ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ ШТАММ "ВЛАДИМИР" ВИРУСА ГЕРПЕСА ИНДЕЕК ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВИРУСВАКЦИНЫ ПРОТИВ БОЛЕЗНИ МАРЕКА Российский патент 2008 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии, касается нового штамма вируса герпеса индеек (ВГИ), который может быть использован для изготовления вирусвакцины против болезни Марека.

Болезнь Марека (БМ) - высококонтагиозное, лимфопролиферативное, злокачественное, вирусное заболевание птиц. БМ характеризуется образованием единичных (в начальной стадии) и множественных опухолей во внутренних органах, коже, мышцах, а также изменениями центральной и периферической нервной системы. Вирус болезни Марека (ВБМ) повреждает иммунокомпетентные органы (селезенку, тимус, клоакальную сумку) и обладает, таким образом, иммунодепрессивной активностью, что приводит к снижению общей резистентности птиц и повышению их чувствительности к другим болезням. В связи с этим БМ довольно часто протекает в ассоциации с другими заболеваниями. Важным средством предупреждения БМ и снижения потерь от заболевания является вакцинопрофилактика. Для специфической профилактики используют вакцины трех типов: из аттенуированных штаммов ВБМ (серотип 1), из природно-ослабленного непатогенного ВБМ (серотип 2) и штаммов ВГИ (серотип 3). Основой профилактики БМ является активная иммунизация цыплят в суточном возрасте живыми моно-, би- или поливалентными вакцинами. Большинство известных в мире профилактических препаратов создано на основе штамма FC-126 ВГИ или его комбинаций с известными представителями 1-го и 2-го серотипов ВБМ и надежно защищает привитое поголовье от полевых штаммов ВБМ средней степени патогенности. Однако с появлением в последнее время в птицехозяйствах высоковирулентных штаммов ВБМ участились случаи не всегда достаточной эффективности профилактики БМ при использовании известных вирусвакцин.

Это обстоятельство вынуждает вести постоянный поиск новых штаммов ВГИ, пригодных для изготовления эффективных вакцинных препаратов против БМ.

Известен штамм FC-126 ВГИ 3 серотипа, используемый для изготовления вирусвакцины против БМ (1).

Недостаток данного штамма состоит в том, что изготовленная на его основе вирусвакцина не обеспечивает удовлетворительной защиты против ВБМ, циркулирующего на территории Российской Федерации.

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм «ВНИИЗЖ» (авторское наименование) ВГИ, используемый для изготовления вирусвакцины против БМ и представляющий собой апатогенный генетически однородный вирусный материал, полученный в культуре клеток фибробластов эмбрионов SPF- кур (ФЭК) с инфекционной активностью 2,0-3,0·10⁶ ФОЕ/см³.

Штамм депонирован 30.11.1998 г. во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным наименованием - штамм «ВНИИЗЖ / №110-ДЕП» ВГИ (2).

Недостатком штамма-прототипа является то, что применение вирусвакцины из штамма «ВНИИЗЖ» не исключает выделение вакцинированной птицей возбудителя БМ в окружающую среду.

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в расширении арсенала штаммов ВГИ, обладающих высокой антигенной и иммуногенной активностью и пригодных для изготовления вирусвакцин против БМ, создающих эффективную защиту домашней птицы против БМ и предотвращающих выделение вакцинированной птицей возбудителя БМ в окружающую среду.

Указанная задача решена получением штамма «Владимир» (авторское наименование) ВГИ 3-го серотипа.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма «Владимир», был выделен в 1999 году от здоровых индеек частного сектора в Ростовской области. Производственный штамм «Владимир» ВГИ получен путем последовательного пассирования в культуре клеток ФЭК. Штамм «Владимир» представляет собой апатогенный генетически однородный вирусный материал, активно размножающийся в культуре клеток ФЭК с инфекционной активностью 2,0·10⁶ ФОЕ/см³. Вирусвакцина из штамма «Владимир» индуцирует напряженный иммунитет у привитой птицы.

