СПОСОБ ПОСТАНОВКИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОБЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ МИКОБАКТЕРИЙ Российский патент 2007 года по МПК A61B10/00 

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к методам ветеринарной диагностики туберкулеза с-х животных, может быть использовано при дифференциальной диагностике туберкулеза, вызванного микобактериями бычьего вида.

Известен способ постановки биологической пробы (Наставление по диагностике туберкулеза животных. - М., 2002. - С.35-40), при котором для определения видовой принадлежности культур возбудителя по патогенным свойствам заражают подкожно двух морских свинок суспензией микобактерий в дозе 1 мг бактериальной массы в 1 мл физиологического раствора. Микобактерии бычьего и человеческого видов вызывают у морских свинок генерализованный туберкулез, а микобактерии птичьего вида - местные изменения и увеличения регионарных лимфатических узлов.

Недостатком данного способа является сложность дифференциации культур микобактерии бычьего и человеческого видов.

Наиболее близким по сущности заявляемого решения является способ постановки биологической пробы для определения видовой принадлежности микобактерии, где для заражения берут кроликов живой массой не менее 2 кг. Суспензию для заражения животных готовят методом взвешивания бактериальной массы на аналитических весах (Лабораторная диагностика туберкулеза: Рекомендации / ВНИИБТЖ; Сост. Хайкин Б.Я., Колычев Н.М., Боганец Н.С., Каримова Л.М. - Омск, 1988. - С.27-28).

Недостатком этого способа являются различные сроки гибели кроликов и неинформативные результаты патологоанатомических исследований при заражении животных одной и той же культурой микобактерий, что усложняет постановку диагноза на туберкулез.

Технической задачей заявляемого изобретения является сокращение сроков постановки биологической пробы при установлении диагноза на туберкулез и подбор оптимальной дозы культуры микобактерий для заражения животных.

Поставленная техническая задача решается тем, что в способе постановки биологической пробы, включающем внутривенное введение кроликам суспензии микобактерий, согласно изобретению используют кроликов живой массой 1-1.3 кг при заражении их суспензией культуры микобактерий в дозе 0.1 ЕД.

Сущность изобретения также заключается в том, для постановки биологической пробы используют карликовых (декоративных) кроликов.

Как известно, для воспроизведения туберкулеза в эксперименте наиболее удобными животными являются кролики. Спонтанное заражение их туберкулезом наблюдается редко даже при содержании в одной клетке с инфицированными животными. При подборе животных одной и той же породы, одного и того же возраста и веса индивидуальные различия в течении болезни встречаются нередко. Нужно учесть, что с возрастом природная сопротивляемость животных туберкулезной инфекции возрастает. При применении одной и той же дозы культуры микобактерий старые кролики болеют дольше, чем молодые (Руководство по туберкулезу / Под ред. Эйнис В.Л., Струкова А.И. // T.1. М.: Медгиз, 1959. - С.187-188). Предлагаемый способ постановки биологической пробы предусматривает использование карликовых кроликов того же возраста, что и кролики породы Шиншилла, но отличающихся живой массой (вес взрослого кролика 1-1.8 кг).

При постановке биологической пробы предлагаемым способом достигается сокращение сроков гибели зараженных животных, что дает возможность ускорить постановку диагноза на туберкулез. Кроме того, предлагаемым способом достигается точное определение вида возбудителя по результатам патологоанатомических исследований павших животных.

Способ осуществляли следующим образом.

Для постановки биологической пробы использовали карликовых кроликов. В начале опыта всем животным внутрикожно вводили ППД-туберкулин для млекопитающих в дозе 50 ME (международных единиц) в объеме 0.1 мл физиологического раствора. Реакцию на туберкулин учитывали через 24-48 часов. Биологическую пробу проводили на животных, не сенсибилизированных микобактериями туберкулеза.

Суспензию культуры высоковирулентного штамма M.bovis (шт.14, ВНИИБТЖ) готовили по оптическому стандарту мутности - 0.1 ЕД микробных тел/мл, следующим образом. Бактериальную массу, полученную на твердых средах (яичных, картофеле), растирали пестиком в ступке с небольшим количеством физиологического раствора независимо от штамма (слизистый, крошковатый), а затем переливали в пробирку. Суспензию готовили по оптическому стандарту мутности до концентрации 10 ЕД (1 мг сухой вакцины BCJ в 1 мл физиологического раствора или 0.8×10⁹ микробных тел/мл соответственно). Методом разведения получили необходимую концентрацию культуры микобактерий.

Полученной суспензией заражали 3 карликовых кролика живой массой 1-1.3 кг в краевую вену правого уха. В качестве контроля для заражения использовали 3 кроликов породы Шиншилла живой массой не менее 2 кг. Каждой группе животных вводили свою дозу. Для карликовых кроликов доза культуры микобактерий составила 0.1 ЕД, а для кроликов породы Шиншилла 10 ЕД.

Объектом исследования служили павшие карликовые кролики и кролики породы Шиншилла.

Результаты учета сроков гибели животных и патологоанатомические исследования павших кроликов представлены в таблице 1.

Из табл.1 видно, что по сравнению с прототипом применение предлагаемого способа позволяет на 19 дней раньше установить диагноз на туберкулез.

Таблица 1ГруппаМасса животных, кгСроки гибели животных, дниПатологоанатомическая картинаодногосредняяодного Карликовые кролики1.02325ТВ очаги в легких, печени, селезенке, почках1.219Множественные ТВ очаги в легких и селезенке, единичные ТВ очаги в печени, очаги ТВ в почках1.326ТВ очаги в легких, селезенке и почкахконтроль2.04290*Единичные слитые ТВ очаги в легких, мелкие единичные ТВ очаги в печени2.419ТВ очаги в легких, селезенка и печень увеличенные2.618ТВ очаги в легких, мелкие единичные ТВ очаги в печени, селезенка увеличенаПримечание - * вынужденный диагностический убой; ТВ** - туберкулез

Для подтверждения полученных данных приведены следующие примеры.

