СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КРЕАТИНФОСФАТА В ТКАНИ МОЗГА (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2008 года по МПК G01N33/70 

Предлагаемая группа изобретений (2 варианта) относится к биохимии, а именно к биоэнергетике, и может использоваться для определения концентрации креатинфосфата (КФ) в ткани мозга животных при комплексном изучении содержания АТФ, АМФ и КФ, а также в случаях, когда нет реактивов для непосредственного определения АМФ и КФ, но имеется возможность для экспериментального определения уровня АТФ.

Креатинфосфат относится к макроэргическим фосфатам. Эта богатая энергией молекула образуется за счет переноса фосфата с макроэргической связью с молекулы АТФ под действием фермента креатинкиназы на креатин.

В мышечной и нервной тканях креатинфосфат служит резервным источником высокоэнергетических фосфатных групп. При отсутствии других источников образования энергии креатинфосфат используется для синтеза АТФ в обратной креатинкиназной реакции.

Определение концентрации креатинфосфата важно для характеристики резервных возможностей мозга, особенно в условиях гипоксии и ишемии.

По количеству креанинфосфата в сочетании с другими макроэргическими фосфатами можно оценивать степень тяжести гипоксии мозга (1, 2).

В настоящее время для определения креатинфосфата в разных тканях (в том числе, в мозге) используются такие общеизвестные методы, как метод Eggleton и метод Фиске-Суббароу.

а) Согласно методу Eggleton определение креатинфосфата производится по количеству креатина, используя цветную реакцию с диацетилом в присутствии - нафтола (3).

б) Креатинфосфат можно определить по содержанию фосфора по методу Фиске-Суббароу после предварительного удаления неорганического фосфата магнезиальной смесью. Фосфор определяют с помощью цветной реакции с молибденовым реактивом (3).

Оба названных метода относятся к биохимическим методам, причем первый метод более специфичен. Но оба метода требуют значительной затраты времени, обязательного использования жидкого азота для фиксации ткани мозга, расхода дорогостоящих и вредных для здоровья реактивов (в частности, диацетила).

По предлагаемому изобретению содержание креатинфосфата определяется расчетным способом по соответствующей математической формуле, поэтому по технической сущности к предлагаемому изобретению аналогов не имеется.

В задачу предлагаемого изобретения положены сокращение времени экспериментальных исследований и экономия реактивов при комплексном изучении содержания АТФ, АМФ и КФ в условиях нормы и циркуляторной гипоксии (ишемии) с разной экспозицией.

Поставленная задача в предлагаемом способе определения содержания КФ в ткани мозга у интактных животных достигается тем, что в ткани мозга любым биохимическим способом определяют содержание аденозинтрифосфата [АТФ], затем рассчитывают содержание адезинмонофосфата [АМФ] по формуле:

у=0,034149587·х³-0,432813644·х²+1,660693169·х-1,627649307,

если концентрация АТФ больше 1,76 мкмоль/г ткани, или

у=-1,766152382·х³-9,797265053·х²-17,480895996·х+10,257653236,

если концентрация АТФ меньше или равна 1,76 мкмоль/г ткани,

где х - концентрация [АТФ], у - концентрация [АМФ],

далее рассчитывают коэффициент к=[АТФ]/[АМФ], затем содержание креатинфосфата рассчитывают по формуле:

z=-0,047053753·к³+1,375335693·к²-13,597908020·к+48,149353027,

где к=[АТФ]/[АМФ], z - содержание [КФ].

Поставленная задача в предлагаемом способе определения содержания КФ в ткани мозга при ишемии достигается тем, что измеряют продолжительность ишемии, затем любым известным биохимическим способом определяют содержание аденозинтрифосфата [АТФ], рассчитывают концентрацию адезинмонофосфата [АМФ] по формуле:

у=ϕ₀(t)·х³+ϕ₁(t)·х²+ϕ₂(t)·х+ϕ₃(t),

где х - концентрация [АТФ], у - концентрация [АМФ],

ϕ₀(t), ϕ₁(t), ϕ₂(t), ϕ₃(t) - коэффициенты, рассчитанные от t-продолжительности ишемии по формуле

ϕ_i(t)=(A2)_i+(A0)_i·cos((A1)_i/t) (i=0, 1, 2, 3), для соответствующих значений А0_i, А1_i, А2_i, указанных в таблице 1, далее рассчитывают коэффициент к=[АТФ]/[АМФ], и по формуле:

z=ϕ₀(t)·к³+ϕ₁(t)·к²+ϕ₂(t)·к+ϕ₃(t),

где к=[АТФ]/[АМФ], ϕ₀(t), ϕ₁(t), ϕ₂(t), ϕ₃(t) - коэффициенты, рассчитанные от t - продолжительности ишемии по формуле

ϕ_i(t)=(A2)_i+(A0)_i·cos((A1)_i/t) (i=0, 1, 2, 3), для соответствующих значений А0_i, А1_i, А2_i, указанных в таблице 2,

z - содержание [КФ],

рассчитывают содержание креатинфосфата [КФ].