Штамм «Владимир» ВГИ депонирован 19 июля 2005 года во Всероссийской государственной коллекции штаммов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») под регистрационным номером (ссылкой): штамм «Владимир №124-ДЕП» ВГИ.

Экспериментально подтверждена возможность его использования для изготовления вирусвакцины против БМ. Штамм «Владимир» ВГИ обеспечивает получение вирусвакцины против БМ, создающей защиту птиц против указанного возбудителя инфекции.

Штамм «Владимир» ВГИ характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «Владимир» относится к семейству Herpesviridae, подсемейству Gammaherpesvirinae, роду Herpesvirus, серотипу 3 и является клеточно-связанным вирусом. На основании сравнительного электронно-микроскопического изучения производственного штамма «ВНИИЗЖ» ВГИ и штамма «Владимир» ВГИ при репродукции их в культурах клеток установлена идентичность морфологических характеристик обоих штаммов. Эти вирусы проходили онтогенетический цикл развития в нуклеоплазме, а в цитоплазме - завершающие стадии морфогенеза. Внутриядерный цикл развития включает стадии виропласта, нуклеоида, сборку нуклеокапсида, формирование наружной суперкапсидной мембраны. Наиболее частой формой, присутствующей на всех стадиях культивирования, является нуклеокапсид с нуклеоидом, представленным плотным образованием, заключенным в капсидную белковую оболочку. При электронно-микроскопическом исследовании штамм «Владимир» ВГИ представлен типичными для ВБМ вирионами, имеющими кубический тип симметрии и форму икосаэдра. Вирус обладает полиморфизмом, может быть с оболочкой и без нее. В ядре пораженной клетки вирион имеет величину 90-100 нм, в цитоплазме его размер увеличивается за счет белковой оболочки до 180-200 нм. Оболочка состоит из 162 капсидов, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм «Владимир» ВГИ относится к 3-му серотипу. При введении в организм вызывает латентно протекающую вирусемию. Антитела к данному вирусу обнаруживают в крови цыплят к 14-21-дневному сроку жизни с дальнейшим нарастанием к 40-60 дню. При вакцинации вирус индуцирует образование специфических антител, выявляемых в РДП и ИФА. Активность в РСК не установлена. Концентрированный антиген «Владимир» ВГИ реагирует в РДП со специфическими сыворотками ВГИ и ВБМ.

Выявляются общие антигены с ВБМ в прямой и непрямой РИФ. При разрушении клетки вступает в реакцию с антителами ВГИ и ВБМ в РН. В ИФА вступает в реакцию с антителами к ВГИ и ВБМ. В РЗГА и РГА эритроциты не агглютинирует.

Биотехнологические характеристики

Штамм «Владимир» ВГИ активно размножается в культуре клеток ФЭК. Культивирование фибробластов проводят по общепринятым методикам с использованием смеси сред на основе ГЛА, Игла и 199, взятых в равных частях, с добавлением 10% эмбриональной сыворотки КРС. Клетки фибробластов выращивают во флаконах емкостью 50 см³ и 100 см³ (Повицкого), в матрасах емкостью 1,5 дм³ и в роллерных 3-литровых сосудах. Посевная концентрация клеток составляет 0,6-0,7 млн /см³ для 50 см³ флаконов и 1,2-1,5 млн/см³ для 3-литровых роллерных сосудов. При размножении в монослое куриных фибробластов вирус проявляет ярко выраженные цитопатические изменения в виде однородных фокусов размером 0,1-0,2 мм. При проведении последовательных пассажей в культуре клеток ФЭК инфекционный титр вируса увеличивался и достигал 3,5·10⁶ ФОЕ/см³. Штамм не патогенен для эмбрионов кур. У эмбрионов, инфицированных штаммом «Владимир» ВГИ, при вскрытии отмечали слабовыраженный гепатит, на ХАО-бляшки серовато-белого цвета звездчатой формы размером 0,5-1,0 мм в количестве 30-50 штук. Штамм «Владимир» ВГИ предназначен для изготовления вирусвакцины против БМ.

