СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЯЖЕЛОГО ТЕЧЕНИЯ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ ПОЛИНЕЙРОПАТИИ У ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/68 G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к детской эндокринологии, и может быть использовано для прогнозирования тяжелого течения диабетической периферической полинейропатии (ДПНП) у детей и подростков, страдающих сахарным диабетом 1 типа (СД 1).

Изучение ДПНП у детей и подростков является чрезвычайно актуальным. Это связано с тем, что, несмотря на высокую распространенность ДПНП, в данной возрастной категории больных преобладают нетяжелые субклинические формы, что приводит к поздней диагностике, несвоевременной терапии и прогрессированию этого инвалидизирующего осложнения с развитием «синдрома диабетической стопы» даже у лиц молодого возраста.

Это, в свою очередь, диктует необходимость поиска маркеров прогнозирования тяжелого течения диабетической периферической полинейропатии у детей и подростков. В настоящее время модель развития ДПНП при СД 1 представляет собой многостадийный процесс, включающий целый каскад патогенетических механизмов, пусковым звеном которых является гипергликемия вследствие недостатка инсулина. Ведущая роль в генезе ДПНП отводится метаболической теории патогенеза, в частности дисфункции нейротрофических факторов, приводящих к первичному поражению периферических нервов. Полученные данные согласуются с нашими предыдущими исследованиями (Г.А.Галкина, А.А.Афонин, Н.В.Морозова, 2005), установившими, что при повышении уровня мозгового нейротрофического фактора (BDNF) выше 9000 пкг/мл у детей и подростков с СД 1 без клинических признаков ДПНП появляются начальные патологические изменения ЭМГ, свидетельствующие о субклинической стадии ДПНП (увеличение резидуальной латентности, незначительное снижение амплитуды М-ответа при проведении методики СРВ, снижение амлитудно-частотных параметров на ЭМГ наиболее дистальных из обследуемых мышц, длинных разгибателях пальцев стопы). Повышение концентрации изучаемых нейротрофических факторов: мозгового и цилиарного нейротрофического фактора (ciliary neurotrophic factor - CNTF), вероятно, обусловлено рефлекторной экспрессией BDNF и CNTF шванновскими клетками в ответ на начинающиеся дегенеративные изменения аксонального аппарата с целью улучшения нейротрофики.

В качестве прототипа нами выбрано изобретение «Способ прогнозирования диабетической периферической нейропатии у детей и подростков» (патент на изобретение №2273028 от 27.03.2006 г.), установившего, что повышение уровня мозгового нейротрофического фактора BDNF выше 9000 пкг/мл у детей и подростков с СД 1 может являться ранним прогностическим признаком формирования субклинической стадии ДПНП, предшествующим электрофизиологическим изменениям.

Однако данный способ может быть использован только для диагностики субклинической стадии и прогнозирования развития ДПНП, его нельзя использовать для оценки тяжести течения данного осложнения, несвоевременная диагностика которого приводит к синдрому диабетической стопы и ампутации конечностей.

В настоящее время для определения степени тяжести периферической полинейропатии используется шкала Нейропатического Дисфункционального счета (НДС), используемая эндокринологами и диабетологами повсеместно. Шкала НДС включает суммарную количественную оценку тактильной, температурной, болевой, вибрационной чувствительности и нарушений сухожильных рефлексов (Young M.J., Boulton A.J.M., Macleod A.F., Williams D.R.R., Sonsken P.H. A multicentre study of the prevalence of diabetic peripheral neuropathy in the United Kingdom hospital clinic population. // Diabetologia. - 1993. - Vol.36. P.150-154).

Для каждого вида нарушения чувствительности рассчитывается средняя величина по формуле: (х1+х2):2, где х1 - и х2 - цифровое значение (в баллах) нарушения чувствительности на левой и правой нижних конечностях. Сумма средних значений каждого вида чувствительности и каждого из периферических рефлексов (на каждой конечности) и составляет значение шкалы НДС. При значении НДС 0-4 балла - у пациента отсутствуют начальные признаки ДПНП, при 5-13 баллах - имеется умеренно выраженная ДПНП, а при 14 баллах и более имеется выраженная ДПНП.

