СПОСОБ ПОСТАНОВКИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОБЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ МИКОБАКТЕРИЙ Российский патент 2008 года по МПК C12Q1/04 A61B10/00 

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к методам ветеринарной диагностики туберкулеза с.-х. животных, может быть использовано при дифференциальной диагностике туберкулеза вызванного микобактериями птичьего вида.

Известен способ постановки биологической пробы, при котором для определения видовой принадлежности культур возбудителя, по патогенным свойствам для лабораторных животных, заражают внутривенно кроликов суспензией микобактерий в дозе 1 мг бактериальной массы в 1 мл физиологического раствора. Микобактерий бычьего вида вызывает у кроликов генерализованный туберкулез, а микобактерий человеческого вида - единичные очажки в легких и редко в почках, чаще поражения отсутствуют. Микобактерий птичьего вида вызывают у кроликов сепсис, характеризующийся резким увеличением селезенки и гибелью животных в течение 10-30 суток.

Недостатком данного способа является сложность дифференциации культур микобактерий птичьего вида, так как некоторые высокопатогенные штаммы М.avium способны вызывать изменения во внутренних органах кроликов, идентифицируемые при патологоанатомических исследованиях как специфические для М.bovis (Наставление по диагностике туберкулеза животных. - М., 2002. - С.35-40; Бушмелева П.В. Особенности течения птичьего туберкулеза у кроликов. / П.В.Бушмелева, В.Н.Афонюшкин // Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых: Тр. II Междунар. науч.-практ. конф. мол. ученых (20-21 апр. 2006., пос. Краснообск) / РАСХН. Сиб. отд-ние. - Новосибирск, 2006. С.482-487).

Наиболее близким по сущности заявляемого решения является способ постановки биологической пробы для определения видовой принадлежности микобактерий, где для заражения берут кур не моложе 150 суток, живой массой не менее 1.8 кг. Суспензию для заражения птиц готовят по оптическому стандарту мутности вакцины БЦЖ (Лабораторная диагностика туберкулеза: Рекомендации / ВНИИБТЖ; Сост. Хайкин Б.Я., Колычев Н.М., Боганец Н.С., Каримова Л.М. - Омск, 1988. - С.25-28).

Недостатком этого способа является возраст (150 дней) при котором куры достигают веса взрослой птицы (1.8 кг) и большой дозировки культуры микобактерий для характерной патологоанатомической картины, что удлиняет постановку диагноза на птичий туберкулез.

Задачей заявляемого изобретения является сокращение сроков постановки диагноза на птичий туберкулез и отработка оптимальной дозы культуры микобактерий для заражения перепелов, а также определение возраста для заражения.

Поставленная задача решается тем, что в способе постановки биологической пробы для определения видовой принадлежности микобактерий, включающем внутривенное введение птицам суспензии микобактерий, согласно изобретению, суспензию микобактерий вводят в количестве 1 ЕД перепелам массой 120-125 г в возрасте 41 дней.

Выбор в качестве биологической модели для определения видовой принадлежности микобактерий перепелов был обусловлен следующими факторами. Прежде всего, перепела отличаются от кур меньшими размерами тела. В России наиболее распространена японская перепелка московской популяции. У этих перепелок масса тела - 120-125 г. Для содержания перепелов не требуется значительных площадей. Скороспелость этой птицы в три с половиной раза выше, чем у курицы яичной породы. В 10 дней молодняк меняет перо, в 25 - оперяется, в 30 - становится взрослым, а в 40-45 дней начинает нестись. Одна из особенностей перепелов - это самая высокая среди сельскохозяйственных птиц температура тела. Природная устойчивость перепелов к инфекционным болезням позволяет содержать их, не прибегая к вакцинации (Содержание перепелов / Авт. - сост. С.П.Бондаренко. - М.: ООО «Издательство ACT»; Донецк «Сталкер», 2002. - 95 с.). С возрастом природная сопротивляемость животных и птицы туберкулезной инфекции возрастает. При применении одной и той же дозы культуры микобактерий старые животные и птица болеют дольше, чем молодые (Руководство по туберкулезу. / Под ред. Эйнис В.Л., Струкова А.И. // T.1. М., «Медгиз», 1959. - С.187-188). Предлагаемый способ постановки биологической пробы предусматривает использование перепелов, отличающихся живой массой (вес взрослого перепела 120-125 г) и возрастом (41 день).