Хемо- и генотаксономическая характеристика

Штамм «Владимир» ВГИ является ДНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 108-120·10⁶ Д. Нуклеиновая кислота представлена двуцепочечной линейной молекулой. Содержание G+С - 46%. Вирион состоит из нуклеоида, икосаэдрического капсида, асимметрично расположенного вокруг капсида электронноплотного материала, обозначенного как тегумент, и липопротеидной оболочки. Вирионная ДНК участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники в свою очередь расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Основными антигенными белками являются гликопротеины A (gA) и В (gB). Гликопротеин В теряет важную роль в индукции защитного иммунитета и является высококонсервативным среди герпесвирусов. Он представляет собой комплекс трех гликопротеинов: gp49, gp60 и gp100.

С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров, комплементарных консервативному гену gB, кодирующему гликопротеин В, был проведен анализ нуклеотидной последовательности штамма «Владимир» ВГИ.

Контролями служили: эпителий перьевых фолликулов, собранный от цыплят, зараженных штаммом «HPRS -16» вирулентного ВБМ, относящегося к 1-й серологической группе; штамм SB1, относящийся ко 2-й серогруппе, и образцы вакцины из штамма «ВНИИЗЖ» (3-я серогруппа). Для детекции были рассчитаны универсальные для всех типов вируса праймеры М, которые фланкируют фрагмент гена gB размером 450 нуклеотидов. Для типирования использовали внутренние типоспецифические праймеры М, MS и MF, которые комплементарны геномам ВБМ 1 -го, 2-го и 3-го серотипа соответственно. Результаты ПЦР показали наличие специфических ампликанов с праймерами М (421н.), что подтверждало принадлежность генома штамма «Владимир» ВГИ к 3-му серотипу ВБМ. При этом праймер MS (386 н.) взаимодействовал с геномом ВБМ 2-го серотипа, а с праймером MF (380 н.) геном ВГИ 3-го серотипа, что свидетельствовало о методически правильно проведенном опыте и показало высокую специфичность и чувствительность ПЦР применительно к моделям вирусов БМ и ГИ.

Устойчивость к внешним факторам

Устойчивость штамма «Владимир» ВГИ к физическим и химическим факторам характеризуется следующими данными. Центрифугирование при 50000g осаждает вирус в течение 1 часа. В пределах рН 4-10 вирус чувствителен к эфиру. Вирус выдерживает неоднократное замораживание - оттаивание и воздействие ультразвуком в течение 10 минут. Полная термоинактивация вируса происходит при 4°С через 2 недели хранения, при 20-25°С через 4 дня, при 37°С через 18 часов и при 60°С за 10 мин.

Хранение и консервирование

Вирус сохраняется в клеточно-ассоциированном виде в защитной среде с 20% сыворотки крови КРС и 10% ДМСО в герметически запаянных ампулах в жидком азоте при -196°С в течение 24 месяцев.

Патогенные свойства

Не вызывает инфекции у эмбрионов и цыплят, контагиозность не установлена. Лабораторные и домашние животные к вирусу не чувствительны.

Иммуногенность штамма

Штамм «Владимир» ВГИ предохраняет от развития опухолей в дозе 1000 ФОЕ у более 93% цыплят в производственных условиях. Иммуногенность не меняется в течение 5 последовательных пассажей.

Дополнительные признаки и свойства

Штамм «Владимир» ВГИ свободен от контаминации бактериальной и грибковой флорой, чужеродными вирусами и микоплазмами, безвреден в 10-кратной дозе для суточных цыплят.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1

