Способ прогнозирования риска развития диабетической дистальной полинейропатии у жителей Центральной России с сахарным диабетом 2 типа на основе генотипирования полиморфизма rs12542298 гена HSF1 Российский патент 2024 года по МПК G01N33/52 G01N33/49 C12Q1/6804 C12Q1/6827 C12Q1/6876 C12Q1/6883 

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития диабетической дистальной полинейропатии у жителей Центральной России с сахарным диабетом 2 типа.

Сахарный диабет 2 типа (СД2) – самое распространенное метаболическое заболевание, связанное с нарушением углеводного обмена [Дедов И.И., Шестакова М.В., Майоров А.Ю., Викулова О.К., Галстян Г.Р., Кураева Т.Л. и др. Алгоритмы специализированной медицинской помощи больным сахарным диабетом/ Под редакцией И.И. Дедова, М.В. Шестаковой, А.Ю. Майорова. – 9-й выпуск. Сахарный диабет. 2019;22(1S). doi:10.14341/DM221S1]. Основными патогенетическими механизмами считают нарушение секреции инсулина и инсулинорезистентность [Дедов И.И., Шестакова М.В. Сахарный диабет типа 2: от теории к практике. МИА; 2016; 576 p.]. Течение СД2 сопровождается манифестацией различных осложнений, в число которых входит диабетическая дистальная полинейропатия [Yi-Ching Weng, Sung-Sheng Tsai, Rong-Kuo Lyu, Chun-Che Chu, Long-Sun Ro, Ming-Feng Liao, Hong-Shiu Chang, Chiung-Mei Chen, Jawl-Shan Hwang, Hung-Chou Kuo, "Diabetic Distal Symmetrical Polyneuropathy: Correlation of Clinical, Laboratory, and Electrophysiologic Studies in Patients with Type 2 Diabetes Mellitus", Journal of Diabetes Research, vol. 2020, Article ID 6356459, 11 pages, 2020. https://doi.org/10.1155/2020/6356459/]. Диабетическая дистальная полинейропатия (ДПН) – поражение периферического отдела нервной системы, происходящее на фоне хронической гипергликемии при СД2 [Gylfadottir S.S., Christensen D.H., Nicolaisen S.K., Andersen H., Callaghan B.C., Itani M., Khan K.S., Kristensen A.G., Nielsen J.S., Sindrup S.H., Andersen N.T., Jensen T.S., Thomsen R.W., Finnerup N.B. Diabetic polyneuropathy and pain, prevalence, and patient characteristics: a cross-sectional questionnaire study of 5,514 patients with recently diagnosed type 2 diabetes. Pain. 2020 Mar;161(3):574-583. doi: 10.1097/j.pain.0000000000001744. PMID: 31693539; PMCID: PMC7017941.]. Клинические проявления обширны, и почти 50% диабетических периферических полинейропатий протекают бессимптомно, что значительно усложняет своевременную диагностику, кроме того, у пациентов с высокой степенью тяжести нейро-ишемических осложнений кратно выше вероятность образования язвы стопы, чем у пациентов без ДПН [Armstrong D.G., Mills J.L. Toward a change in syntax in diabetic foot care: prevention equals remission. J Am Podiatr Med Assoc. 2013 Mar-Apr; 103(2):161-2. doi: 10.7547/1030161. PMID: 23536510].

СД2 имеет сложный мультифакториальный патогенез, который обусловлен комбинацией генетических, а также средовых факторов риска [Kommoju, U.J., Reddy, B.M. Genetic etiology of type 2 diabetes mellitus: a review. Int J Diabetes Dev Ctries 31, 51–64 (2011). https://doi.org/10.1007/s13410-011-0020-8]. Одним из звеньев множественных патологических нарушений, выявляемых при СД2, является стресс эндоплазматического ретикулума (ЭПР) и сопряженная с ним активация клеточного ответа на несвернутые белки (UPR), в том числе инсулина, с последующим развитием апоптоза β-клеток [Ghosh R., Colon-Negron K., Papa F.R. Endoplasmic reticulum stress, degeneration of pancreatic islet β-cells, and therapeutic modulation of the unfolded protein response in diabetes // Mol Metab. 2019. Vol. 27. P. S60-S68. doi: 10.1016/j.molmet.2019.06.012.]. В запуске процесса UPR принимает участие фактор транскрипции теплового шока, кодируемый геном HSF1, который выполняет важнейшую функцию регулятора экспрессии шаперонов при стрессе ЭПР [Wang X., Grammatikakis N., Siganou A., Calderwood S.K. Regulation of molecular chaperone gene transcription involves the serine phosphorylation, 14-3-3 epsilon binding, and cytoplasmic sequestration of heat shock factor 1. Mol Cell Biol. 2003 Sep;23(17):6013-26. doi: 10.1128/MCB.23.17.6013-6026.2003. PMID: 12917326; PMCID: PMC180972.]. Ген HSF1 локализуется в 8 хромосоме и имеет в своей структуре 23,1 тыс. оснований. Согласно ресурсу GTex Portal (https://gtexportal.org), полиморфный вариант rs12542298 гена HSF1 влияет на экспрессию генов в широком спектре тканей, имеющих патогенетическое отношение к развитию ДПН и может быть использован в качестве маркера риска развития данного осложнения сахарного диабета 2 типа.