Недостатки данной методики в том, что дети и подростки не всегда могут четко ответить на поставленные вопросы, а также проанализировать эффект от проводимого воздействия. Кроме того, информативность методики во многом зависит от возраста ребенка, его эмоционального статуса, условий проведения проб (в спокойном и расслабленном состоянии), состояния кожных покровов (наличие трофических изменений, отечности); в связи с чем диагностическая значимость шкалы НДС для диагностики и прогнозирования степени тяжести ДПНП в педиатрической практике невелика и носит субъективный характер.

Указанные недостатки устраняются в заявляемом изобретении.

Задачей изобретения является разработка высокочувствительного критерия, с помощью которого можно прогнозировать тяжелое течение ДПНП у детей и подростков, что позволит выбрать адекватную тактику ведения больного и предотвратить развитие необратимых осложнений.

Поставленная задача решается тем, что у пациентов серологическим методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) определяют уровень цилиарного нейротрофического фактора в сыворотке крови и при его концентрации 5,8 пкг/мл и ниже прогнозируют тяжелое течение ДПНП.

Новый технический результат, получаемый при использовании данного метода, состоит в том, что достигается возможность в кратчайшие сроки (не более 4 часов) и с высокой точностью осуществить прогноз неблагоприятного развития заболевания с целью принятия адекватных терапевтических мер.

С помощью разработанного макроса в среде Exell, используя метод расчета ROC-кривой, нами была получена таблица чувствительности и специфичности, анализ которой позволил найти точку разделения (cutoff frequency) концентраций CNTF - 5,8 пкг/мл. Анализ полученных данных позволил доказать, что при значениях CNTF 5,8 пкг/мл и ниже у 16 детей и подростков развивалось тяжелое течение ДПНП, характеризующееся комплексом клинических симптомов и электромиографических параметров.

Учитывая, что основным предполагаемым местом экспрессии CNTF в периферической нервной системе являются шванновские клетки, снижение концентрации нейротрофина, вероятно, обусловлено истончением миелиновой оболочки и истощением, соответственно, резервных возможностей экспрессии (М. Prugining-Bluger et al., 1997; К. Obata et al., 2004), чем можно объяснить ухудшение клинических и электрофизиологических параметров у пациентов. Исходя из этого, мы изучили роль цилиарного нейротрофического фактора (ciliary neurotrophic factor, CNTF) в формировании ДПНП у детей и подростков, страдающих СД 1.

Цилиарный нейротрофический фактор относится к семейству нейротрофических цитокинов (Stankoff В. et.al. Ciliary neurotrophic factor (CNTF) enhances myelin formation: a novel role for CNTF and CNTF - related molecules. // J. Neurosci.2002. - Vol.22. - №21. - P.9221-9227), которые регулируют фенотип нейромедиаторов, дифференцировку глиальных и предшественников нервных клеток и способствуют выживанию (регенерации) дифференцированных нейронов (Ip NY. The neurotrophins and neuropoietic cytokines: two families of growth factors acting on neural and hematopoietic cells. // Ann. N Y Acad. Sci. - 1998. - Vol.840. - P.97-106).

В настоящее время исследования, посвященные свойствам и механизму действия CNTF, носят в основном экспериментальный характер.

Согласно современным представлениям CNTF локализуется преимущественно в шванновских клетках больших миелинизированных волокон и астроцитах 1 типа (Rende М., Muir D., Hagg Т. et al. Localization and characterization of ciliary neuronotrophic factor in peripheral nerve. // Glia. - 1992. - Vol.5. - P.25-32).

