СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ МИКОБАКТЕРИОЗА ЛЕГКИХ НА НЕЛИНЕЙНЫХ ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШАХ Российский патент 2012 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к области ветеринарии и медицины, в частности предназначено для экспериментального изучения микобактериоза, может быть использовано для изучения его патогенеза, тестирования средств профилактики и лечения, разработки методов диагностики микобактериоза, определения степени инфицирования атипичными микобактериями.

В последние годы происходит рост заболеваемости микобактериозами, связанными с распространением иммунодефицитных состояний. Наиболее эффективным средством разработки методов диагностики и лечения микобактериоза является изучение его экспериментальных моделей. Создание новых экспериментальных моделей заболевания позволяет изучать разные стороны его патогенеза. Основная сложность экспериментального изучения микобактериоза заключается в низкой чувствительности лабораторных животных к атипичным микобактериям, являющимся возбудителями микобактериоза (Белобородова А.А. Повышение эффективности лабораторной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота: Автореф. дис. … канд. вет. наук. - Новосибирск, 2008. - 20 с.; Оттен Т.Ф. Микобактериоз / Т.Ф.Оттен, А.В.Васильев. - СПб.: Медицинская пресса, 2005. - 224 с.). Существуют различные способы преодоления низкой чувствительности лабораторных животных к атипичным микобактериям.

Известны способы моделирования микобактериоза на линейных лабораторных животных, имеющих наследственные дефекты иммунной системы (Gangadharam P.R. Murine models for mycobacterioses // Semin. Respir. Infect. - 1986. - Vol. 1. - P. 250-261; T.R.M. Silva, A.L.O.A. Petersen, T.A. Santos, T.F. Almeida, L.A.R. Freitas, P S.T. Veras. Control of Mycobacterium fortuitum and Mycobacterium intracellulare infection with respect to distinct granuloma formations in livers of BALB / c mice // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. - 2010. - Vol. 105(5). - P. 642-648).

Недостатками данных методов являются высокая стоимость линейных животных, высокие требования к оснащению вивариев, наличие у линейных животных генетических дефектов, которых может не оказаться в гетерозиготных популяциях, на которые планируется перенос результатов экспериментов.

Существуют способы моделирования микобактериоза, при которых заражение экспериментальных животных осуществляют в органы, имеющие естественные барьеры для иммунной системы (в тестикул, в головной мозг). (Оттен Т.Ф. Микобактериоз / Т.Ф.Оттен, А.В.Васильев. - СПб.: Медицинская пресса, 2005. - 224 с.; Толстенко Н.Г. Патогенные свойства некоторых видов микобактерий, выделенных от животных и объектов внешней среды: Автореф. дис. … канд. вет. наук. - М., 2006. - 27 с.; Тюри Э.И. Изучение вирулентности условно-патогенных микобактерий / Э.И.Тюри, М.Э.Тюри, О.В. Мартма // Успехи медицинской науки: Тез. докл. науч. конф. - Тарту, 1986. - С.123-125.)

Данные модели воспроизводят микобактериоз, отличающийся по пути проникновения возбудителя в организм животного от обычного пути инфицирования в естественных условиях (инфицирование в естественных условиях чаще происходит через органы дыхания). При данных способах заражения возбудитель развивается, не испытывая обычного воздействия со стороны иммунной системы, что существенным образом меняет патогенез заболевания.

Известны способы моделирования микобактериоза на фоне подавления иммунной защиты животного (Брудная Ю.Е. Новый метод определения вирулентности атипичных и слабовирулентных туберкулезных микобактерий / Ю.Е.Брудная, Н.Ф.Амфитеатрова, Н.М.Калугина // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 1987. - №11. - С.9-12).

Недостатком моделей, в которых используют мощные фармакологические средства подавления иммунитета, являются: активизация условнопатогенных возбудителей (которые часто становятся причиной гибели животных) и искажение патогенеза заболевания.

Наиболее близким к заявленному является способ моделирования микобактериоза легких на нелинейных лабораторных мышах (авторское свидетельство SU 1506473 A1, G09B 23/28. Способ моделирования микобактериоза легких / Александрова А.Е., Лозовская М.Э., Ленинградский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии. - №4348015/28-14, заявл. 23.12.87, опубл. 07.09.89, Бюл. №33), в ходе которого заражение осуществляют путем поочередного введения 0,8-1 мг инфекта в объеме 0,03-0,04 мл в бронхиальное дерево правого и левого легких. Для заражения данным способом требуется проведение хирургической операции под наркозом с использованием разработанного авторами хирургического доступа.

