация по данному гену может привести к возникновению восприимчивости к шизофрении. Дополнительное генотипирование 148 шизофренических пробандов и 143 этнически подобранных людей из нормального контроля не обнаруживают данной мутации. Эти результаты являются первой демонстрацией ассоциации нонсенс-мутации в гене-кандидате, подтверждающей подверженность шизофрении.

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения подгруппа больных шизофренией может быть носителем данной мутации или еще неизвестной мутации по данному гену, поскольку часто обнаруживается, что многие различные мутации локализуются в данном гене, утрата функции которого является причиной данного заболевания у подгруппы пациентов.

В варианте осуществления настоящего изобретения подтверждается экспрессия экзона 2 гена Синаптогирина 1 в головном мозге в результате амплификации области, охватывающей нонсенс-мутацию в кДНК головного мозга, с использованием специфичных для экзона 2 и 4 праймеров с SEQ ID No 8 и 9.

5' GGC ATG CCT CCT TGG TCT CA 3' (Как указано в SEQ ID NO: 8)

5' CGT CCG TCC CTT CGT TCA 3' (Как указано в SEQ ID NO: 9)

В варианте осуществления настоящего изобретения праймеры из представленного способа, пригодные для амплификации экзона 2 гена Синаптогирина 1, содержащего нонсенс-мутацию, выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и их комплементов.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения аллель-специфичные праймеры и зонды способа, используемого для выявления нонсенс-мутации в гене Синаптогирин 1, выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO; 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 (в которых данное мутантное основание занимает центральное положение в зонде).

В варианте осуществления настоящего изобретения длина олигонуклеотидных праймеров и зондов колеблется в диапазоне от 5 до 100 оснований.

В варианте осуществления настоящего изобретения диагностический набор для выявления нонсенс-мутации (TGG в TAG) может включать подходящие праймеры и зонды, выбранные из группы последовательностей - SEQ ID NO: 1-9.

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения заявители осуществляют ПЦР-амплификацию экзона 2 человеческого гена Синаптогирин 1 с использованием олигонуклеотидных праймеров. Эти праймеры сконструированы в соответствии с последовательностью человеческого Синаптогирина 1, депонированной в Sanger Centre, Hinxton, Cambridgeshire, CB10 1SA, и UK. (08-DEC-1999) (депозитарный номер в GenBank - AL022326).

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения секвенирование выделенного очисткой ПЦР - продукта обнаруживает нонсенс-мутацию в экзоне 2 человеческого гена Синаптогирин 1 у представителей одной семьи, подверженной шизофрении. Поэтому очевидно существование ранее нераспознанного аллеля или подтипа человеческого гена Синаптогирин 1.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения представлена последовательность аллельных вариантов человеческого гена Синаптогирина 1, включающую нонсенс-мутацию, сравниваемую с человеческой последовательностью гена Синаптогирин 1 в базе данных (депозитарный номер в GenBank - AL022326).

ТаблицаСайт измененияИзменение основанияАминокислотное изменение825G-AНонсенс-кодон Тгр

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения изменение сайтов осуществляют в соответствии с ПЦР-последовательностью, полученной с использованием праймеров (SEQ ID 1 и 2), фланкирующих экзон 2 гена Синаптогирин 1.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения мутантный сайт обладает либо 'G либо А. Замещение G→A изменяет аминокислоту триптофан на нонсенс-кодон, который впоследствии дает нуклеотидную последовательность аллельного варианта человеческого гена Синаптогирин 1, содержащего данную нонсенс-мутацию.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения в ПЦР секвенируют последовательность с использованием праймеров (SEQ ID 1 и 2), фланкирующих экзон 2 гена Синаптогирин 1.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения заявители осуществляют ПЦР-амплификацию экзона 2 человеческого гена Синаптогирин 1 с использованием олигонуклеотидных праймеров. Эти праймеры были сконструированы в соответствии с последовательностью человеческого Синаптогирина 1, депонированной в Sanger Centre, Hinxton, Cambridgeshire, CB10 1SA, и UK. (08-DEC-1999) (депозитарный номер в GenBank AL022326).