Предлагаемое решение позволит сократить постановку диагноза на птичий туберкулез за счет возраста и сроков гибели перепелов с момента заражения. Кроме того, предлагаемым способом достигается точное определение вида возбудителя по результатам патологоанатомических исследований павших птиц.

Способ осуществляли следующим образом.

Для постановки биологической пробы использовали 41 дневных перепелов. Суспензию культуры высоковирулентного штамма М.avium (шт.78, НИВИ Нечерноземной зоны РФ) с типичными видовыми свойствами, готовили по оптическому стандарту мутности - 1 ЕД микробных тел/мл, следующим образом. Бактериальную массу, полученную на твердых средах (яичных, картофеле), растирали пестиком в ступке с небольшим количеством физиологического раствора, а затем переливали в пробирку. Суспензию готовили по оптическому стандарту мутности до концентрации 10 ЕД (1 мг сухой вакцины BCJ в 1 мл физиологического раствора или 0.8×10⁹ микробных тел/мл соответственно). Методом разведения получили необходимую концентрацию культуры микобактерий.

Полученной суспензией заражали 6 перепелов (I группа), 41 дневного возраста и массой 120-125 г. Суспензию вводили в подкрыльцовую вену. В качестве контроля для заражения использовали 6 кур (II группа), живой массой не менее 1.8 кг, 150 дневного возраста. Каждой группе птиц вводили свою дозу. Для перепелов доза культуры микобактерий составила 1 ЕД, а для кур 10 ЕД. Объектом исследования служили павшие перепела и куры.

Результаты учета сроков гибели животных и патологоанатомические исследования павших птиц представлены в таблице 1.

Таблица 1ВариантВид птицДоза, ЕДСроки гибели после заражения (дни)Патологоанатомические измененияIперепела124-54 (среднее по группе 35)Дистрофия печени и селезенки, милиарный туберкулез печени и селезенки, почки увеличены с кровоизлияниямиIIкуры1017-82 (41)Дистрофия печени и селезенки, в печени ТВ* очаги размером 2-4 мм, почки увеличены

Из табл.1 видно, что в сравнении с прототипом применение предлагаемого способа позволяет на 7 дней раньше установить диагноз на птичий туберкулез.

Для подтверждения полученных данных приведен следующий пример.

Пример 1

С целью расчета оптимальной дозы, вводимой культуры микобактерий перепелам, проводили следующие исследования. Готовили суспензии из культуры М.avium (шт. 78, НИВИ Нечерноземной зоны РФ) по оптическому стандарту мутности в дозах 10; 1 и 0.1 БД. Перепелов, количеством 36 голов, 41 и 150-дневного возраста разделили на шесть групп по 6 в каждой и заразили одновременно с контрольной группой. В качестве контроля суспензию культуры микобактерий птичьего вида в дозе 10 ЕД вводили 6 курам (VII группа).

Схема опыта

I группа - 6 перепелов 41 дневного возраста (доза 0.1 ЕД); II группа - 6 перепелов 150 дневного возраста (доза 0.1 ЕД); III группа - 6 перепелов 41 дневного возраста (доза 1 ЕД); IV группа - 6 перепелов 150 дневного возраста (доза 1 ЕД); V группа - 6 перепелов 41 дневного возраста (доза 10 ЕД); VI группа - 6 перепелов 150 дневного возраста (доза 10 ЕД); VII группа - 6 кур 150 дневного возраста (доза 10 ЕД);

Результаты исследований, по расчету оптимальной дозы для заражения перепелов культурой микобактерий птичьего вида и возрасту птиц представлены в таблице 2.