Известен способ прогнозирования тяжелого течения диабетической периферической полинейропатии у детей и подростков (RU 2 339 955 C1, дата публикации 27.11.2008), включающий определение в периферической крови уровня цилиарного нейротрофического фактора CNTF серологическим методом твердофазного иммуноферментного анализа. Обнаружение в сыворотке крови CNTF 5,8 пкг/мл и ниже свидетельствует о возможности тяжелого течения диабетической дистальной полинейропатии.

Однако данный способ не рассчитан на выявление предрасположенности к развитию ДПН у больных СД2, а может быть использован для прогнозирования тяжести течения диабетической дистальной полинейропатии у детей и подростков с сахарным диабетом 1 типа.

Известен способ прогнозирования тяжелого течения диабетической полинейропатии и развития синдрома диабетической стопы (СДС) (RU 2 687 978 C1, дата публикации 17.05.2019), основанный на исследовании у пациентов с сахарным диабетом сывороточного уровня тропомиозинового рецептора киназы (TrkB) методом твердофазного иммуноферментного анализа, дополнительно определяют уровень гликированного гемоглобина в крови. В последующем высчитывают коэффициент по формуле регрессионной модели K=0,3*HbA1C+0,4*TrkB, где K - коэффициент, 0,3 - константа регрессии, HbAlC - уровень гликированного гемоглобина, 0,4 - константа регрессии, TrkB - сывороточный уровень тропомиозинового рецептора киназы типа В. Коэффициент K>5 свидетельствует о высокой вероятности тяжелого течения диабетической полинейропатии и высоком риске развития синдрома диабетической стопы.

Недостатком метода является то, что он рассчитан на оценку риска тяжелого течения уже имеющейся ДПН и риска развития синдрома диабетической стопы.

Наиболее близок по результату и методу исследования способ прогнозирования риска развития диабетической дистальной полинейропатии у женщин с сахарным диабетом 2 типа на основе генотипирования полиморфизма rs7784465 гена RAC1 (RU 2 787 273 C1, дата публикации 09.01.2023). Способ заключается в заборе образца периферической венозной крови, после которого проводят экстракцию ДНК и анализ полиморфного варианта гена малой ГТФ-азы RAC1 rs7784465 (T>C), и прогнозируют повышенный риск формирования диабетической дистальной полинейропатии у женщин с сахарным диабетом 2 типа в случае выявления аллеля rs7784465-C, а при обнаружении генотипа rs7784465-Т/Т – низкий риск развития диабетической дистальной полинейропатии у женщин с сахарным диабетом 2 типа.

Однако данный способ позволяет установить предрасположенность к диабетической дистальной полинейропатии только у женщин и не может быть применен для всех пациентов с СД2.

Технический результат заключается в получении критериев оценки риска формирования диабетической дистальной полинейропатии у жителей Центральной России с сахарным диабетом 2 типа по данным о генетическом полиморфизме rs12542298 (Т>С).

Технический результат достигается тем, что после экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта гена HSF1 rs12542298 (T>С) и прогнозируют повышенный риск формирования диабетической дистальной полинейропатии у жителей Центральной России с сахарным диабетом 2 типа при выявлении генотипа rs12542298-С/С, а при обнаружении генотипов rs12542298 T/T или T/C – низкий риск развития диабетической дистальной полинейропатии у пациентов с сахарным диабетом 2 типа в популяции Центральной России.