Мутантный сайт представляет собой нуклеотид в положении 825 в указанной генной последовательности.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения при анализе 20 компактно пораженных шизофренией семей из Южной Индии, а также этнически подобранных здоровых людей обнаружено присутствие данной нонсенс-мутации в одной из семей, страдающей шизофренией. Данная семья включает трех ее членов, страдающих шизофренией, и двух нормальных индивидуумов. Из них, нонсенс-мутация присутствует в гетерозиготном состоянии у всех трех шизофренических больных, а также у одного здорового индивидуума и отсутствует у другого здорового индивидуума. Здоровый индивидуум, обладающий данной мутацией, может быть асимптоматичным ко времени обследования, поскольку она находится в юном возрасте, или же это могло бы быть связано с пенетрантностью мутации. При последующем генотипировании 148 шизофренических больных и 143 этнически подобранных здоровых людей в качестве контроля данная мутация не обнаружена.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения демонстрируется экспрессия экзона 2 (содержащего указанную нонсенс-мутацию) головного мозга человека, где заявителями созданы праймеры, специфичные для экзона 2 и экзона 4, выделена РНК из человеческого головного мозга, создана кДНК и амплифицирована область, охватывающая данную нонсенс-мутацию в кДНК человеческого головного мозга. Установлено, что экзон 2, содержащий нонсенс-мутацию, экспрессируется в головном мозге.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение дополнительно представляет диагностический набор, включающий, по меньшей мере, один или более аллель-специфичных олигонуклеотидов, которые описаны в SEQ ID No 1-9. Как правило, наборы содержат одну или более пар аллель-специфичных олигонуклеотидов, гибридизующих с разными видами полиморфизма. В некоторых наборах аллель-специфичные олигонуклеотиды созданы иммобилизованными на субстрате, которые можно использовать для выявления мутации гена Синаптогирин 1. Факультативные дополнительные компоненты данного набора включают, например, ферменты рестрикции, обратную транскриптазу или полимеразу, субстратные нуклеозидтрифосфаты, средства, используемые для метки (например, ферментный конъюгат авидина, а также ферментный субстрат и хромоген, если меткой является биотин), и соответствующие буферы для обратной транскрипции, ПЦР, или реакций гибридизации. Как правило, данный набор содержит также инструкции по осуществлению методов, а также другие реагенты для выявления SNP и способ, подобный Taqman.

Краткое описание прилагаемых чертежей

На Фиг.1 схематически представлена нонсенс-мутация гена Синаптогирин 1. Верхняя линия изображает положение 6 экзонов гена Синаптогирин 1 и относительное положение нонсенс-мутации во втором экзоне, а также положение праймеров, используемых в OT-ПЦР.

На Фиг.2 показана экспрессия экзона 2 гена Синаптогирин 1 в разных отделах головного мозга с помощью ОТ-ПЦР с использованием праймеров, специфичных для экзона 2 (SEQ ID 8) и экзона 4 (SEQ ID 9).

На Фиг.3 показана родословная семьи, в которой была обнаружена мутация. Кружочки представляют членов семьи - женщин, а квадраты представляют членов семьи - мужчин. Заштрихованные кружочки и квадраты представляют членов семьи, пораженных шизофренией, тогда как нештрихованные кружочки и квадраты соответствуют здоровым членам семьи. Горизонтальные линии соответствуют бракам, а вертикальные линии представляют следующее поколение. Генотип членов семьи, скринированной по данной мутации, обозначается нижними символами. Ниже родословной представлена электроферограмма, изображающая мутацию в экзоне 2 гена Синаптогирин 1.

На Фиг.4 показаны SEQ ID No.1-9.

Нижеследующие примеры приведены в качестве иллюстрации настоящего изобретения и должны рассматриваться в рамках настоящего изобретения.