Недостатком данного способа является значительная трудоемкость. Отсутствуют указания на чувствительность данной модели к атипичным микобактериям.

Задачей заявленного способа является расширение арсенала экспериментальных моделей микобактериоза, создание доступной модели микобактериоза, чувствительной к атипичным микобактериям туберкулеза, соответствующей наиболее типичному пути возникновения и развития заболевания.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе моделирования микобактериоза легких на нелинейных лабораторных мышах, включающем внутрилегочное заражение, согласно изобретению проводят заражение мышей массой 20-25 г путем введения культуры M.fortuitum, либо M.scrofulacaeum, либо M.Smegmatis, при этом внутрилегочное заражение обеспечивают инъекционным введением микобактерий в диафрагмальную долю правого легкого по подмышечной линии на глубину 5 мм на фоне алиментарной недостаточности, которую обеспечивают путем постепенного снижения количества полноценного по составу гранулированного корма и установления уровня потребления корма 4 г в сутки, в дозе 0,1-0,15 мг культуры и считают микобактериоз состоявшимся на 28-е сутки после заражения.

Близость предлагаемой модели к формам микобактериоза, обычно возникающим в естественных условия, обеспечивается схожестью пути инфицирования (через органы дыхания), наличием дефекта защитных механизмов в органах дыхания (повреждение легкого в момент инъекции), алиментарной недостаточностью (которая обычно является предрасполагающим фактором возникновения микобактериальных инфекций и часто встречается при туберкулезе и микобактериозах).

Различные экспериментальные модели заболевания воспроизводят разные стороны его патогенеза, поэтому создание и изучение новых экспериментальных моделей способствует формированию более полного представления о заболевании.

Способ осуществляют следующим образом.

Подбирают животных массой 20-25 г. Животных размещают в индивидуальных клетках со сплошным полом. На протяжении 10 суток постепенно снижают количество гранулированного корма до 4 г в сутки. Затем производят заражение в дозе 0,1-0,15 мг культуры, разведенной 0,1 мл физиологического раствора. Место инъекции обрабатывают 70% этиловым спиртом. Инъекцию выполняют шприцем с иглой для внутрикожных инъекций в диафрагмальную долю правого легкого по подмышечной линии на глубину 5 мм.

Параметры способа были определены следующим образом.

Определение оптимальной массы мышей, используемых для заражения.

20 мышей массой 18-35 г содержали в индивидуальных клетках на протяжении 28 суток. Использовались клетки со сплошным полом, обеспечивающие возможность копрофагии. Животных кормили гранулированным кормом для крыс и мышей, содержащим все необходимые питательные компоненты. Доступ к воде был свободным. В течение первых десяти суток количество корма постепенно снижали на 0,5 г в сутки от 9 до 4 г в сутки, достигнув нижней границы нормы потребления гранулированного корма.

Выяснено, что резкое снижение количества корма до данного уровня (в течение 1-2 суток) неблагоприятно сказывается на состоянии мышей. Они становятся вялыми, температура тела падает. Предпочтение отдано полноценному по составу гранулированному корму, содержащему все необходимые для жизни мышей элементы. Снижали лишь количество корма, что упрощает контроль диеты животного. Различия в составе корма разных производителей и разных партий корма одного производителя существенного значения не имеют, поскольку в период адаптации к условиям кормления в течение 10-15 суток происходит выравнивание массы тела животных в соответствии с количеством и качеством корма. Мелкие животные увеличивают массу тела, после чего их рост прекращается. Крупные животные теряют массу, после чего их вес стабилизируется на том же уровне.

После периода адаптации к условиям кормления животные получали по 4 г корма в сутки. Данное количество корма соответствует нормам потребления гранулированного корма для лабораторных мышей, являясь их нижней границей. Внешне мыши оставались здоровыми. Потребность молодых животных в росте обеспечивала состояние алиментарной недостаточности, которая снижает эффективность иммунного ответа в случае возникновения инфекционного заболевания.

Ежедневно животных взвешивали и следили за их состоянием. Отмечено, что животные массой до 20 г на протяжении первой половины эксперимента продолжали расти, не испытывая состояния алиментарной недостаточности. Животные, взятые в эксперимент с массой 20-25 г, были внешне здоровыми на протяжении всего эксперимента. Более крупные животные периодически находились в угнетенном состоянии (табл.1).