Производственный штамм «Владимир» ВГИ получен путем последовательного пассирования в культуре клеток ФЭК. Для этого в асептических условиях из тушки индеек извлекали почки в чашки Петри, освобождали из капсульной ткани и переносили в плоскодонную колбу. Почечную ткань подвергали измельчению ножницами, промывали раствором Хенкса с антибиотиками (пенициллин со стрептомицином по 100 ЕД/см³). Затем в колбу вносили 0,25% раствор трипсина, опускали в нее стерильный магнит и суспензию подвергали диспергированию на магнитной мешалке в течение 3-7 мин. После окончания диспергирования в жидкость вносили 2% эмбриональной сыворотки от объема суспензии. Затем эту клеточную суспензию из почечной ткани вносили на сформированный монослой культуры клеток ФЭК. Инфицированную культуру переносили в термостат (37,5±1°С) на 2 часа с целью контакта с инокулятом. В дальнейшем по истечению срока контакта инокулят удаляли, монослой промывали раствором Хенкса и вносили питательную поддерживающую среду, состоящую из равных частей 0,5% гидролизата лактальбумина, среды Игла и 199 с 10% эмбриональной сыворотки. Культуру ежедневно просматривали под микроскопом. Через 3 суток провели «слепой» пассаж, т.е. клетками, снятыми с одного флакона без признаков дегенерации монослоя, инокулировали 2 флакона с культурой. Аналогичным способом провели еще один «слепой» пассаж. Через 48 часов в этих флаконах отмечали первые очаги цитопатического действия (ЦПД) вируса, которые характеризовались появлением единичных поликариоцитов по всему монослою. Спустя 24 часа после этого провели третий пассаж. Заражение в этом случае проводили из расчета 1:5. На третьем пассажном уровне по всему монослою обнаружили ЦПД вируса в виде бляшек, характерных для ВГИ. При достижении ЦПД вируса 60-70% монослоя клетки снимали со стекла с помощью диспергирующего раствора по общепринятой методике. Часть клеточной суспензии использовали для проведения следующего пассажа. Другую часть подвергали хранению в жидком азоте по модифицированной в ФГУ «ВНИИЗЖ» методике.

В результате проведенных работ из почек здоровых индеек был выделен штамм ВГИ, которому было присвоено авторское наименование - штамм "Владимир".

Полученный штамм был подвергнут всестороннему контролю в соответствии с Руководством МЭБ по стандартным диагностическим методам и вакцинам (1996) и на уровне 3-го пассажа заложен на хранение в жидкий азот в качестве матровой расплодки (Master seed).

Пример 2

Производственный штамм «Владимир» ВГИ был испытан по следующим параметрам: определение видовой и штаммовой принадлежности; контроль на отсутствие контаминации бактериальной и грибной флорой; контроль на отсутствие контаминации микоплазмами; контроль на отсутствие контаминации чужеродными вирусами; контроль инфекционной активности штамма; контроль безвредности штамма.

Определение видовой и штаммовой принадлежности проводили двумя методами:

- оценка поражений хориоаллантоисной оболочки (ХАО), зараженных в желточный мешок эмбрионов SPF-кур;

- изучение нуклеотидной последовательности методом секвенирования по Сенгеру вПЦР.

При оценке поражений через 13 суток на ХАО обнаружили бляшки серовато-белого цвета звездчатой формы в количестве 15-25 на оболочке, что является характерным для ВГИ.

При изучении нуклеотидной последовательности генома штамма «Владимир» методом секвенирования по Сенгеру показало, что по аминокислотной последовательности вирус соответствует данным ВГИ, представленным в международном генетическом банке.

Контроль на отсутствие контаминации бактериальной и грибной флорой проводили по ГОСТ 28085-89.

Рост бактерий и грибной флоры на всех питательных средах отсутствовал.

Контроль на отсутствие контаминации микоплазмами проводили последовательным пассажем на среду Эдварда и тест-системой «МИК-КОМ» в ПЦР.

Наличие микоплазм в матровых расплодках не обнаружено.

Контроль на отсутствие контаминации чужеродными вирусами проводили методом биопробы на эмбрионах SPF-кур разного возраста и тремя методами заражения. Зараженные эмбрионы инкубировали при 36,5°С: в желточный мешок в течение 13 суток, в аллантоисную полость 6 суток, на ХАО 9 суток. По окончании сроков инкубирования проводили вскрытие эмбрионов с последующим учетом возможных патизменений. Дополнительно проводили электронно-микроскопический контроль методом фазового контрастирования.