Пример 1

Идентификация нонсенс-мутации в гене Синаптогирин 1:

В данном примере описывается идентификация мутации в экзоне 2 гена Синаптогирин 1 с помощью ПЦР и секвенирования с использованием отдельных олигонуклеотидных праймеров в соответствии с настоящим изобретением.

ДНК экстрагируют из лейкоцитов периферической крови человека с использованием модификации солевого метода. Концентрацию ДНК определяют путем измерения поглощения полученного образца при длине волны 260 нм. Затем с помощью полимеразной цепной реакции амплифицируют ДНК пробандов - шизофреников с использованием олигонуклеотидного праймера 1 и 2 (SEQ ID 1 и 2). Данные образцы денатурируют при 94°С в течение 5 мин с последующими 35 циклами денатурации при 94°С в течение 30 сек, отжигают (67°С, 30 сек), удлиняют (72°С, 1 мин) и окончательно удлиняют в течение 7 мин при 72°С на амплификаторе Perkin Elmer Gene Amp PCR System 9600. В данной реакции получают 1057 п.н. ДНК-фрагмент. Полученный ПЦР-продукт выделяют очисткой из полосы, вырезанной из агарозного геля с помощью DNA ISOLATION KIT (Biological Industries, Israel), и полученные цепи ПЦР-продукта сразу секвенируют с использованием химически терминирующего красителя на автоматизированном ДНК-секвенаторе ABI Prism 377. Установлено, что полученный ПЦР-продукт идентичен последовательности экзона 2 гена Синаптогирин 1 из банка данных (депозитарный номер - AL022326), за исключением ранее упомянутой мутации у одного пациента - шизофреника.

Пример 2

Скринирование мутации в популяции

В данном примере описывается реакция удлинения праймера, используемого для скрининга единичных нуклеотидных вариантов. Образцы ДНК, полученные от 148 пациентов и 143 здоровых людей, амплифицируют с помощью ПЦР, а полученные ПЦР-продукты выделяют очисткой, как описано в примере 1. Реакцию удлинения праймера осуществляют на выделенных очисткой ПЦР-продуктах с использованием олигонуклеотидного праймера и набора для удлинения праймера SNaPshot ddNTP (РЕ Biosystems).

Олигонуклеотидный праймер конструируют до предпоследнего положения мутации и данный праймер удлиняют с помощью одного ddNTP, в соответствии с представленным аллельным вариантом. Реакцию осуществляют в течение 25 циклов денатурации (96°С, 10 сек), отжига (50°С, 5 сек) и удлинения (60°С, 30 сек) в Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600. Продукты праймерного удлинения обрабатывают щелочной фосфатазой кишечника теленка (New England Bilabs) для удаления невключенных дидезоксинуклеотидов. Полученные продукты секвенируют на автоматическом ДНК-секвенаторе ABI Prism 377. В зависимости от окраски флуоресцентно меченного включенного дидезоксинуклеотида, по гену Синаптогирин детектируют аллель дикого типа и мутантный аллель.

Пример 3

Нуклеотидная последовательность аллельных вариантов гена Синаптогирин 1:

Нуклеотидную последовательность указанного аллельного варианта гена Синаптогирин 1 получают с использованием способа, который описан в примере 1.

Пример 4

Расщепление нонсенс-мутации вместе с заболеванием в семействе шизофреников:

Указанная нонсенс-мутация обнаруживается у пораженных шизофренией членов семьи. Данная семья включает трех больных шизофренией и двух здоровых индивидуумов. Среди них нонсенс-мутация присутствует в гетерозиготном состоянии у всех трех пациентов - шизофреников, а также у одного здорового индивидуума и отсутствует у другого здорового индивидуума. Здоровый индивидуум, обладающий данной мутацией, может быть асимптоматичным ко времени обследования, поскольку она находится в юном возрасте, или же это могло бы быть связано с пенетрантностью мутации.