В основе формирования ДПНП лежит прогрессирующая потеря миелинизированных волокон - аксональная дегенерация и сегментарная демиелинизация, вследствие которых нарушаются процессы проведения импульсов по нервному волокну [Сивоус Г.И., Строков И.А., Касаткина Э.П. Диабетическая периферическая сенсорно-моторная полиневропатия у детей и подростков: нейрофизиология, патогенез, клиника, диагностика. // Пособие для врачей. - 2002. - С.1-24; Dyck P.J., Thomas P.K. Diabetic Neuropathy / W.B.Saunders Compani. - 1999. - 573р.]. При демиелинизации страдает или утрачивается миелиновая оболочка. Таким образом, когда потенциал действия (ПД) достигает демиелинизированного участка, плотность проведения тока на единицу площади мембраны уменьшается вместе со снижением ее сопротивления. Плотность потока возбуждения, необходимая для деполяризации аксона, вследствие этого уменьшается, снижается амплитуда ПД и скорость распространения возбуждения (СРВ) по нерву.

В целом ряде экспериментальных работ была установлена экспрессия CNTF шванновскими клетками в ответ на повреждающий фактор (Sendtner М., Schmalbruch H., Stockli K.A. et al. Ciliary neurotrophic factor prevents degeneration of motor neurons in mouse mutant progressive motor neuronopathy. // Nature. - 1992. - Vol.358. - P.502-504). Отмечена также активность данного нейропротеина в миелине (Friedman В., Scherer S.S., Rudge J.S et al. Regulation of ciliary neurotrophic factor expression in myelin-related Schwann cells in vivo // Neuron. - 1992. - Vol.9. - P.295-305), увеличение ретроградного аксонального транспорта CNTF после повреждения нерва, а также увеличенная его экспрессия в мышечной ткани, повышение активности рецептора CNTFR {альфа} в нервах (Davis S., Aldrich Т.Н., Ip N.Y. Released form of CNTF receptor {alpha} component as a soluble mediator of CNTF responses // Science. - 1993. - Vol.259. - P.1736-1739).

Таким образом, цилиарный нейротрофический фактор является плейотропным для центральных, периферических и сенсорных нейронов (Peterson WM, Wang Q, Tzekova R.et al. Ciliary neurotrophic factor and stress stimuli activate the Jak-STAT pathway in retinal neurons and glia // J. Neurosci. - 2000. - Vol.20. - №11. - P.4081-4090). Дальнейшими экспериментами подтверждено, что CNTF является одним из необходимых белков для поддержания функции нейронов (Emery В., Cate H.S., Marriott M. et al. Suppressor of cytokine signaling 3 limits protection of leukemia inhibitory factor receptor signaling against central demyelination // PNAS. - 2006. - Vol.103. - №20. - P.7859-7864).

Учитывая, что шванновские клетки оказывают влияние на функцию аксонов, вероятно, что дефицит CNTF в результате активации полиолового пути в шванновских клетках также усугубляет нарушения в периферических нервах при экспериментальном диабете, что было подтверждено исследованиями А.Р. Mizisin (Mizisin A.P., Vu Y., Shuff M., Calcutt N.A. Ciliary neurotrophic factor improves nerve conduction and ameliorates regeneration deficits in diabetic rats // Diabetes. - 2004. - Vol.53. - P.1807-1812).

Таким образом, можно сделать заключение о том, что в основе клинических проявлений диабетической периферической нейропатии лежат гибель или дегенерация нейронов, шванновских клеток и нервных волокон. Имеющиеся экспериментальные данные открыли возможности нового подхода к оценке тяжести течения данной патологии, определения роли CNTF в формировании диабетической полинейропатии, что легло в основу предлагаемого изобретения.

Работоспособность изобретения подтверждается следующими конкретными примерами.

Пример №1.