Таблица 2ВариантДоза, ЕДВозраст птиц, дниСроки гибели после заражения, дниПатологоанатомические изменения12345I0.14128-86 (среднее по группе 46)Дистрофия печени и селезенки, милиарный туберкулез печени и селезенки, почки увеличены с кровоизлияниямиII 15024-75 (51)Дистрофия печени и селезенки, единичные ТВ^* очаги на печени и селезенке, почки увеличены с кровоизлияниямиIII 4124-54 (35)Дистрофия печени и селезенки, милиарный туберкулез печени и селезенки, почки увеличены с кровоизлияниямиIV115024-60 (40)Дистрофия печени и селезенки, единичные ТВ очаги на печени, почки увеличены с кровоизлияниямиV 4119-47 (31)Дистрофия печени и селезенки, почки увеличены с кровоизлияниямиVI1015021-55 (34)Дистрофия печени и селезенки, почки увеличены с кровоизлияниямиVII 15017-82 (41)Дистрофия печени и селезенки, в печени ТВ^* очаги размером 2-4 мм, почки увеличеныПримечание - ТВ* - туберкулез

Полученные результаты свидетельствуют о том, что сроки гибели птиц III группы на 6 дней раньше IV группы и на 7 дней - контроля соответственно. Перепела из V и VI групп гибли раньше, но без видимых изменений характерных для туберкулеза.

Таким образом, проведенные испытания показали, что наиболее информативный результат по показателям и срокам для подтверждения птичьего туберкулеза получен при внутривенном введении 41-дневным перепелам культуры микобактерий в дозе 1 ЕД. Полученные результаты свидетельствуют о том, что замена кур живой массой не менее 1.8 килограмма и возрастом старше 150 дней на перепелов - 120-125 г сокращает сроки гибели животных в среднем на 7 дней. Кроме того, использование перепелов 41-дневного возраста для постановки биологической пробы при патологоанатомическом исследовании дает более точную патологоанатомическую картину для установления диагноза на птичий туберкулез. Использование перепелов 150-дневного (более взрослых) возраста для идентификации микобактерий туберкулеза птичьего вида нецелесообразно, так как сроки постановки диагноза возрастают (табл.2).

Предлагаемый способ позволяет сократить сроки гибели зараженных птиц, что дает возможность ускорить сроки постановки диагноза на птичий туберкулез. Кроме того, предлагаемый способ наиболее информативен при определении вида возбудителя по результатам патологоанатомических исследований павших птиц.

Предлагаемый способ апробировали в лаборатории по разработке мер борьбы с туберкулезом с.-х. животных ГНУ ИЭВС и ДВ СО Россельхозакадемии в течении 2004-2006 гг.

Изобретение относится к области ветеринарии и может быть использовано при дифференциальной диагностике туберкулеза, вызванного микобактериями птичьего вида. Способ постановки биологической пробы для определения видовой принадлежности микобактерий предусматривает внутривенное введение суспензии микобактерий в количестве 1 ЕД перепелам массой 120-125 г в возрасте 41 дней. Изобретение обеспечивает сокращение сроков постановки диагноза на птичий туберкулез и лучшую информативность при определении вида возбудителя по результатам патологоанатомических исследований павших животных. Способ апробирован в лаборатории по разработке мер борьбы с туберкулезом с/х животных ГНУ ИЭВС и ДВ СО РАСХН в течение 2004-2006 гг. 2 табл.

Способ постановки биологической пробы для определения видовой принадлежности микобактерий, включающий внутривенное введение птицам суспензии микобактерий, отличающийся тем, что суспензию микобактерий вводят в количестве 1 ЕД перепелам массой 120-125 г в возрасте 41 дней.