Таблица 1 Группы животных Масса животных в группе в начале эксперимента (г) Количество животных в группе Состояние животных при внешнем осмотре 1 2 3 4 1 2 3 4 1 18,0-19,9 5 Здоровы 2 20,0-24,9 5 Здоровы 1 2 3 4 3 25,0-29,9 5 Периодически находятся в угнетенном состоянии на протяжении первой половины эксперимента 4 30,0-35,0 5 Все животные угнетены на протяжении первой половины эксперимента. Далее угнетенное состояние возникало периодически

В ходе опыта установлено, что использовать животных массой менее 20 г не целесообразно, поскольку у них не сразу возникает состояние алиментарной недостаточности. Животные массой более 25 г плохо переносят ограничение корма в количестве 4 г в сутки, особенно в начале периода адаптации к новой диете.

Таким образом, оптимальной массой мышей, отбираемых для эксперимента, определена масса в 20-25 г.

Подбор оптимальной дозы для моделирования.

Заражение различными дозами возбудителя проводили на фоне алиментарной недостаточности по описанной методике. В контрольной группе имитировали заражение введением физиологического раствора. Группы состояли из 7-ми животных. Животных первых трех групп заражали культурой M.fortuitum в дозах 0,03-0,05, 0,1-0,15, 0,4-0,5 мг соответственно. Животных 4, 5, 6-й групп заражали культурой M.scrofulacaeum в дозах 0,03-0,05, 0,1-0,15, 0,4-0,5 мг соответственно. Диагностирование проводили через 28 суток после заражения. Положительным результатом считали наличие четко видимых невооруженным глазом патологических изменений внутренних органов, позволяющих констатировать заболевание, не прибегая к микроскопическим исследованиям. Положительным результатом не считали изменение окраски легких, поскольку данный вид патологии часто встречается при неспецифических воспалительных заболеваниях и в начальных стадиях микобактериоза. Положительным результатом считали появление уплотнений легочной ткани, что встречается при образовании специфических морфологических признаков микобактериоза - гранулем. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 Возбудитель Результат заражения Доза, мг 0,03-0,05 Доза, мг 0,1-0,15 Доза, мг 0,4-0,5 M.fortuitum У всех животных легкие пятнистые, с участками серого и темно-красного цветов. У двух животных уплотнений в легких не найдено У 100% животных в легких обнаружены уплотнения серого и белого цветов размером 0,5-3 мм, в количестве от 3 до десятков штук, видимые без вскрытия легких У 100% животных в легких обнаружены уплотнения серого и белого цветов. У трех животных уплотнены доли легких M.scrofulacaeum У всех животных легкие пятнистые, с участками серого и темно-красного цветов. У трех животных изменения слабо выражены У 100% животных в легких обнаружены уплотнения серого и белого цветов размером 0,5-3 мм, в количестве от 2 до десятков штук, видимые без вскрытия легких У 100% животных в легких обнаружены уплотнения серого и белого цветов. У двух животных уплотнены доли легких

Таким образом, заражение в дозе 0,1-0,15 мг культуры возбудителя гарантирует возникновение микобактериоза у 100% животных, который сопровождается легко фиксируемыми макроскопическими изменениями легких, появлением участков уплотнения в легких. Доза 0,4-0,5 мг является избыточной, поскольку увеличение тяжести заболевания увеличивает риск преждевременной гибели животных в эксперименте. Доза 0,03-0,05 мг является недостаточной, поскольку не всегда способствует развитию четко выраженных патоморфологических изменений.

Определение сроков возникновения патологических изменений.

В ходе опыта животных заражали описанным выше способом в дозе 0,1-0,15 мг культуры возбудителя. Убой осуществляли на 10, 20, 28, 60 сутки после заражения. В контрольных группах имитировали заражение введением физиологического раствора, не содержащего возбудителя. В каждый период в каждой группе было убито по 3 животных. Результаты оценивали на вскрытии макроскопически и путем гистологических исследований легких. Определяли относительный вес внутренних органов в процентах от веса тела. Группы животных, сроки убоя и результаты определения весовых показателей внутренних органов представлены в таблице 3. Из данных, приведенных в таблице 3, видно, что во 2-4 группах животных произошло увеличение данного показателя печени, почек, селезенки на 28 сутки относительно контроля. У мышей с алиментарной недостаточностью (группы 6-8) этот показатель был выше контроля (5 группа с алиментарной недостаточностью) в зависимости от возбудителя на 10-20 сутки с момента заражения.

С 10-х по 20-е сутки после заражения у всех животных в легких выявлены воспалительные изменения: пятна темно-красного и серого цветов на поверхности, выявляемые при осмотре, полнокровие капилляров, утолщение межальвеолярных перегородок, лейкоцитарная инфильтрация, выявляемые при микроскопическом исследовании. Данные воспалительные изменения носят неспецифический характер и встречаются при пневмониях различной этиологии. На основании этих признаков невозможно подтвердить микобактериоз.