При этом используют следующие таблицы 1, 2:

Таблица 1Зависимость концентрации АМФ от содержания АТФ. Значения А0_i, А1_i,А2_i функций ϕ_i(t)=(А2)_i+(A0)_i·Cos((А1)_i/t) для ишемии(AJ)_iА0_iА1_iА2_iϕ_i(t)   ϕ₀(t)-0,56862872477,9-0,2775826ϕ₁(t)-4,8397681226,691,9613424ϕ₂(t)12,2303671274,47-4,7790863ϕ₃(t)3,95622741119,78-1,8941859

Таблица 2Зависимость концентрации креатинфосфата от значений коэффициента к=[АТФ]/[АМФ]. Значения А0_i, А1_i, А2_i функций ϕ_i(t)=(А2)_i+(A0)_i·Cos((A1)_i/t) для ишемии(AJ)_iА0₁A1_iА2_iϕ_i(t)   ϕ₀(t)-0,10651841233,870,0412877ϕ₁(t)1,65665231237,1-0,5539854ϕ₂(t)6,8893122436,782,553528ϕ₃(t)-20,2786792040,993,3016473

В группе свободных адениновых нуклеотидов (АТФ, АМФ, КФ), выполняющих энергетическую и многообразную регуляторную функции, наиболее мобильными, информативными в ткани мозга являются АТФ и АМФ. Содержание АМФ является величиной, отражающей не только состояние окислительных процессов, но и других жизненно важных реакций, происходящих в мозге: гликолиз, новообразование адениновы нуклеотидов, активность ферментов: аденилактиназы, 5¹ - нуклеотидазы, АМФ - дезаминазы. Определение содержания АМФ может быть использовано для оценки проведения антигипоксических мероприятий в экспериментальной медицине.

Большое научно-исследовательское значение имеет одновременное определение содержания АМФ и АТФ. Так, Ньюстон Э. и Старк К. (4) отводят АМФ важную роль в клетке как системе усиления изменений АТФ.

Эта система реализуется за счет аденилаткиназной реакции:

АМФ+АТФ⇔2АДФ.

В научных исследованиях часто используется коэффициент АТФ/АМФ, как показатель энергетического состояния клетки, связанный с окислительными и энергетическими процессами и исполняющий регуляторную роль. По нашим данным (5, 6), коэффициент АТФ/АМФ может служить показателем устойчивости мозга к недостатку кислорода.

В клинической медицине концентрация АТФ и АМФ определяется в крови при различных заболеваниях, исследуются продукты преобразования АМФ, а также влияние на них лекарственных препаратов (7).

В клинической и экспериментальной медицине коэффициет АТФ/АМФ широко используется как показатель влияния антигипоксантов.

Креатинфосфат - богатая энергией молекула, образуется за счет переноса фосфата с макроэргической связью с молекулы АТФ под действием фермента креатинкиназы на креатин.

В мышечной и нервной тканях креатинфосфат служит резервным источником высокоэнергетических фосфатных групп, и в случае необходимости используется организмом для синтеза АТФ.

Концентрация креатинфосфата служит характеристикой резервных возможностей мозга, особенно в условиях гипоксии и ишемии. По количеству креатинфосфата в сочетании с другими макроэргическими фосфатами можно оценить степень тяжести гипоксии мозга.

Ранее в нашей лаборатории был разработан Способ определения концентрации АМФ в биологических тканях (АС N1302198), позволяющий определять концентрации АТФ и АМФ комплексно в условия разных форм гипоксии, в том числе и при ишемии. В указанном способе измеряли время пребывания животного в гипоксическом состоянии, проводили прижизненную фиксацию мозга мгновенным замораживанием, определяли содержание АТФ в ткани мозга любым известным методом, а затем рассчитывали концентрацию АМФ по математической формуле:

у=ϕ₀(t)·x³+ϕ₁(t)·x²+ϕ₂(t)·x+ϕ₃(t),

где ϕ_i(t)=(А2)_i+(A0)_i·cos((A1)_i/t) (i=0, 1, 2, 3),

у - концентрация АМФ,

х - экспериментально полученное содержание АТФ,

А0_i, А1_i, A2_i - эмпирические коэффициенты функций ϕ_i(t), указанные в специальной таблице,

t - значение экспериментально заданного времени пребывания животного в условиях гипоксии.

Авторы данной заявки впервые предлагают определять содержание креатинфосфата по математической формуле, связывающей зависимость эмпирических величин КФ и значений коэффициента АТФ/АМФ в условиях ишемии с разной экспозицией.

В этом случае экспериментально хроматографическим методом определяется концентрация АТФ, а содержание АМФ и КФ рассчитываются по формуле, причем концентрацию АМФ предлагается определить способом, разработанным Хватовой Е.М. и ее соавторами ранее (1987 г.).

Используя математические методы анализа экспериментальных значений концентраций АТФ, АМФ и КФ в условия ишемии (перевязка правой и левой сонных артерий) с разным интервалом времени после операции (от 30 до 240 минут) было установлено, что эмпирическую зависимость между показателями КФ и значениями коэффициента АТФ/АМФ можно аппроксимировать многочленом третьей степени

z=а₀·к³+а₁·к²+а₂·к+а₃,

при различных состояниях организма - в норме и при циркуляторной гипоксии (ишемии) в интервале времени от 30 до 240 минут.