Пациент Павел И., 14 лет, история болезни №1432, наблюдается в детском эндокринологическом отделении РНИИАП в течение 5 лет по поводу сахарного диабета I типа. Течение заболевания лабильное, сопровождающееся частыми гипогликемическими состояниями, связанными с физической нагрузкой. Самоконтроль нерегулярный. Уровень гликозилированного гемоглобина - 7,1% свидетельствует о субкомпенсации СД 1. Жалоб мальчик не предъявляет. Суточная потребность в инсулине составляет 1,0 Ед/кг массы тела. При обследовании неврологического статуса выявлено незначительное снижение коленных и ахилловых рефлексов с обеих сторон, снижение тактильной чувствительности до 1 балла с обеих сторон, при сохраненной температурной, болевой и вибрационной чувствительности. Согласно шкале нейропатического дисфункционального счета (НДС) данные изменения были расценены в 3 балла, что соответствовало варианту нормы. При проведении ЭМГ исследования выявлены снижение амплитудно-частотных характеристик на длинных разгибателях пальцев стопы - наиболее дистальных из обследуемых мышц. Анализ ЭМГ - параметров на икроножных и передних большеберцовых мышцах с обеих сторон не выявил отклонений от электрофизиологических стандартов. При исследовании моторного нерва по методике СРВ выявлено снижение амплитуды М - ответа, а также снижение потенциала действия на сенсорном нерве. На основании вышеперечисленных данных ребенку, согласно классификации P.J.Dyck, P.K.Thomas (1999) был поставлен диагноз: диабетическая периферическая полинейропатия, субклиническая стадия (1Б).

У пациента из локтевой вены взяли 1 мл венозной крови, центрифугировали 5 минут при 1500 об/минуту. Полученную сыворотку развели 1:20 дилюентом, для этого 10 мл сыворотки соединили со 190 мл дилюента. 50 мл полученной разведенной сыворотки использовали для определения цилиарного нейротрофического фактора в микротиражных лунках планшет от набора для определения CNTF серологическим методом твердофазного иммуноферментного анализа диагностическими наборами фирмы R@D Systems (США) по прилагаемой инструкции.

Результаты подсчитывали на фотометре (Labsystem Multiscan plus, Финляндия) в течение 15 минут. В компьютерное обеспечение прибора вводили значения концентрации CNTF в стандартных образцах и, таким образом, при считывании оптической плотности всех проб сразу получали значения искомых концентраций CNTF в исследуемых разведенных образцах. Полученные значения концентраций умножали на фактор разведения 20.

Уровень CNTF в сыворотке у данного ребенка составил 5,9 пкг/мл. По нашим данным это свидетельствовало о легком течении ДПНП. Лечебные мероприятия включали проведение интенсивной инсулинотерапии с целью коррекции углеводного обмена. При плановой госпитализации через 6 месяцев состояние ребенка оставалось стабильным, не выявлена отрицательная динамика функциональных и электрофизиологических тестов. Таким образом, из данного примера следует, что уровень CNTF 5,9 пг/мл свидетельствует о легком течении и исключает прогрессирование ДПНП.

Пример №2.

Пациент Глеб А., 15 лет, история болезни №637, наблюдается в детском эндокринологическом отделении в течение 4 лет с диагнозом сахарный диабет I типа. За прошедший год отмечалось декомпенсированное кетоацидотическое состояние, связанное с нарушением режима дието- и инсулинотерапии. Самоконтроль заболевания нерегулярный. Суточная потребность в инсулине - 1,1 ЕД/кг массы тела. Уровень гликозилированного гемоглобина - 7,2%, что свидетельствует о субкомпенсации СД 1. Жалоб не предъявляет. Суммарная оценка по шкале НДС составила 4 балла за счет снижения коленных и ахилловых рефлексов с обеих сторон (2 балла), нарушения тактильной (1 балл) и температурной (1 балл) чувствительности. Нарушений со стороны вибрационной чувствительности не выявлено. Данные ЭМГ исследования: при проведении методики СРВ обнаружено снижение амплитуды М-ответа, снижение потенциала действия, повышение резидуальной латенции.

Уровень CNTF в сыворотке крови составил 5,8 пкг/мл, что по нашим данным свидетельствовало о возможности тяжелого течения ДПНП, при отсутствии патогенетической терапии.