Специфический гранулематозный характер воспаления выявлен у всех убитых на 28-е сутки животных, зараженных атипичными микобактериями туберкулеза.

Данные изменения позволяют диагностировать микобактериоз.

Таблица 3 № группы Группы животных Относительный вес внутренних органов, % от веса тела Сердечно-легочный комплекс органов Печень Правая почка Селезенка 10 сут. 20 сут. 28 сут. 60 сут. 10 сут. 20 сут. 28 сут. 60 сут. 10 сут. 20 сут. 28 сут. 60 сут 10 сут. 20 сут. 28 сут. 60 сут. 1 Контрольная 2,29 1,86 1,80 1,94 5,28 6,80 5,62 5,49 0,90 1,00 0,81 0,80 0,44 0,44 0,53 0,50 2 Заражение M.fortuitum 1,68 1,46 1,58 1,68 5,20 6,14 6,04 5,05 0,85 0,87 0,85 0,84 0,42 0,97 0,65 0,25 3 Заражение M.scrofulacaeum 2,39 1,33 1,67 2,14 7,03 5,83 7,12 7,13 1,29 0,96 0,97 1,10 1,13 0,46 0,63 0,58 4 Заражение M.smegmatis 1,79 1,69 1,60 1,72 6,53 6,86 6,21 6,35 0,85 0,86 0,91 0,89 1,19 0,34 0,64 0,42 5. Алиментарная недостаточность без заражения 1,75 1,45 2,26 2,00 4,36 4,73 6,78 4,37 0,70 0,66 0,73 0,71 0,29 0,18 0,41 0,18 6 Алиментарная недостаточность и заражение M.fortuitum 1,44 1,90 1,74 1,73 6,92 6,19 6,64 7,07 0,63 0,72 0,88 0,72 0,34 0,15 0,37 0,27 7 Алиментарная недостаточность и заражение M.scrofulacaeum 2,05 3,37 2,31 2,08 6,53 9,95 7,48 6,74 0,82 1,12 0,77 0,84 0,32 0,66 0,42 0,16 8 Алиментарная недостаточность и заражение M.smegmatis 1,76 1,02 2,18 2,07 6,15 4,96 6,48 5,53 0,81 0,65 0,78 0,82 0,41 0,21 0,41 0,16

На 60-й день после заражения названные патологические изменения прогрессировали. Происходило выпадение волос на голове и спине, на хвостах возникали язвы. Мыши становились малоактивными. Животные контрольных групп были здоровыми.

Таким образом, выяснено, что с 10-х по 20-е сутки после заражения в легких возникают воспалительные изменения неспецифического характера. Гранулематозный характер воспаления выявляется на 28-е сутки после заражения. Данные сроки признаны оптимальными для убоя животных, поскольку наблюдение гранулематозного характера воспаления, специфичного для микобактериальных инфекций, упрощает оценку патоморфологических изменений.

Предлагаемый способ опробован в эксперименте на 8-ми группах мышей (табл.4).

Таблица 4 Группы животных Кол-во животных 1. Контрольная 12 2. Заражение M.fortuitum 10 3. Заражение M.scrofuacaeum 9 4. Заражение M.smegmatis 10 5. Алиментарная недостаточность без заражения 12 6. Алиментарная недостаточность и заражение М.fortuitum 10 7. Алиментарная недостаточность и заражение M.scrofuacaeum 10 8. Алиментарная недостаточность и заражение M.smegmatis 10

Животным 1-й и 5-й групп вводили внутрилегочно 0,1-0,15 мл физиологического раствора по описанной выше методике. На 28-е сутки после заражения животных убивали передозировкой эфирного наркоза. На вскрытии оценивали макроскопические изменения внутренних органов, выполняли гистологические и бактериологические исследования легких, печени, почек, селезенки.

Результаты морфологических исследований легких и бактериологических исследований биоматериала представлены в табл.5.