В качестве зависимой переменной рассматривались показатели экспериментальных значений КФ, а независимой переменной "к" являлись значения АТФ/АМФ.

Коэффициенты а₀, a₁, a₂, а₃ многочлена

у=а₀·z³+a₁·z²+a₂·z+а₃ принимали определенные значения в разных экспозициях опыта, поэтому их считали функциями времени пребывания животного в условиях ишемии, то есть а_i=ϕ_i(t), i=0, 1, 2, 3, t - время проводимых экспериментов.

Вид функции ϕ_i(t)=(A2)_i+(А0)_i·cos((A1)_i/t) (i=0, 1, 2, 3) основывался на данных, полученных в эксперименте.

Параметры А0_i, А1_i, А2_i для i=0, 1, 2, 3 находились с использованием итерации.

В результате изменение концентрации КФ в зависимости от значений коэффициента АТФ/АМФ и времени пребывания животных в состоянии гипоксии описывалось уравнением:

z(к,t)=ϕ₀(t)·к³+ϕ₁(t)·к²+ϕ₂(t)·к+ϕ₃(t).

Рассчитанные методом итерации значения параметров А0_i, А1_i, А2_i для каждой функции ϕ₀(t), ϕ₁(t), ϕ₂(t), ϕ₃(1) представлены в таблице 2.

Для интактных животных зависимость концентрации КФ от значений коэффициента АТФ/АМФ имела вид:

z=-0,047053753·к³+1,375335693·к²-13,597908020·к+48,149353027.

Таким образом, сущность предлагаемого метода заключается в выполнении следующих действий в зависимости от условий эксперимента.

Для интактных животных:

1. Берем животное и целиком замораживаем в жидком азоте.

2. Готовим экстракт мозга (с охлаждением) и определяем содержание АТФ хроматографическим методом.

3. Подставляем эти значения [АТФ] в формулу:

у=0,034149587·х³-0,432813644·х²+1,660693169·х-1,627649307,

если концентрация АТФ получилась больше 1,76 мкмоль/г ткани, или в формулу:

у=-1,766152382·х³-9,797265053·х²-17,480895996·х+10,257653236,

если концентрация АТФ меньше или равна 1,76 мкмоль/г ткани, и рассчитываем концентрацию АМФ(у).

4. Рассчитываем значение коэффициента к=х/у=[АТФ]/[АМФ].

5. Подставляем полученное значение "к" в формулу

z=-0,047053753·к³+1,375335693·к²-13,597908020·к+48,149353027,

и рассчитываем "z" - содержание креатинфосфата [КФ].

Для животных в условиях ишемии:

1. Берем животное и подвергаем его циркуляторной гипоксии путем перевязывания правой и левой сонных артерий.

2. Измеряем время после операции - (t).

3. Через заданный промежуток времени животное полностью замораживаем в жидком азоте.

Быстрота фиксации мозга необходима для сохранения уровня АТФ в ткани мозга. Результат считается тем надежнее, чем большее количество АТФ открывается в мозге (Иванова Т.Н., Рубель Л.Н., 1969, Ponten U et al., 1973).

4. Замороженный мозг извлекается и растирается в порошок в ступе с жидким азотом. Навеску ткани берут в предварительно тарированный бокс, содержащий слегка замороженный 10% раствор трихлоруксусной кислоты, приготовленной на 0,5 М ЭДТА из расчета 10 мл/г ткани. Пробу экстрагируют в течение 20 минут и фильтруют через бумажный фильтр. Трихлоруксусную кислоту удаляют трехкратным встряхиванием с двумя объемами серного эфира, насыщенного водой. Следы эфира удаляют аэрацией, экстракт нейтрализуют до рН 7,0-7,4 0,1 н. раствором NaOH. Содержание АТФ определяют любым известным методом. Нами был использован метод клеточной хроматографии на эктеола-целлюлозе в Cl-форме (Иванова Т.Н., Рубель Л.Н., - ж. эволюц. Биохимия и физиология, 1969, т.5, с.279-287). С колонки АТФ элюируется 0,05 н. раствором HCl. Оптическая плотность измеряется на спектрофотометре при длине волны 260-280 нм. Содержание АТФ выражается только в ммолях на 1 г сырой ткани мозга.

5. Выбираем из таблицы 1 значения коэффициентов А0_i, А1_i, А2_i для расчета функций ϕ₀(t), ϕ₁(t), ϕ₂(t), ϕ₃(t).

6. Рассчитываем по формуле

ϕ_i(t)=(А2)_i+(А0)_i·cos((A1)_i/t)

значения

ϕ_i(t), i=0, 1, 2, 3,

при соответствующем значении t после операции.

7. Экспериментальные значения АТФ и рассчитанные величины ϕ₀(t), ϕ₁(t), ϕ₂(t), ϕ₃(t) подставляем в формулу:

у=ϕ₀(t)·x³+ϕ₁(t)·x²+ϕ₂(t)·x+ϕ₃(t)

и вычисляем концентрацию АМФ(у), соответствующую данным условиям опыта.

8. Вычисляем значения коэффициента к=[АТФ]/[АМФ], [АТФ] - экспериментальная величина, [АМФ] - рассчитанная.