Способ осуществляют следующим образом:

1. Выделение ДНК из периферической венозной крови. На первом этапе к 0,5 мл крови добавляли 0,5 мл PBS и центрифугировали 10 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 200 мкл ТЕ-буфера, пипетировали до растворения осадка и затем последовательно добавляли 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия SDS и 5 мкл протеиназы К. Пробирки инкубировали в термостате при t=37°C 12 ч. В ходе второго этапа проводили четыре последовательных центрифугирования с фенолом и хлороформом согласно протоколу методики (10 мин, 8 тыс. об/мин), после чего ДНК осаждали ледяным раствором 95% этилового спирта и центрифугировали 10 мин при 14,3 тыс. об/мин. По испарении спирта ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной дистиллированной воды. Получаемый раствор ДНК в воде имел чистоту в диапазоне А260/280=1,5-2,0 и среднюю концентрацию около 180-200 нг/мкл.

Экстракция геномной ДНК из цельной крови колоночным методом проводилась с помощью набора QIAamp DNA blood mini kit (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QiaCube (QIAGEN, Германия). Роботизированный протокол продолжительностью 58 минут включал этап лизиса клеток 0,2 мл цельной крови с помощью лизирующего буфера и протеиназы к QIAGEN, инкубирование, перенос лизата в колонку, связывание ДНК с мембраной колонки, центрифугирование, двукратное промывание колонки буфером AW1 и AW2, центрифугирование колонки и, наконец, элюирование очищенной ДНК. Получаемый раствор ДНК в воде имел идеальную чистоту А260/280=1,7-1,9 и среднюю концентрацию около 40-50 нг/мкл. Экстрагированные из крови образцы ДНК хранились в морозильниках Thermo Fisher Scientific (США) при -20°С.

2. Подготовка образцов ДНК к масс-спектрометрическому анализу. Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 10 нг/мкл при А260/280=1,5-2,0.

3. Анализ полиморфизма гена HSF1 - генотипирование методом матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF. Использовали следующие последовательности праймеров: прямой F: 5'- ACGTTGGATGGGGAGTTGGAGGTTTCTTTG -3', обратный R: 5'- ACGTTGGATGCTGAGTGTTAGATTCCATCC -3', праймер удлинения E: 5'-aTGGAGGTTTCTTTGAATATTAGAAAA-3'. Для приготовления ПЦР-микса (в расчете на один спектральный чип) в центрифужную микропробирку вносили 80,6 мкл ddH2O, 50,4 мкл 10x буфера, 40,3 мкл MgCl2 (концентрация 25 ммоль/л), 10,1 мкл смеси дНТФ (концентрация 25 ммоль/л), 100,8 мкл смеси ПЦР-праймеров (концентрация 0,5 мкмоль/л) и 20,16 мкл HotStartTaq полимеразы (концентрация 5 ЕД/мкл). Смесь вортексировали и раскапывали в 96-луночный ПЦР-планшет по 3 мкл в лунку, после чего с помощью восьмиканального дозатора вносили по 2 мкл ДНК (концентрация 10 нг/мкл). Планшет заклеивали, центрифугировали 20 сек при 1000 об/мин и загружали в термоциклер CFX96 Bio-Rad на 125 мин при следующем режиме: денатурация 2 мин при 95°С, амплификация 44 цикла, состоящая из денатурации 30 сек при 95°С, отжига 30 сек при 56°С и элонгации 60 сек при 72°С. После чего пробы инкубировали 5 мин при 72°С. Не прореагировавшие в ходе ПЦР дНТФ удаляли с помощью реакции SAP (shrimp alkaline phosphatase), в ходе которой щелочная фосфатаза креветки гидролизовала дНТФ до нуклеозидов и фосфатов. Для приготовления SAP-микса в микропробирке смешивали 161,6 мкл ddH2O, 18 мкл 10хTS буфера и 31,7 мкл SAP фермента. Далее вносили по 2 мкл SAP-смеси в каждую лунку, планшет заклеивали, центрифугировали 20 сек при 1000 об/мин и загружали в термоциклер CFX96 Bio-Rad на 55 мин при следующем режиме: 45 мин при 37°С и 10 мин при 85°С. Для проведения третьей реакции iPLEX готовили Е-праймер-микс из расчета 8,8 мкл праймеров Е1-Е9, 11,7 мкл праймеров Е10-Е18, 14,6 мкл праймеров Е19-Е27, 17,5 мкл праймеров Е28-Е35 и 45,1 мкл ddH2O. После масс-спектрометрической оценки интенсивности пиков Е-праймеров в полученной смеси, в микс добавляли Е-праймеры в количествах, необходимых для достижения одинаковой интенсивности сигнала. Для приготовления iPLEX-микса в микропробирке смешивали 65,4 мкл ddH2O, 21,2 мкл iPLEX буфера, 21,2 мкл терминирующей смеси, 99,3 мкл Е-праймер-микса и 4,33 мкл iPLEX-фермента, вортексировали и раскапывали в лунки по 2 мкл. Планшет заклеивали, центрифугировали 20 секунд при 1000 об/мин и загружали в термоциклер CFX96 Bio-Rad на 135 мин при следующем режиме: денатурация 30 сек при 94°С, затем 40 циклов, состоящие из денатурации 5 сек при 94°С, отжига 5 сек при 52°С, элонгации 5 сек при 80°С, с последующим инкубированием в течение 3 мин при 72°С. По завершении реакции iPLEX, планшет охлаждали до +4°С, добавляли по 30 мкл воды во все лунки, центрифугировали 1 мин при 1000 об/мин и загружали в масс-спектрометр. Ввиду того, что небольшие полярные молекулы и положительно заряженные катионы натрия и калия могут образовывать аддукты с олигонуклеотидами и создавать серию контаминантных пиков, ампликоны были подвергнуты роботизированному обессоливанию путем их обработки смолой SpectroCLEAN (Agena Bioscience). Перенос образцов на спектральный чип с матрицей для ионизации осуществлялся в автоматическом режиме на рабочей станции Nanodispenser.