Пример 5

Изучение экспрессии экзона 2 гена Синаптогирин 1 в головном мозге человека

Для того, чтобы продемонстрировать экспрессию экзона 2 (содержащий нонсенс-мутацию) в головном мозге человека, создавали праймеры, специфичные по экзону 2 и экзону 4. С использованием набора EZ для выделения РНК (Biological Industries) из головного мозга человека выделяют РНК. Синтезируют кДНК с использованием случайных праймеров и олигоDT-праймеров (1-ю цепь кДНК синтезирует с помощью набора для OT-ПЦР, Boehringer Mannheim). Область, охватывающую указанную нонсенс-мутацию в кДНК из человеческого головного мозга, амплифицируют с использованием праймеров, специфичных по экзону 2 и экзону 4. Установлено, что экзон 2, содержащий данную нонсенс-мутацию, экспрессируется в головном мозге.

Ссылки

1. Arnold PD, Siegel-Bartelt J, Cytrynbaum C, Teshima I, Schachar'R. (2001). Velo-cardio-facial syndrome: Implications of microdeletion 22qll for schizophrenia and mood disorders. Am J Med Genet; 105(4): 354-62.

2. Arnold SE, Lee VM, Gur RE, Trojanowski JQ. (1991). Abnormal expression of two microtubule-associated proteins (MAP2 and MAPS) in specific subfields of the hippocampal formation in schizophrenia. Proc Nati Acad Sci USA; 88(23): 10850-4.

3. Arnold SE, Ruscheinsky DD, Han LY. (1997). Further evidence of abnormal cytoarchitecture of the entorhinal cortex in schizophrenia using spatial point pattern analyses. Biol Psychiatry; 42(8): 639-47.

4. Arnold SE. (1999). Neurodevelopmental abnormalities in schizophrenia; insights from neuropathology. Dev Psychopamol; 11(3): 439-56.

5. Bowen Т, Williams N, Norton N, Spurlock G, Wittekindt OH, Morris-Rosendahl DJ, Williams H, Brzustowicz L, Hoogendoom B, Zammit S, Jones G, Sanders RD, Jones LA, McCarthy G, Jones S, Bassert A, Cardno AG, Owen MJ, O'Donovan MC. (2001). Mutation screening of the KCNN3 gene reveals a rare frameshift mutation. Mol Psychiatry 6(3): 259-60.

6. Chiu HJ, Wang YC, Liou JH, Chao CH, Lee H, Tsai KY, Liu WC. (2001). Serotonin 6 receptor polymorphism in schizophrenia: frequency, age at onset and cognitive function. Neuropsychobiology; 43(3): 113-6.

7. Coon H, Jensen S, Holik J, Hoff M, Myles-Worsley M, Reimherr F, Wender P, Waldo M, Freedman R, Leppert M, et al. (1994). Genomic scan for genes predisposing to schizophrenia. Am J Med Genet Mar; 54(1): 59-71.

8. Janz R, Sudhof TC, Hammer RE, Unni V, Siegelbaum SA, Bolshakov.VY. (1999). Essential roles in synaptic plasticity for Synaptogyrin 1 and Synaptophysin 1. Neuron; 24: 687-700.

9. Kedra D, Pan H-Q, Seroussi E, Fransson I, Guilbaud C, Collins JE, Dunham I, Blennow E, Roe BA, Piehl F, Dumanski JP. (1998). Characterization of human Synaptogyrin gene family. Hum Genet, 103:131-141.

10. Lachman HM, Papolos DF, Saito T, Yu YM, Szumlanski CL, Weinshilboum, RM. (1996). Human catechol-0-methyltransferase pharmacogenetics: description of a functional polymorphism and its potential application to neuropsychiatric disorders. Pharmacogenetics; 6(3): 243-50.

11. Mcloni et al. 2001. Method for diagnosing schizophrenia. L'S Patent 6.2 10.S79.

12. Meyer J, Huberth A, Ortega G, Syagailo YV, Jatzke S, Mossner R, Strom TM, Teuber IU, Stober G, Schmitt A, Lesch KP. (2001). A missense mutation in a novel gene encoding a putative cation channel is associated with catatonic schizophrenia in a large pedigree. Mol Psychiatry; 6: 302-306.