9. Выбираем из таблицы 2 значения коэффициентов А0_i, А1_i, А2_i для расчета ϕ₀(t), ϕ₁(t), ϕ₂(t), ϕ₃(t).

10. По формуле

ϕ_i(t)=(А2)_i+(А0)_i·Cos((A1)_i/t) (i=0, 1, 2, 3), рассчитываем ϕ_i(t) для (i=0, 1, 2, 3) при данной экспозиции (t) опыта.

11. Подставляем в формулу

z(к,t)=ϕ₀(t)·к³+ϕ₁(t)·к²+ϕ₂(t)·к+ϕ₃(t) значения z, ϕ₀(t), ϕ₁(t), ϕ₂(t), ϕ₃(t), рассчитанные в пунктах 2.8-2.10, получаем концентрацию креатинфосфата.

Примеры конкретного пользования

1. Группа животных, у которых АТФ>1,76 мкмоль/г ткани.

Пример 1. Крысы АТФ_э=2,08±0,07, АМФ_э=0,27±0,02.

Е.М.Хватова, А.Н.Сидоркина, Г.В.Миронова "Нуклетоиды мозга", М. Медицина, 1987, стр.119 (Хроматографический метод на целлюлозе).

1) Берем интактное животное (крысу весом 170 г) и целиком замораживаем в жидком азоте.

2) Готовим экстракт мозга (с охлаждением) и определяем содержание АТФ хроматографическим методом на эктеола-целлюлозе. Экспериментально установленное содержание АТФ в мозге животного равно 2,08 мкмоль/г ткани.

3) Рассчитываем концентрацию АМФ по формуле:

у=0,034149587·х³-0,432813644·х²+1,660693169·х-1,627649307,

у=0,034149587·(2,08)³-0,432813644·(2,08)²+1,660693169·(2,08)-1,627649307=0,26137752.

Аналитически рассчитанное значение АМФ равно 0,26137752.

Экспериментально установленная концентрация АМФ в мозге крыс в данных условиях равна 0,27±0,02. Ошибка формулы составляет 3,19%.

4) Рассчитываем значение коэффициента к=[АТФ]/[АМФ], получаем 2,08/0,26=8,0.

5) Подставляем значение к=8 в формулу

у=-0,047053753·к³+1,375335693·к²-13,597908020·к+48,149353027 и рассчитываем значения КФ:

у=-0,047053753·8³+1,375335693·8²-13,597908020·8+48,149353027=3,29.

Экспериментальное значение КФ у интактных крыс составляет 3,03±0,18. Ошибка формулы составляет 8%.

Пример 2.

1) Берем интактное животное (кролик весом 2,6 кг).

Производим принужденную фиксацию мозга замораживанием в жидком азоте.

2) Готовим экстракт мозга (с охлаждением) и определяем содержание АТФ хроматографическим методом на эктиола-целлюлозе. Экспериментально установленное содержание АТФ в мозге испытуемого животного равно 1,76 мкмоль/г ткани.

3) Рассчитываем концентрацию АМФ по формуле:

у=1,7661524·х³-9,797265·х²-17,480896·х+10,2576532,

у=-1,7661524·(1,76)³-9,797265·(1,76)²-17,480896-0,76)+10,2576532=0,2106178.

Аналитически рассчитанное значение АМФ равно 0,2106178. Экспериментально установленная концентрация АМФ в мозге равна 0,22±0,019. Ошибка формулы составляет 4,36%.

4) Рассчитываем значение коэффициента к=[АТФ]/[АМФ], получаем 1,78/0,22=8,38.

5) Выбираем соответствующую формулу

z=-0,047053753·к³+1,375335693·к²-13,597908020·к+48,149353027 и рассчитываем значения КФ:

z=-0,047053753·(8,38)³+1,375335693·(8,38)²-13,597908020·(8,38)+48,149353027=3,08.

Экспериментальное значение КФ у интактных кроликов составляет 2,53±0,14. Если сравнить с 2,53, ошибка формулы составляет 21%. Если сравнить с 2,67, ошибка формулы составляет 15%.

6) Для другого случая концентрация АТФ экспериментальная получилась 1,74 мкмоль/г ткани, тогда:

Расчетная концентрация АМФ составляет:

у=-1,7661524·(1,74)³-9,797265·(1,74)²-17,480896·(1,74)+10,2576532=0,16.

7) Расчетное значение коэффициента к=[АТФ]/[АМФ], получаем 1,74/0,16=10,87.

8) Выбираем соответствующую формулу для вычисления содержания КФ, получаем:

у=-0,047053753·(10,87)³+1,375335693·(10,87)²-13,597908020·(10,87)+48,149353027=2,41.

Экспериментальное значение КФ у интактных кроликов составляет 2,53±0,14. Если сравнить с 2,53, ошибка формулы составляет 4%.

2. Животные в состоянии ишемии.

Пример 3.

1) Берем животное (крысу весом 180 г), даем легкий эфирный наркоз, делаем перевязку правой и левой сонных артерий.

2) Измеряем время пребывания животного в условиях ишемии - 240 мин.