Статистические расчеты проводили с помощью программы SNPStats (Solé, X., Guinó, E., Valls, J., Iniesta, R., & Moreno, V. (2006). SNPStats: a web tool for the analysis of association studies. Bioinformatics, 22(15), 1928-1929).

4. Прогнозирование повышенного риска формирования диабетической периферической полинейропатии в случае выявления генотипа rs12542298-С/С и пониженного риска развития этого осложнения сахарного диабета 2 типа при выявлении генотипов rs12542298-T/T или rs12542298-T/C.

Возможность использования предложенного способа для определения риска развития диабетической дистальной полинейропатии у жителей Центральной России подтверждает анализ результатов наблюдений 1408 пациентов с СД2, у 1301 из которых установлена диабетическая дистальная полинейропатия. В исследование включались лица славянской национальности Центральной России. Диагноз СД2 был установлен врачами-эндокринологами ОБУЗ ГК БСМП на основе клинического и лабораторно-инструментального обследования. Установлено, что генотипы rs12542298-T/T и rs1043618-T/С значимо чаще встречался у пациентов без диабетической дистальной полинейропатии (88%) по сравнению с больными СД2, имеющими данное осложнение основного заболевания (73%). Носительство генотипа rs12542298-С/С HSF1 ассоциировалось с повышенным риском развития диабетической дистальной полинейропатии: OR=2,66, 95% CI 1,10-6,45, P=0,01 (таблица 1).

Таблица 1

Ассоциация полиморфного варианта rs12542298 гена HSF1 с диабетической дистальной полинейропатией у пациентов с сахарным диабетом 2 типа

Ген
(SNP ID) Гено-
тип, аллель Больные с СД2, n (%) _adjР¹ _adjOR
(95% CI)² Без ДПН
(n=49) С ДПН
(n=769) HSF1 rs12542298T>С T/T-T/C 43 (87,8) 559 (72,7) 0,01 1,00 C/C 6 (12,2) 210 (27,3) 2,66 (1,10-6,45) С 0,26 0,38 0,02 1,73 (1,08-2,70) ¹Уровень значимости ассоциации с поправками на ковариаты – возраст и индекс массы тела.
²Отношения шансов и 95% доверительный интервал с поправками на ковариаты – возраст и индекс массы тела.
СД2 – сахарный диабет 2 типа. ДПН – диабетическая дистальная полинейропатия.

В качестве примеров конкретного применения разработанного способа приведено генетическое обследование пациентов Центральной России, не являющихся родственниками между собой: проведено генетическое обследование по локусу rs12542298 (Т>С) гена HSF1.