13. Mimics К, Middleton FA, Marquez A, Lewis DA, Levitt P. (2000). Molecular characterization of schizophrenia viewed by microarray analysis of gene expression in prefrontal cortex. Neuron; 28: 53-67.

14. H.Morris AG, Gaitonde E, McKenna PJ, Mollon JD, Hunt DM. (1995). CAG repeat expansions and schizophrenia: association with disease in females with early age-at-onset. Hum Mol Genet; 4(10): 1957-61.

15. Nudmamud S, Reynolds GP. (2001). Increased density of glutamate/N-methyl-D-aspartate receptors in superior temporal cortex in schizophrenia. Neurosci Lett; 304(1-2): 9-12.

16. O'Donovan MC, Guy С, Craddock N, Bowen Т, McKeon P, Macedo A, Maier W, Wildenauer D, Aschauer HN, Sorbi S, Feldman E, Mynett-Johnson L, Claffey E, Nacmias B, Valente J, Dourado A, Grassi E, Lenzinger E, Heiden AM, Moorhead S Harrison D, Williams J, McGuffm P, Owen MJ. (1996). Confirmation of association between expanded CAG/CTG repeats and both schizophrenia and bipolar disorder. Psychol Med; 26(6): 1145-53.

17. Persico AM, Macciardi F. (1997). Genotypic association between dopamine transporter gene polymorphisms and schizophrenia. Am J Med Genet; 74(1): 53-7.

18. Petronis A, Bassett AS, Honer WG, Vincent JB, Taruch Y, Sasaki T, Ying DJ, Klempan ТА, Kennedy JL. (1996). Search for unstable DNA in schizophrenia families with evidence for genetic anticipation. Am J Hum Genet; 59(4): 905-11.

19. Pulver AE, Karayiorgou M, Wolyniec PS, Lasseter VK, Kasch L, Nestadt G, Antonarakis S, Housman D, Kazazian HH, Meyers D, et al. (1994). Sequential strategy to identify a susceptibility gene for schizophrenia: report of potential linkage on chromosome 22q12-q13.1: Part 1. Am J Med Genet; 54(1): 36-43.

20. Riley BP, McGuffm P. (2000). Linkage and associated studies of schizophrenia. Am J Med Genet; 97(1): 23-44.

21. Saleem Q, Vijayakumar M, Mutsuddi M. Chowdhary N. Jain S, Brahmachari SK. (1998). Variation at the MJD locus in the major psychoses. Am J Mod Genet: <X1(5): 440-2.

22. Saleem Q, Sreevidya VS, Sudhir J, Savithri JV, Gowda Y, B-Rao C, Senegal V, Majumder PP, Anand A, Brahmachari SK, Jain S. (2000). Association analysis of CAG repeats at the KCNN3 locus in Indian patients with bipolar disorder and schizophrenia. Am J Med Genet; 96(6): 744-8.

23. Saleem Q, Dash D, Gandhi C, Kishore A, Benegal V, Sherrin T, Mukherjee О, Jain S and Brahmachari SK. (2001). Association of CAG repeat loci on chromosome 22 with schizophrenia and bipolar disorder. Mol Psychiatry (In Press).

24 Schizophrenia Colloborative Linkage Group For Chromosome 22. (1998). A transmission disequilibrium and linkage analysis of D22S278 marker alleles in 574 families: further support for a susceptibility locus for schizophrenia at 22q 12. Schizophrenia Research 32: 115-1.

25. Schwab SG, Wildenauer DB. (1999). Chromosome 22 workshop report. Am J Med Genet; 88(3): 276-8.

26. Seeman P, Guan НС, Van Tol HH. (1993). Dopamine D4 receptors elevated in schizophrenia. Nature; 365(6445): 441-5.

27. Vincent JB, Paterson AD, Strong E, Petroms A, Kennedy JL. (2000). The unstable trinucleotide repeat story of major psychosis. Am J Med Genet; 97(1): 77-97.