3) Крысу целиком быстро замораживаем в жидком азоте.

4) Готовим экстракт мозга (с охлаждением) и определяем содержание АТФ хроматографическим методом на эктеола-целлюлозе. Экспериментально установленное содержание АТФ в мозге животного равно 2,13 мкмоль/г ткани.

5) Выбираем из таблицы 1 значения коэффициентов А0_i, А1_i, А2_i для соответствующего расчета функций ϕ₀(t), ϕ₁(t), ϕ₂(t), ϕ₃(t).

6) Рассчитываем по формуле ϕ_i(t)=(А2)_i+(А0)_i·cos((A1)_i/t)

(i=0, 1, 2, 3) соответствующие значения ϕ_i(t) при (i=0, 1, 2, 3).

a) ϕ₀(t) при t=240 минут,

А0=-0,5686278,

A1=2477,9,

А2=-0,2775826.

ϕ₀(t)=-0,2775826-0,5686278·cos(2477,9/240)=-0,0759685.

б) ϕ₁(t) при t=240 минут, значения коэффициентов:

А0=-4,8439768,

A1=1266,69,

А2=1,9613424.

ϕ₁(t)=1,9613424-4,8439768·cos(1266,69/240)=-0,6341911.

в) ϕ₂(t) при t=240 минут, значения коэффициентов:

А0=12,230367,

A1=1274,47,

А2=-4,7790863.

ϕ₂(t)=-4,7790863+12,230367·cos(1274,47/240)=2,1055218.

г) ϕ₃(t) при t=240 минут, значения коэффициентов:

А0=3,9562274,

A1=1119,78,

А2=-1,8941859.

ϕ₃(t)=-1,8941859+3,9562274·cos(1119,78/240)=-2,0786.

7) Экспериментальные значения АТФ и рассчитанные значения функций ϕ₀(t), ϕ₁(t), ϕ₂(t)_, ϕ₃(t) подставляем в формулу и вычисляем концентрацию АМФ(у), соответствующую данным условиям опыта (перевязка правой и левой сонных артерий, время после операции t=240 минут).

у=0,0759685·(2,13)³-0,6341911·(2,13)²+2,1055218·(2,13)-2,0786=0,2629956.

Аналитически рассчитанное значение концентрации АМФ равно 0,2629956. Экспериментально установленная концентрация АМФ в мозге крыс в данных условиях равна 0,25±0,04.

8) Рассчитываем значение коэффициента к=[АТФ]/[АМФ], получаем 2,13/0,26=8,19.

9) Выбираем из таблицы 2 значения коэффициентов A0_i, A1_i, A2_i для соответствующего расчета функций ϕ₀(t), ϕ₁(t), ϕ₂(t), ϕ₃(t).

10) Рассчитываем по формуле ϕ_i(t)=(А2)_i+(А0)_i·cos((A1)_i/t)

(i=0, 1, 2, 3) соответствующие значения ϕ_i(t) при (i=0, 1, 2, 3).

a) ϕ₀(t) при t=240 минут, значения коэффициентов:

А0=-0,1065184,

A1=1233,87,

A2=0,0412877.

ϕ₀(t)=0,0412877-0,1065184·cos(1233,87/240)=-0,02994.

б) ϕ₁(t) при t=240 минут, значения коэффициентов:

А0=1,656523,

A1=1237,1,

А2=-0,5539854.

ϕ₁(t)=-0,5539854+1,656523·cos(1237,1/240)=0,154936.

в) ϕ₂(t) при t=240 минут, значения коэффициентов:

А0=6,882312,

A1=2436,78,

А2=2,553528.

ϕ₂(t)=2,553528+6,882312·cos(2436.78/240)=-2,587225.

г) ϕ₃(t) при t=240 минут, значения коэффициентов:

А0=-20,278679,

A1=2040,99,

А2=3,301647.

ϕ₃(t)=3,301647-20,278679·cos(2040,99/240)=15,576342.

11) Подставляем в формулу

z(к,t)=ϕ₀(t)·к³+ϕ₁(t)·к²+ϕ₂(t)·к+ϕ₃(1) значения к, ϕ₀(t), ϕ₁(t), ϕ₂(t), ϕ₃(t), рассчитанные в пунктах 8, 9, получаем аналитически рассчитанную концентрацию креатинфосфата:

z=-0,02994·8,19³+0,154936·8,19²-2,587225·8,19+15,576342=3,14.

Экспериментально полученное значение креатинфосфата в этих условиях значения 2,93±0,40. Если сравнить с показателем 2,93 то ошибка формулы составляет 7%. Если сравнить с правым концом экспериментального интервала концентраций КФ - 3,33, то ошибка составляет 5%.

Пример 4.

1) Берем животное (крысу весом 200 г), даем легкий эфирный наркоз, делаем перевязку правой и левой сонных артерий.

2) Измеряем время пребывания животного в условиях ишемии - 30 мин.

3) Крысу целиком быстро замораживаем в жидком азоте.

4) Готовим экстракт мозга (с охлаждением) и определяем содержание АТФ хроматографическим методом на эктиола-целлюлозе. Экспериментально установленное содержание АТФ в мозге животного равно 1,53 мкмоль/г ткани.