Пример 1.

С целью расчета оптимальной дозы, вводимой культуры микобактерий карликовым кроликам, проводили следующие исследования. Готовили суспензии из культуры M.bovis (шт.14, ВНИИБТЖ) по оптическому стандарту мутности в дозах 1; 0.1 и 0.01 ЕД. Карликовых кроликов количеством 9 животных разделили на три группы и заразили одновременно с контрольной группой. В качестве контроля суспензию культуры микобактерий бычьего вида в дозе 10 ЕД вводили трем кроликам породы Шиншилла. Результаты исследований по расчету оптимальной дозы для заражения карликовых кроликов культурой микобактерий бычьего вида представлены в таблице 2.

Таблица 2ГруппаДоза вводимой культурыСроки гибели животных, дниПатологоанатомическая картинасредняяодногоI1 ЕД1810гиперплазия печени и селезенки22ТВ очаги в легких, увеличение печени и селезенки23ТВ очаги в легких, увеличение печениII0.1 ЕД2319Множественные ТВ очаги в легких и селезенке, единичные ТВ очаги в печени, очаги ТВ в почках25ТВ очаги в легких, печени, селезенке, почках26ТВ очаги в легких, селезенке и почкахIII0.01 ЕД4727ТВ очаги в легких и селезенке, гиперплазия печени и селезенки49ТВ очаги в легких, печени, селезенке66ТВ очаги в легких и селезенке, гиперплазия печениконтроль10 ЕД4219ТВ очаги в легких, селезенка и печень увеличенные18ТВ очаги в легких, мелкие единичные ТВ очаги в печени, селезенка увеличена90*Единичные слитые ТВ очаги в легких, мелкие единичные ТВ очаги в печениПримечание - * вынужденный диагностический убой; ТВ** - туберкулез

Таким образом, проведенные испытания показали, что наиболее информативнее по срокам гибели и результатам патологоанатомического вскрытия - доза 0.1 ЕД, т.к. сроки гибели II группы на 24, 19 дней раньше III группы и контроля соответственно.

Пример 2.

Исследования проводили для установления оптимальной массы животного при постановке биологической пробы. Заражали карликовых кроликов суспензией культуры микобактерий бычьего вида, дозой 0.1 ЕД. Животных подбирали в группы по живой массе: I - 0.7-0.9 кг; II - 1-1.3 кг; III - 1.6-1.8 кг. Для контроля брали кроликов породы Шиншилла живой массой не менее 2 кг (доза заражения 10 ЕД).

Сроки гибели кроликов породы Шиншилла, карликовых кроликов и результаты патологоанатомического исследования после вскрытия представлены в таблице 3.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что замена кроликов породы Шиншилла живой массой не менее 2 килограммов, на карликовых кроликов - 1-1.3 кг сокращает сроки гибели животных в среднем на 19 дней. Кроме того, использование карликовых кроликов живой массой 1-1.3 килограмма для постановки биологической пробы при патологоанатомическом исследовании дает более точную патологоанатомическую картину для установления диагноза на туберкулез.

Таблица 3Масса животных, кгСроки гибели животных, дниПатологоанатомическая картинагруппыодногосредняяодногоКонтроль 2.0-2.62.04290*Единичные слитые ТВ** очаги в легких, мелкие единичные ТВ очаги в печени2.419ТВ очаги в легких, селезенка и печень увеличенные2.618ТВ очаги в легких, мелкие единичные ТВ очаги в печени, селезенка увеличенаI 0.7-0.90.72227ТВ очаги в легких и селезенке, гиперплазия печени0.8512ТВ очаги в легких, селезенка и печень увеличенные0.8527ТВ очаги в легких, селезенке и печениII 1.0-1.31.02325ТВ очаги в легких, печени, селезенке, почках1.219Множественные ТВ очаги в легких и селезенке, единичные ТВ очаги в печени, очаги ТВ в почках1.326ТВ очаги в легких, селезенке и почкахIII 1.6-1.81.62719Множественные ТВ очаги в легких, единичные ТВ очаги в печени1.725ТВ очаги в легких и селезенке, гиперплазия печени1.836Множественные ТВ очаги в легких, ТВ очаги в селезенке, единичные ТВ очаги в почкахПримечание - *вынужденный диагностический убой; ТВ** - туберкулез

Предлагаемым способом достигается сокращение сроков гибели зараженных животных, что дает возможность сократить сроки постановки диагноза на туберкулез. Кроме того, предлагаемый способ наиболее информативен при определении вида возбудителя по результатам патологоанатомических исследований павших животных.

Предлагаемый способ апробировали в лаборатории по разработке мер борьбы с туберкулезом с.-х. животных ГНУ ИЭВС и ДВ СО РАСХН в течение 2003-2005 гг.

Изобретение относится к области ветеринарии. Способ включает внутривенное введение карликовым кроликам живой массой 1-1.3 кг суспензии микобактерий в дозе 0.1 ЕД. Способ наиболее информативен при определении вида возбудителя по результатам патологоанатомических исследований павших животных, кроме того, при данном способе достигается сокращение сроков постановки диагноза на туберкулез. 3 табл.

Способ постановки биологической пробы для определения видовой принадлежности микобактерий, включающий внутривенное введение кроликам суспензии микобактерий, отличающийся тем, что суспензию микобактерий вводят карликовым кроликам живой массой 1-1,3 кг в дозе 0,1 ЕД.