Наличие чужеродных вирусов-контаминантов в матровой расплодке не обнаружено.

Контроль инфекционной активности штамма определяли путем титрования вируса в культуре клеток ФЭК.

Титр вируса в матровой расплодке составил 2,0·10⁶ФОЕ/см³.

Контроль безвредности штамма «Владимир» ВГИ определяли путем введения суточным SPF-цыплятам десятикратной дозы вируса. Наблюдение за цыплятами вели в течение 15 суток, учитывая их сохранность и физиологическое состояние.

В течение всего периода наблюдения цыплята оставались клинически здоровыми и при вскрытии на месте введения воспалительных изменений не обнаружено.

В результате проведенных работ матровая расплодка штамма «Владимир» ВГИ оказалась стерильной, контаминация микоплазмами и чужеродными вирусами отсутствовала.

Материал безвреден для суточных SPF-цыплят, специфичен, биологическая активность штамма составила 2,0·10⁶ ФОЕ/см³.

Пример 3

Иммуногенную активность вирусвакцины из штамма «Владимир» ВГИ определяли методом введения 1-й иммунизирующей дозы в количестве 1000 ФОБ вакцинного штамма «Владимир» ВГИ коммерческим цыплятам внутримышечно в объеме 0,2 см³. Цыплята были доставлены из птицефабрики «Верхневолжская» Тверской области.

Контролем опыта при проверке вакцинного штамма «Владимир» ВГИ служили:

- положительный контроль - группа цыплят, иммунизированных вакциной «МАРЕК-БИО», изготовленной ООО «АвиНова»;

- отрицательный контроль - группа цыплят, зараженных вирулентным ВБМ штамм «047»;

- контроль чистоты опыта - группа изолированных интактных цыплят.

Подопытных цыплят содержали в изолированных боксах в течение 90-120 дней с ежедневным учетом их состояния. Был обеспечен обогрев в соответствии с технологическими требованиями, предусмотрен запас полноценных кормов с учетом породы и возраста.

Перед началом опыта образцы биопрепаратов были комиссионно обезличены и зашифрованы. Краской различных цветов была проведена групповая метка цыплят.

Исследуемые препараты вводили внутримышечно в область верхней трети внутренней поверхности бедра в дозах, указанных в паспортах.

Через 21 день после прививки цыплята всех групп, за исключением группы контроля условий содержания, были внутримышечно заражены вирулентным штаммом «047» ВБМ в дозе 1000 ФОЕ/0,2 см³.

Сохранность подопытной птицы регистрировали ежедневно. Трупы павших цыплят подвергали заморозке при минус 20°С и хранили до момента комиссионного вскрытия.

Убой всей птицы с последующим вскрытием и патологоанатомическим исследованием был проведен в 108 - суточном возрасте. Одновременно было проведено патологоанатомическое вскрытие цыплят, павших за весь период опыта.

При вскрытии регистрировали наличие характерных для БМ изменений во внутренних органах. В случае гибели цыплят без признаков БМ у них отбирали пробы патматериала для подтверждения специфичности падежа по результатам гистологического исследования.

Эффективность иммунизации рассчитывали по формуле:

, где:

Э - эффективность иммунизации;

В - % птицы с признаками болезни Марека в вакцинированной группе;

К - % больной птицы с признаками болезни Марека в контрольной группе.

Полученные результаты представлены в таблице.

Из данных таблицы видно, что эффективность иммунизации цыплят вакцинным штаммом «Владимир» ВГИ составила 96,3%, что на 3,8% превышает показатели положительного контроля.

При этом заболело и пало с признаками БМ 50,2% цыплят в контрольной невакцинированной группе.