Пациенту установлен диагноз: диабетическая периферическая полинейропатия, субклиническая стадия (1Б). Проводимое лечение, помимо интенсивной инсулинотерапии, включало назначение нейропротекторов. При повторном плановом поступлении через 6 месяцев у мальчика отсутствовала клиническая симптоматика, отмечена положительная динамика нейрофизиологических параметров.

Таким образом, у пациента с субклинической стадией ДПНП, уровень CNTF в сыворотке крови - 5,8 пкг/мл позволил нам прогнозировать тяжелое течение ДПНП, однако своевременное назначение нейротропной терапии позволило предотвратить прогрессирование (формирование тяжелого течения) ДПНП.

Пример №3.

Ребенок Алексей П., 14 лет, история болезни №1289, наблюдается в детском эндокринном отделении РНИИАП в течение 3 лет по поводу сахарного диабета 1 типа. Самоконтроль заболевания нерегулярный, гипогликемические состояния отмечаются 2 раза в месяц. Суточная потребность в инсулине - 1,1 Ед/кг массы тела. Зарегистрирован субоптимальный уровень гликозилированного гемоглобина - 7,7%, что свидетельствовало о субкомпенсированном течении СД 1. Жалоб нет. Суммарная оценка всех видов чувствительности по шкале НДС составила 3 балла, что соответствовало норме. Данные ЭМГ: электрофизиологическая характеристика электрической активности обследуемых мышц аксонального типа. Изменения на ЭМГ длинного разгибателя пальцев стопы справа и слева и слева легкой степени выраженности (незначительное урежение частотных характеристик), что укладывается в параметры физиологических сдвигов. При исследовании более проксимальных отделов мышц нижних конечностей (переднебольшеберцовых и икроножных справа и слева) по методике СРВ выявлено снижение амплитуды М - ответа, а также снижение потенциала действия на сенсорном нерве.

Уровень CNTF в сыворотке крови ребенка составил 5,7 пкг/мл, что позволило по нашим данным прогнозировать тяжелое течение ДПНП и требовало назначения патогенетической терапии нейропротекторными препаратами.

Пациенту установлен диагноз: диабетическая периферическая полинейропатия, субклиническая стадия (1Б). Ребенку было назначено, помимо инсулинотерапии, лечение нейропротекторами. Однако мать не выполнила рекомендаций в полном объеме. Ребенок не получал нейропротекторную терапию.

При поступлении через 6 месяцев выявлена отрицательная динамика: появились жалобы на жжение и онемение в нижних конечностях, суммарная оценка температурной, болевой, вибрационной чувствительности по шкале НДС составила 6 баллов, отмечалась отрицательная динамика по данным ЭМГ исследования, преимущественно со стороны длинного разгибателя пальцев стопы обеих ног.

Таким образом, из данного примера следует, что снижение уровня CNTF ниже 5,8 пкг/мл позволило прогнозировать тяжелое течение ДПНП. Данный прогноз реализовался в связи с отсутствием должного лечения, что привело к прогрессированию патологического процесса в нижних конечностях у больного с СД 1.

Таким образом, показатели CNTF 5,8 пкг/мл и ниже у пациентов с ДПНП позволяют прогнозировать тяжелое течение ДПНП и требуют проведения патогенетической терапии.

Нами было обследовано 174 пациента (88 детей и 86 подростков) с сахарным диабетом 1 типа с длительностью заболевания от 3 месяцев до 14 лет, у которых изучалось содержание CNTF в сыворотке крови, определяемое методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Контрольную группу составили 19 детей и подростков без нарушений углеводного обмена и отягощенного неврологического анамнеза.