Таблица 5 № группы Патологические изменения Результаты выделения исходной культуры возбудителя из внутренних органов 1 2 3 1 Не выявлены - 2 Не всегда четко выраженные. Пятна темно-красного и серого цветов размером до 5 мм². Признаки гранулематозного воспаления - 3 Не всегда четко выраженные. Пятна темно-красного и серого цветов размером до 5 мм². Признаки гранулематозного воспаления + 1 2 3 4 Не всегда четко выраженные. Пятна темно-красного и серого цветов размером до 5 мм². Признаки гранулематозного воспаления + 5 Не выявлены. - 6 Четко выраженные у 100% животных. Крупные пятна темно-красного и серого цветов, занимающие большую часть поверхности легких. Уплотнения серого и белого цветов, занимающие до доли легкого. Гранулемы в легких, состоящие из эпителиоидных клеток в центре, окруженные макрофагами и валом из лимфоцитов. + 7 Четко выраженные у 100% животных. Крупные пятна темно-красного и серого цветов, занимающие большую часть поверхности легких. Уплотнения серого и белого цветов, занимающие до доли легкого. Гранулемы в легких, состоящие из эпителиоидных клеток в центре, окруженные макрофагами и валом из лимфоцитов. + 8 Четко выраженные у 100% животных. Крупные пятна темно-красного и серого цветов, занимающие большую часть поверхности легких. Уплотнения серого и белого цветов, занимающие доли легкого. Гранулемы в легких, состоящие из эпителиоидных клеток в центре, окруженные макрофагами и валом из лимфоцитов. +

Примечание: + положительный, - отрицательный.

На 28-е сутки после заражения животные 2-4-й групп по внешним признакам существенно не отличались от контрольных животных. В ходе морфологических исследований на поверхности легких выявлены пятна красного и серого цветов. Площадь пораженных участков варьировала от 1 мм² до 5 мм². В 20% случаев для обнаружения патологических изменений требовался тщательный осмотр органов. При микроскопическом исследовании легких обнаружены признаки неспецифического воспаления (гиперемия, лейкоцитарная инфильтрация), а также гранулемы, состоящие из эпителиоидных клеток, макрофагов, лимфоцитов. Гранулемы имели небольшие размеры (около 100 мкм в диаметре), их поиск требовал значительных усилий, связанных с изготовлением большого количества гистологических препаратов.

У животных зараженных групп с алиментарной недостаточностью к 28-м суткам после заражения наблюдали выпадение шерсти на голове и спине, шерсть стала матовой, у некоторых животных на хвостах появились язвы, активность и температура тела 20% животных снизилась. У 100% животных в легких обнаружены обширные, хорошо заметные патологические изменения. На поверхности легких преобладали пятна серого цвета, встречались возвышающиеся над поверхностью органа уплотнения белого цвета диаметром 0,5-3 мм. Площадь отдельных патологический измененных участков составляла 5 до 10 мм². В ряде случаев встречались поражения целых долей легкого. Гранулемы в легких имели более крупные размеры. Их обнаружение не требовало выполнения серийных срезов легкого. Гранулемы состояли из эпителиоидных клеток, расположенных в центре, снаружи располагался вал из макрофагов. В периферических отделах гранулемы располагался вал из лимфоцитов. Таким образом, использование алиментарной недостаточности способствовало развитию микобактериоза с выраженными, легко поддающимися регистрации патоморфологическими признаками у 100% зараженных животных.

В 5 группе (алиментарная недостаточность с имитацией заражения) животные внешне оставались здоровыми, патологических изменений в легких не выявлено.

Преимуществами предлагаемого способа являются простой способ заражения, чувствительность модели к атипичным микобактериям.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и ветеринарии и предназначено для изучения патогенеза микобактериоза легких, тестирования средств профилактики и лечения, разработки методов диагностики. Моделирование заболевания проводят заражением мышей массой 20-25 г путем введения культуры М.Fortuitum, либо M.scrofulacaeum, либо М.Smegmatis в дозе 0,1-0,15 мг. Внутрилегочное заражение обеспечивают инъекционным введением микобактерий в диафрагмальную долю правого легкого по подмышечной линии на глубину 5 мм. Заражение проводят на фоне алиментарной недостаточности, которую обеспечивают путем постепенного снижения количества полноценного по составу гранулированного корма и установления потребления корма 4 г в сутки. Считают микобактериоз состоявшимся на 28 сутки после заражения. Способ обеспечивает создание доступной модели, чувствительной к атипичным микобактериям туберкулеза, соответствующей наиболее типичному пути возникновения и развития заболевания. 5 табл.

Способ моделирования микобактериоза легких на нелинейных лабораторных мышах, включающий внутрилегочное заражение, отличающийся тем, что проводят заражение мышей массой 20-25 г путем введения культуры М.Fortuitum, либо M.scrofulacaeum, либо М.Smegmatis, при этом внутрилегочное заражение обеспечивают инъекционным введением микобактерий в диафрагмальную долю правого легкого по подмышечной линии на глубину 5 мм на фоне алиментарной недостаточности, которую обеспечивают путем постепенного снижения количества полноценного по составу гранулированного корма и установления потребления корма 4 г в сутки, в дозе 0,1-0,15 мг культуры и считают микобактериоз состоявшимся на 28 сутки после заражения.