28. Wolf, SS, Hyde, TM and Weinberger, DR. (1993). Neurobiology of schizophrenia. Curr. Opinion Neurol. Neurosurg; 6: 86-92.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано в медицине. Скрининг людей для выявления предрасположенности к шизофрении проводят путем анализа продукта амплификации выделенной ДНК, полученного с помощью праймеров для амплификации экзона 2 гена синаптогирина 1 хромосомы 22q11-13 человека. Для выполнения указанного анализа сравнивают последовательности ампликона и нормального гена синаптогирина 1, а также используют олигонуклеотид для скрининга мутации в положении 825 на 5'-конце экзона 2 гена синаптогирина 1 хромосомы 22q11-13 человека и олигонуклеотиды для скрининга аллельных вариантов этой мутации. Олигонуклеотид для скрининга мутации в положении 825 экзона 2 гена синаптогирина 1 и олигонуклеотиды для скрининга аллельных вариантов этой мутации используют как праймеры и/или зонды. Набор для скрининга людей и выявления предрасположенности к шизофрении содержит указанные олигонуклеотиды, праймеры для амплификации экзона 2 гена синаптогирина 1 хромосомы 22q11-13 человека и такие средства, как ферменты, нуклеозидтрифосфаты, буферы или метки. Применение изобретения позволяет выявить носителей мутации гена синаптогирина 1 в положении 825 экзона 2, ассоциированную с предрасположенностью к шизофрении у людей. 5 н. и 6 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл.

1. Праймер для амплификации экзона 2 гена синаптогирина 1 хромосомы 22q11-13 человека, имеющий нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.2. Олигонуклеотид для скрининга мутации в положении 825 на 5'-конце экзона 2 гена синаптогирина 1 хромосомы 22q11-13 человека, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3.3. Олигонуклеотид по п.2, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO: 3, конструируют до предпоследнего положения указанной нонсенс-мутации.4. Олигонуклеотид для скрининга аллельных вариантов мутации в положении 825 на 5'-конце экзона 2 гена синаптогирина 1 хромосомы 22q11-13 человека, имеющий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4-7.5. Олигонуклеотид по п.4, отличающийся тем, что нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 4 и 5 сконструированы таким образом, что содержат мутированное основание, расположенное в 3'-положении.6. Олигонуклеотид по п.4, отличающийся тем, что нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 6 и 7 сконструированы таким образом, что содержат мутированное основание, занимающее центральное положение.7. Способ скрининга людей для выявления предрасположенности к шизофрении путем идентификации нонсенс-мутации по кодону TGG, кодирующему аминокислоту триптофан, замещенному нонсенс-кодоном TAG по нуклеотиду 825 на 5'-конце экзона 2 гена синаптогирина 1 хромосомы 22q11-13 и в его аллельных вариантах, где способ предусматривает:

(a) выделение ДНК из лейкоцитов крови,

(b) амплификацию выделенной ДНК с помощью ПЦР с использованием праймеров SEQ ID NO: 1 и 2,

(c) секвенирование амплифицированной ДНК,

(d) сопоставление секвенированной ДНК с ДНК нормального гена синаптогирина 1,

(e) идентификацию указанной нонсенс-мутации,

(f) конструирование олигонуклеотидного праймера и/или зонда SEQ ID NO: 3, у которого 3'-конец удлинен до предпоследнего положения указанной мутации,

(g) скрининг указанной нонсенс-мутации с использованием праймера и/или зонда, полученного на стадии (f), и

(h) скрининг указанного аллельного варианта указанной нонсенс-мутации с использованием соответствующих аллель-специфичных олигонуклеотидных зондов и/или праймеров, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4-7,

где стадии (f)-(h) проводят для подтверждения результатов, полученных на стадиях (a)-(d).