5) Выбираем из таблицы 1 значения коэффициентов A0_i, A1_i, A2_i для соответствующего расчета функций ϕ₀(t), ϕ₁(t), ϕ₂(t), ϕ₃(t).

6) Рассчитываем по формуле ϕ_i(t)=(А2)_i+(А0)_i·cos((А1)_i/t) (i=0, 1, 2, 3) соответствующие значения ϕ_i(t) при (i=0, 1, 2, 3).

a) ϕ₀(t) при t=30 минут,

А0=-0,5686278,

A1=2477,9,

A2=-0,2775826.

ϕ₀(t)=-0,2775826-0,5686278·cos(2477,9/30)=-0,6242101.

б) ϕ₁(t) при t=30 минут, значения коэффициентов:

А0=-4,8439768,

A1=1266,69,

А2=1,9613424.

ϕ₁(t)-1,9613424-4,8439768·cos(1266,69/30)=2,8690309.

в) ϕ₂(t) при t=30 минут, значения коэффициентов:

А0=12,230367,

A1=1274,47,

A2=-4,7790863.

ϕ₂(t)=-4,7790863+12,230367·cos(1274,47/30)=-3,9134944.

г) ϕ₃(t) при t=30 минут, значения коэффициентов:

А0=3,9562274,

А1=1119,78,

А2=-1,8941859.

ϕ₃(t)=-1,8941859+3,9562274·cos(1119,78/30)-1,7898451.

7) Экспериментальные значения АТФ и рассчитанные значения функций ϕ₀(t), ϕ₁(t), ϕ₂(t), ϕ₃(t) подставляем в формулу

у=ϕ₀(t)·x³+ϕ₁(t)·x²+ϕ₂(t)·x+ϕ₃(t),

и вычисляем концентрацию АМФ(у), соответствующую данным условиям опыта - (перевязка правой и левой сонных артерий, время после операции t=30 минут).

у=-0,6242101·(1,53)³+2,8690309·(1,53)²-3,9134944·(1,53)+1,7898451=0,2826566.

Аналитически рассчитанное значение концентрации АМФ равно 0,2826566. Экспериментально установленная концентрация АМФ в мозге крыс в данных условиях равна 0,26±0,04. Ошибка формулы 14,83%.

8) Рассчитываем значение коэффициента к=[АТФ]/[АМФ], получаем 1,53/0,28=5,46.

9) Выбираем из таблицы 2 значения коэффициентов А0_i, А1_i, А2_i для соответствующего расчета функций ϕ₀(t), ϕ₁(t), ϕ₂(t), ϕ₃(t).

10) Рассчитываем по формуле ϕ_i(t)=(А2)_i+(А0)_i·cos((A1)_i/t)

(i=0, 1, 2, 3) соответствующие значения ϕ_i(t) при (i=0, 1, 2, 3).

a) ϕ₀(t) при t=30 минут, значения коэффициентов:

А0=-0,1065184,

A1=1233,87,

A2=0,0412877.

ϕ₀(t)=0,0412877-0,1065184·cos(1233,87/30)=0,143410073.

б) ϕ₁(t) при t=30 минут, значения коэффициентов:

А0=1,656523,

А1=1237,1,

А2=-0,5539854.

ϕ₁(t)=-0,5539854+1,656523·cos(1237,1/30)=-2,082455594.

в) ϕ₃(t) при t=30 минут, значения коэффициентов:

А0=6,882312,

A1=2436,78,

А2=2,553528.

ϕ₂(t)=2,553528+6,882312·cos(2436,78/30)=8,74069.

г) ϕ₃(t) при t=30 минут, значения коэффициентов:

А0=-20,278679,

А1=2040,99,

А2=3,301647.

ϕ₃(t)=3,301647-20,278679·Cos(2040,99/30)=-6,219793.

11) Подставляем в формулу

z(к,t)=ϕ₀(t)·к³+ϕ₁(t)·к²+ϕ₂(t)·к+ϕ₃(t) значения к, ϕ₀(t), ϕ₁(t), ϕ₂(t), ϕ₃(1), рассчитанные в пунктах 8, 9, получаем аналитически рассчитанную концентрацию креатинфосфата:

z=0,143410073·5,46³-2,082455594·5,46²+8,74069·5,46-6,219793=3,14.

Экспериментально полученное значение креатинфосфата в этих условиях значения 3,23±0,21. Если сравнить с показателем 3,23, то ошибка формулы составляет 14,36%. Если сравнить с левым концом предлагаемого интервала концентраций КФ - 3,02, то ошибка составляет 8,4%.