Пациент К., 55 лет, находился на стационарном лечении в ОБУЗ КГКБ СМП г. Курска с 18.07.2020 по 28.04.2020. Диагноз: сахарный диабет, 2 тип, фаза декомпенсации от 18.04.2020, фаза компенсации от 28.04.2020. Индивидуальный целевой уровень HbA1c<7,5%. Целевой уровень гликемии плазмы натощак <7,5 ммоль/л, через 2 ч после еды <10 ммоль/л. У пациента была взята венозная кровь, при генотипировании полиморфного локуса rs12542298 (T>С) был выявлен генотип rs12542298-T/C HSF1, что позволило отнести пациента в группу больных с низким риском развития диабетической дистальной полиполинейропатии. Более углублённое неврологическое обследование не выявило у мужчины диабетическую дистальную полинейропатию.

Пациент Е., 44 года, находилась на стационарном лечении в ОБУЗ КГКБ СМП г. Курска с 25.04.2017 по 05.05.2017. Диагноз: сахарный диабет, 2 тип, фаза компенсации от 05.05.2017. Индивидуальный целевой уровень HbA1c< 7,0%. Целевой уровень гликемии плазмы натощак <7,0 ммоль/л, через 2 ч после еды < 9,0 ммоль/л. Для проведения генетического исследования у пациента была взята венозная кровьв обьеме 5 мл., при генотипировании полиморфного локуса rs12542298 (T>С) был выявлен генотип rs12542298-Т/Т гена HSF1, что позволило отнести пациента в аналогичную группу. Углубленное неврологическое исследование не выявило диабетической дистальной полинейропатии.

Пациент К., 71 год, находился на стационарном лечении в ОБУЗ КГКБ СМП г. Курска с 23.04.2017 по 4.05.2017. Диагноз: сахарный диабет, 2 тип, фаза декомпенсации от 23.04.2017, фаза компенсации от 04.05.2017. Индивидуальный целевой уровень HbA1c<7,5%. Целевой уровень гликемии плазмы натощак <7,5 ммоль/л, через 2 ч после еды <10,0 ммоль/л. У пациента К. была взята венозная кровь, при генотипировании полиморфного локуса rs12542298 (T>С) был выявлен аллель С в составе генотипа С/С HSF1, что позволило отнести пациента в группу больных с высоким риском развития диабетической дистальной полинейропатии. Углубленное неврологическое исследование подтвердило наличие у пациента диабетической дистальной полиполинейропатии.

Применение данного способа позволит на доклиническом этапе формировать среди больных диабетом 2 типа группы риска и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития диабетической дистальной полинейропатии.

Резюме

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что генготип rs12542298-С/С гена HSF1 является генетическим фактором риска развития диабетической дистальной полинейропатии у пациентов с сахарным диабетом 2 типа (OR=2,66).

Использование предложенного способа позволит прогнозировать развитие диабетической дистальной полинейропатии у пациентов с сахарным диабетом 2 типа, что даст возможность осуществлять мероприятия по профилактике дистальной полинейропатии – диспансерное наблюдение, регулярный контроль уровня глюкозы в крови, нормализацию массы тела, достаточную физическую активность, правильное питание с ежедневным включением в рацион свежих овощей и фруктов и ограничением рафинированных углеводов и жиров.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской диагностике, и может быть использовано для прогнозирования риска развития диабетической дистальной полинейропатии у жителей Центральной России с сахарным диабетом 2 типа. Осуществляют забор образца периферической венозной крови. После экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта rs12542298 (T>C) гена семейства белков теплового шока HSF1. В случае выявления генотипа rs12542298-C/С прогнозируют повышенный риск формирования диабетической дистальной полинейропатии. При обнаружении генотипа rs12542298-T/C или rs12542298-T/T прогнозируют низкий риск развития диабетической дистальной полинейропатии. Способ обеспечивает получение новых критериев оценки риска формирования диабетической дистальной полинейропатии у жителей Центральной России с сахарным диабетом 2 типа по данным о генетическом полиморфизме rs12542298 (Т>С). 1 табл., 3 пр.

Способ прогнозирования риска развития диабетической дистальной полинейропатии у жителей Центральной России с сахарным диабетом 2 типа, включающий забор образца периферической венозной крови, отличающийся тем, что после экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта rs12542298 (T>C) гена семейства белков теплового шока HSF1 и прогнозируют повышенный риск формирования диабетической дистальной полинейропатии у жителей Центральной России с сахарным диабетом 2 типа в случае выявления генотипа rs12542298-C/С, а при обнаружении генотипа rs12542298-T/C или rs12542298-T/T – низкий риск развития диабетической дистальной полинейропатии у жителей Центральной России с сахарным диабетом 2 типа.