При анализе уровня CNTF было установлено достоверно значимое его повышение в сыворотке крови у наблюдаемых больных с СД 1 [20,91 (10,84; 47,4) пкг/мл], относительно контрольных данных [12,2 (10,3; 18,3) пкг/мл], р=0,026. Достоверно более высокие значения CNTF, по сравнению с контрольной группой, отмечались у пациентов с ДПНП [22,7 (11,0; 51,2) пкг/мл], р=0,018, причем особо значимые различия были зарегистрированы у пациентов с субклинической стадией ДПНП [24,7 (14,4; 51,2) пкг/мл], р=0,018. Разделение больных по группам осуществлялось согласно принятой в настоящее время в диабетологии классификации P.J.Dyck, P.K.Thomas (1999). Причем, у пациентов с субклинической стадией ДПНП отмечался более высокий уровень CNTF, чем у пациентов без ДПНП [19,5 (10,7; 26,9) пг/мл], р=0,015. В последующем, по мере прогрессирования ДПНП отмечалось снижение экспрессии CNTF у больных с клиническими проявлениями ДПНП [19,5 (5,1; 51,5) пкг/мл]. Следует отметить, что наиболее низкие значения были зарегистрированы у 16 подростков с тяжелым течением ДПНП.

Все 16 подростков с низкими значениями CNTF были с длительностью СД 1 более 10 лет, с неудовлетворительным контролем, лабильным течением, наличием в анамнезе гипо- и/или гипергликемических ком, высокой суточной потребностью в инсулине, с сопутствующими диабетическими осложнениями. У данной группы пациентов выявлены также наиболее патологические ЭМГ параметры. Так, при проведении методики СРВ выявлено резкое снижение амплитуды М-ответа (<0,58 мв), СРВ по двигательному и сенсорному нервам (<40 м/с). Показатель резидуальной латентности, свидетельствующий о проведении возбуждения по наиболее дистальным отделам, превышал более чем в 2 раза нормативные параметры - 6,78 (5,47; 7,66) м/с. Все указанные патологические характеристики свидетельствовали не только о вовлечении в патологический процесс аксонального аппарата, но и о происходящей демиелинизации, что характерно для тяжелого течения ДПНП.

Исследование уровня CNTF в сыворотке крови у пациентов с диабетической периферической полинейропатией показало, что точность заявляемого способа составила 93%, чувствительность - 76%, специфичность - 95,5%.

Предлагаемый нами способ исключает наличие субъективизма, не зависит от возраста, эмоционального статуса пациента, позволяет прогнозировать тяжелое течение ДПНП и тем самым снижать риск развития тяжелого инвалидизирующего осложнения СД1. Предложенный маркер имеет чрезвычайно важное значение для практической эндокринологии, так как в детском возрасте начальные проявления этого грозного осложнения протекают незаметно и быстро прогрессируют при отсутствии своевременной патогенетически обоснованной терапии.

Исходя из вышеизложенного заявляемый способ прогнозирования тяжелого течения ДПНП у детей и подростков, по сравнению с существующими, имеет следующие преимущества:

1. Способ относится к методам экспресс-диагностики (время выполнения - 4 часа).

2. Предлагаемый способ обладает высокой точностью.

3. Способ позволяет прогнозировать тяжелое течение ДПНП у детей и подростков.

Заявляемый способ прогнозирования тяжелого течения диабетической периферической полинейропатии может широко использоваться в эндокринологии, диабетологии.

Изобретение относится к медицине, в частности эндокринологии и диабетологии, и может найти применение для прогнозирования тяжелого течения диабетической периферической полинейропатии (ДПНП) у детей и подростков, страдающих сахарным диабетом 1 типа. Сущность способа прогнозирования: в периферической крови определяют уровень цилиарного нейротрофического фактора - CNTF методом твердофазного иммуноферментного анализа. Обнаружение в сыворотке крови CNTF 5,8 пкг/мл и ниже свидетельствует о возможности тяжелого течения ДПНП. Использование способа позволяет с высокой точностью осуществить прогноз неблагоприятного развития заболевания с целью принятия адекватных терапевтических мер.

Способ прогнозирования тяжелого течения диабетической периферической полинейропатии у детей и подростков, страдающих сахарным диабетом 1 типа, путем исследования крови, отличающийся тем, что в периферической крови серологическим методом твердофазного иммуноферментного анализа исследуют цилиарный нейротрофический фактор и при его значениях 5,8 пкг/мл и ниже прогнозируют тяжелое течение диабетической периферической полинейропатии.