Обобщенные результаты

Таблица 3Значения концентраций креатинфосфата, рассчитанные предлагаемым способом.Условия опытаЭкспериментальные значения [АТФ]Экспериментальные значения [АМФ]Расчетные значения [АМФ]Расчетные значения [КФ]Экспериментальные значения [КФ]Ошибка формулыИнтактные животные2,08±0,07 (крысы)0,27±0,02 (крысы)по АТФ=2,08 0,26137752 (крысы)3,293,03±0,18 (крысы)средняя 5,8% 1,76±0,06 (кролики)0,22±0,019 (кролики)по АТФ=1,76 0,2106178 (кролики)3,08; 2,412,53±0,14 (кролики)средняя 10,9%Ишемия через 30 мин (крысы)1,4±0,130,26±0,04по АТФ=1,532,773,23±0,21средняя 11% р<0,001 0,286566   Ишемия через 90 мин (крысы)*2,08±0,070,27±0,030,261377523,292,92±0,4средняя 6,8%Ишемия через 4 часа (крысы)2,13±0,090,25±0,040,26299563,142,93±0,4средняя 6%* Примечание: В данном опыте значения концентраий АТФ, АМФ и КФ адекватны интактным животным, поэтому в этом случае для расчета КФ предлагаемым способом использовался вариант 1.

Преимущества предлагаемого способа заключаются в том, что предлагаемый способ значительно облегчает комплексное исследование АТФ, АМФ, КФ и является по существу первым специфическим способом комплексного исследования этих нуклеотидов. В настоящее время из-за отсутствия таких специфических способов комплексное исследование сводится к отдельному определению каждого нуклеотида, что практически увеличивает затраты времени и реактивов. В предлагаемом способе рассчитываются концентрации АМФ и КФ по содержанию АТФ, поэтому в случае комплексного исследования АТФ, АМФ и КФ экспериментальный замер АМФ и КФ совсем исключается, за счет чего и достигаются экономия реактивов и сокращение времени исследований. Конкретное выражение этой экономии зависит от методики, применяемой для определения содержания АТФ.

В таблица 4 и 5 приведен экономический расчет экспериментального времени и расходование реактивов при комплексном определении содержания АТФ, АМФ, КФ известными (хроматографическим) и предлагаемым способами.

Таблица 4Экономический расчет экспериментального времени при комплексном определении содержания АТФ, АМФ, КФ известными и предлагаемым способами.Этапы экспериментаЭкспериментальное время, затраченное на комплексное определение содержания АТФ, АМФ и КФИзвестные методы (мин)Предлагаемый способ (мин)1.Выделение мозга и приготовление экстракта30302. Подготовка реактивов90303. Хроматографическое распределение на колонке90454.Спектрофотометрическая регистрация нуклеотидов и расчет20105. Гидролиз креатинфосфата до креатина30-6. Цветная реакция на креатин30-7. Работа на фотоэлектрокалориметре20-8. Математический расчет концентрации АМФ и КФ-6

Таблица 5Экономический расчет используемых реактивов при комплексном определении содержания АТФ, АМФ, КФ известными и предлагаемым способами.ПриемыКоличество реактивов, необходимых для для комплексного определения содержания АТФ, АМФ и КФИзвестные методы (%)Предлагаемый способ (%)1. Определение содержания АТФ50502. Определение содержания АМФ25-3.Определение концентрации КФ25-Всего:10050Примечание: Для определение АМФ и АТФ хроматографическим методом используются следующие реактивы: эктеола-целлюлоза, АМФ и АТФ (для приготовления стандартных растворов), соляная кислота, ацетон, трихлоруксусная кислота, ЭДТА, эфир, раствор NaOH. Для определения КФ требуется диацетил и 1% α-нафтал.

Литература

1. Хватова Е.М., Сидоркина А.Н., Миронова Г.В. Нуклеотиды мозга. - М.: Медицина, 1987. - С.130.

2. А.С. СССР N1020777, МКИ G01N 33/48.

3. Практикум по биохимии Под ред. С.Е.Северина и Г.А.Соловьевой, Изд. Московский университет, 1989, стр.189-190.

4. Ньюстон Э., Старк К. Регуляция метаболизма - М.: Мир, 1977. - С.360.

5. Шуматова Е.Н., Миронова Г.В., Варыпаева Н.С. Значение окислительных ферментов в регуляции энергетического метаболизма мозга при кратковременных тренировках к гипоксии / В кн.: Дегидроиназы в норме и при патологии, Горький, 1980. - С.43-50.

6. Сидоркина А.Н., Якобсон Л.И., Ваулина В.А. Предварительные гипобарические тренировки при острой ишемии мозга / В кн.: Дегидроиназы в норме и патологии. Горький, 1980. - С.51-57.

7. Микулис Р.И., Богач Н.Т. Взаимосвязь между клиническими особенностями ишемической болезни сердца и обменом адениннуклеотидов. - Клиническая медицина, 1982. - С.39-44.

8. Киреев М.М., Конвай В.Д., Корпачев В.Г. Нуклетоидный фонд головного мозга крыс в восстановительном периоде после реанимации / Вопросы медицинской химии. - 1980, N2. - С.158-162.

9. Лызлова С.Н., Тааме Н., Стефанов В.Е., Южакова Г.А. О влиянии АМФ и пирофосфата на активность креатинкиназы / В кн.: Структурные основы и регуляция биологической подвижности. - Москва, 1980. - С.108-111.

10. Хватова Е.М., Миронова Г.В., Швец Н.А., Сероглазова Г.С. Макроэргические фосфаты головного мозга в условиях гипоксии / Вопросы медицинской химии. - 1976, N4. - С.493-497.