Пример 4

Жидкую культуральную вирусвакцину против БМ готовят из апатогенного штамма «Владимир» ВГИ. Матриксный штамм и производственные серии вирусвакцины готовят в культуре клеток ФЭК и хранят в жидком азоте. Для получения первичной культуры клеток используют эмбрионы SPF-кур 11-12-суточного возраста. Трипсинизацию эмбрионов проводят по общепринятым методикам. Полученную концентрированную суспензию клеток разводят до посевной концентрации 0,2-0,5 млн/см³ питательной средой, содержащей 30% ГЛА, 30% среды 199, 30% среды Игла и 10% сыворотки КРС (ростовая среда). рН готовой ростовой среды 7,0-7,2. Готовую суспензию разливают в бутыли емкостью 3 дм³ по 400-500 см³. Культуру клеток инкубируют при 38,0±0,5°С в течение 24-36 часов до получения сплошного монослоя на роллерных аппаратах со скоростью вращения 9-10 об/мин. Культуру клеток для титрования вируса культивируют в 50 см³ флаконах (посевная концентрация 0,5-0,6 млн/см³). Через 24-36 часов в сосуде с культурой клеток проводят смену ростовой среды на поддерживающую. Поддерживающая среда содержит равное количество среды ГЛА, сред Игла и 199 с добавлением 2% сыворотки крови КРС. Для приготовления матриксной производственной серии матриксный вирус из штамма «Владимир» ВГИ высевают в сосуды с полученной культурой клеток, залитые поддерживающей средой. Количество ампул с матриксным вирусом, используемых для заражения культуры клеток, определяют, исходя из титра маточного штамма «Владимир» ВГИ. Содержимое ампул объединяют (если позволяет титр вируса, то лучше заражать 1-2 бутыли из одной ампулы) и разводят (или используют без разведения) питательной средой из расчета, чтобы в каждом см³ содержалось 10000 ФОБ. Для первого пассажа необходимо заражать не менее 4 бутылей. К моменту сбора вируса типичные фокусные поражения в культуре клеток должны быть отчетливо видны под микроскопом на 30-50% площади монослоя. Монослой с вирусом снимают трипсином и проводят второй пассаж.

Для этого инфицированными клетками, собранными с одной бутыли, заражают свежий монослой из расчета 1:5-1:10, т.е. 5-10 бутылей, и культивируют монослой до съема вируса в течение 48 часов. Вирус второго пассажа поражает гораздо большую часть клеток: в культуре клеток на 50-70% монослоя образуются симпласты и поликариоциты (крупные многоядерные клетки), которые легко можно увидеть под микроскопом. Монослой с вирусом второго пассажа снимают трипсином. После удаления трипсина в бутыли вносят поддерживающую среду с 10% сыворотки крови КРС и 10% ДМСО.

Собранные суспензии инфицированных клеток объединяют в общем объеме, фасуют по 1-2 см³ в ампулы, которые подвергают замораживанию и хранят в жидком азоте. Объем производственной расплодки должен быть не менее 800-1000 см³ с концентрацией клеток до замораживания 5-10 млн/см³.

Контроль на безвредность проводят на 20 цыплятах однодневного возраста. Вводят 10-кратную иммунизирующую дозу. Наблюдение ведут 15 дней.

Инфекционную активность матриксной расплодки определяют титрованием на 1-2 - суточной культуре клеток ФЭК, выращенной во флаконах емкостью 50 см³. Активность расплодки должна быть не ниже 1,0·10⁵ ФОЕ/см³.

Для контроля стерильности используют 3-4 ампулы. Высевы делают на мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), тиогликолевую среду и среду Сабуро по 5 пробирок каждой среды.

Маточную (посевную) производственную серию вируса контролируют для исключения контаминации возбудителями БМ, инфекционного энцефаломиелита, болезни Ньюкасла, гриппа птиц, инфекционного ларинготрахеита, инфекционного бронхита, оспы птиц.

Контроль проводят методом биопробы на развивающихся эмбрионах кур (РЭК) 4-6, 8-9 и 11-12 - дневного возраста.

В случае выделения вируса - контаминанта его идентифицируют с использованием специфических сывороток методом постановки РГА, РЗГА, РДП или РН по общепринятым методикам.