11. Хватова Е.М., Сидоркина А.Н., Якобсон Л.И., Ваулина В.А. Метаболические основы ранних стадий ишемии мозга / В кн.: Проблемы профилактической ангионевралгии. - Горький, 1981. - С.19-23.

12. Четверикова Е.П., Розанова П.А. Ингибиторы креатинкиназы (гликолитические интермедиаты, нуклетоиды и неорганический фосфат) - Докл. АН СССР, 1976, т.231. - С.1263-1266.

13. Bertman L., Siesio B.K. Brain energy metabolism and circulation in gipoxia. - In: European Society ofNeurohem. 2-nd Meet. Proceedings. Weinheim. - New York, 1978. p.253-265.

14. Баев В.М., Друкина М.А. Содержание адениновых нуклетоидов и креатинфосфата в тканях головного мозга, миокарда, печени и скелетных мышц при совместном воздействии гиперкапнией, гипоксией и охлаждением / Украинский биохимический журнал, 1978, т.50. - С.150-154.

15. Гостева С.В. Влияние гистотоксической гипоксии на некоторые показатели энергетического обмена и скорость включения в фосфолипиды мозга крыс / В кн.: Биохимия гипоксии. - Горький, 1975. - С.36-38.

16. Hermsen E, et al. Rapid assay of myocardial adenine nucleotides and creatine compounds with HPLC. - J.Mol. and Coll. Cardiol, 1961, v.l3. - P.56.

17. А.С. СССР N1020777, МКИ G01N 33/48. Определение степени тяжести гипоксии мозговой ткани.

18. А.С. СССР N1302198, МКИ G01N 33/48. Способ определения адезинмонофосфата в ткани мозга.

Изобретение относится к области медицины, а именно к биоэнергетике, и может быть использовано для определения креатинфосфата (КФ) в ткани мозга. Сущность способа: в ткани мозга экспериментальных животных любым известным биохимическим методом определяют содержание аденозинтрифосфата (АТФ). Затем, по соответствующим математическим формулам рассчитывают содержание КФ в ткани мозга. Использование способа позволяет определить АТФ, аденозинмонофосфата (АМФ) и КФ в ткани мозга в условиях нормы и циркуляторной гипоксии с разной экспозицией. 2 н.п.ф-лы, 5 табл.

1. Способ определения содержания креатинфосфата - [КФ] - в ткани мозга у интактных животных, включающий биохимические исследования, отличающийся тем, что в мгновенно замороженной ткани мозга любым биохимическим способом определяют содержание аденозинтрифосфата [АТФ], затем рассчитывают содержание адезинмонофосфата [АМФ] по формуле:

y=0,034149587·х³-0,432813644·x²+1,660693169·x-1,627649307,

если концентрация АТФ больше 1,76 мкмоль/г ткани, или

y=-1,766152382·х³-9,797265053·x²-17,480895996·x+10,257653236,

если концентрация АТФ меньше или равна 1,76 мкмоль/г ткани,

где х - концентрация [АТФ], у - концентрация [АМФ],

далее рассчитывают коэффициент к=[АТФ]/[АМФ,] затем содержание креатинфосфата рассчитывают по формуле:

z=-0,047053753·к³+1,375335693·к²-13,597908020·к+48,149353027,

где к=[АТФ]/[АМФ], z - содержание [КФ].

У=ϕ₀(t)·x³+ϕ₁(t)·x²+ϕ₂(t)·x+ϕ₃(t),

где х - концентрация [АТФ], у - концентрация [АМФ],

ϕ₀(t), ϕ₁(t), ϕ₂(t), ϕ₃(t) - коэффициенты, рассчитанные от

t - продолжительности ишемии по формуле ϕ_i(t)=(A2)_i+(A0)_i·Cos((A1)_i/t)(i=0, 1, 2, 3), для соответствующих значений А0_i, А1_i, А2_i, указанных в таблице 1,

далее рассчитывают коэффициент к=[АТФ]/[АМФ], и по формуле:

z=ϕ₀(t)·к³+ϕ₁(t)·к²+ϕ₂(t)·к+ϕ₃(t),

где к=[АТФ]/[АМФ], (ϕ₀(t), ϕ₁(t), ϕ₂(t), ϕ₃(t) - коэффициенты рассчитанные от t - продолжительности ишемии по формуле:

ϕ_i(t)=(A2)_i+(A0)_i·Cos((A1)i/t) (i=0, 1, 2, 3), для соответствующих значений А0_i, A1_i, A2_i, указанных в таблице 2,

z - содержание [КФ],

рассчитывают содержание креатинфосфата [КФ],

при этом используют таблицу 1 и 2:

Таблица 1(AJ)_iA0_iA1_iA2_iϕ_i(t)   ϕ₀(t)-0,56862872477,9-0,2775826ϕ₁(t)-4,8397681226,691,9613424ϕ₂(t)12,2303671274,47-4,7790863ϕ₃(t)3,95622741119,78-1,8941859Таблица 2(AJ)_iA0_iA1_iA2_iϕ_i(t)   ϕ₀(t)-0,10651841233,870,0412877ϕ₁(t)1,65665231237,1-0,5539854ϕ₂(t)6,8893122436,782,553528ϕ₃(t)-20,2786792040,993,3016473