Для изготовления производственной серии вакцины используют вирус со 2 по 5 последовательных пассажей (от матриксных производственных расплодок) в культуре клеток ФЭК. Клеточно-ассоциированным вирусом заражают культуры клеток и через 72-120 часов инкубации при наличии типичных для вирусов изменений на монослое (60-80% ЦПД) в термальной комнате при 38-40°С производят сбор инфицированных клеток. Для этого инфицированные монослойные культуры клеток обрабатывают 0,125-0,25% раствором трипсина. После удаления трипсина в бутыли вносят поддерживающую среду с 20% сыворотки крови КРС и 10% ДМСО. Объем среды для сбора и суспендирования клеток составляет 0,02-0,04 см³/см площади бутыли. Собранные суспензии инфицированных клеток объединяют в общем объеме. Концентрация клеток в суспензии должна быть 8-10 млн/см³. Собранную суспензию инфицированных клеток разливают по 1 см³ в ампулы емкостью 3-5 см³, которые запаивают, замораживают и хранят в жидком азоте. Объем производственной серии вакцины должен быть не менее 500-600 см³. Для контроля вакцины на инфекционную активность оставляют по 3 ампулы каждой серии вакцины.

Технологический контроль производства вакцины включает: контроль на отсутствие контаминации бактериальной и грибной флорой культуральных питательных сред и растворов, применяемых на каждой стадии технологического процесса, а также полуфабриката вакцины, и контроль инфекционной активности полуфабриката.

Контроль выпускаемой жидкой культуральной вирусвакцины против БМ из штамма «Владимир» ВГИ включает: определение внешнего вида, определение контаминации бактериальной и грибной флорой, определение контаминации микоплазмами, определение контаминации чужеродными вирусами, определение безвредности и инфекционной активности.

Титр вируса в вирусвакцине должен быть не ниже 5,5·10⁵ ФОЕ/см³. За одну прививную дозу принимают 1000 ФОЕ. При разбавлении вакцины разбавителем прививная доза должна содержаться в 0,2 см³. Количество доз в ампуле с готовой вакциной должно составлять 400 или 800 доз. Срок годности вакцины при условии ее хранения в жидком азоте 12 месяцев. Вирусвакцина жидкая культуральная из штамма «Владимир» ВГИ применяется с профилактической целью. Вакцинации подлежит клинически здоровая птица однодневного возраста (в первые часы жизни) однократно. Иммунитет формируется через 14-21 сутки после вакцинации. Вакцину в дозе 1000 ФОЕ/0,2 см³ вводят цыплятам внутримышечно в верхнюю часть внутренней стороны бедра или подкожно в область верхней трети шеи в объеме 0,2 см³.

Источники информации

1. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В. и Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. - М., ВНИТИБП, 1998, 689-721.

2. Патент РФ № 2144562; C12N 7/00, А61К 39/255; 20.01.2000 г.

 Результаты испытаний иммуногенности вакцинного штамма «Владимир» ВГИИспытуемый вирусКол-во цыплят в группе (шт)Кол-во зар. вирул. вирусом (шт)Пало в течение опытаЗабито в конце опытаВсего случаев БМЭффектив. иммунизации, в %ВсегоВ том числе от БМВсегоВ том числе с призн. БМКол-во головВыражение в %Штамм «Владимир» ВГИ60524-48111,996,30«МАРЕК-БИО»55531152123,892,50Контроль вирулент.вируса605523213272850,2-Контроль содержания50-1149346-Примечание: «-» - отрицательный результат

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Получен новый производственный штамм вируса герпеса индеек «Владимир». Вирус репродуцируется в культуре клеток фибробластов эмбрионов SPF-кур (ФЭК). При проведении последовательных пассажей в культуре клеток ФЭК инфекционный титр вируса достигает 3,5·10⁶ ФОЕ/см³. Вирусвакцина на основе указанного штамма используется для профилактики БМ у цыплят суточного возраста. 1 табл.

Производственный штамм «Владимир» вируса герпеса индеек семейства Herpesviridae, подсемейства Gammaherpesvirinae, рода Herpesvirus, серотипа 3, коллекция ФГУ «ВГНКИ» «Владимир №124 - ДЕП», для изготовления вирусвакцины против болезни Марека.