Способ определения аденозинтрифосфата в мозге экспериментальных животных Советский патент 1990 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к биохимии, а именно к биоэнергетике, и может быть использовано в экспериментальной медицине для определения концентрации аденозинтрифосфата (АТФ) в ткани мозга при комплексном исследовании функциональной активности митохондрий и эффективности процессов окислительного фосфорилирования в мозге.

i

Цель изобретения - ускорение способа при одновременном повышении его функциональных возможностей.

Способ осуществляется следующим образом.

Из мозга экспериментальных животных методом дифференциального центрифугирования выделяют митохондрии и методом Лоури определяют содержание

общего белка. Скорость потребления кислорода в суспензии митохондрий измеряют полярографически в среде, содержащей 0,25 М сахарозы, 15 мМ КС1, 20 мМ , 10 мМ трис-HCl (рН 7,4) 10 мМ пирувата + 5 мМ сукцината, после добавления 300 мкМ аденозиндифос- фата (АДФ).

При нормоксии по полученному значению (АДФ/t) определяют концентрацию АТФ по формуле

,012471-х + 1,875228, (1) где х - скорость использования введенного АДФ (АДФ/t); у - концентрация АТФ,

Если требуется определить концентрацию АТФ в ткани мозга в условиях гипоксии, дополнительно измеряют высоту (или степень разрежения атмосферного давления) и время пребывания в условиях гипоксии (t). В этом случае концентрацию АТФ рассчитывают по формуле:

(t).x + if,(t),

(2)

a (t), Cf, (t), зависящие от t, рассчитывают по формуле

(t)A2+A.

At cos--,

(3)

где А ,А., А. - эмпирические коэффициенты, зависящие, от h.

При этом при м (31 0 мм рт. ст.) используют табл.2, а при м (270 мм рт.ст.) табл. 3.

Способ поясняется следующими примерами.

П р и м е р 1 (для интактных животных в условиях нормоксии).

1.Из ткани мозга интактного животного (кролик) выделяют митохондри методом дифференциального центрифугирования.

2.Определяют содержание общего белка методом Лоури.

3.Готовят среду инкубации следующего состава, моль: сахароза 0,25; КС1 0,015; КК2Р04 0,02; трис-HCl 0,01. В качестве субстратов окислени используют смесь сукцината (5 ммоль) и пирувата натрия О 0 ммоль).

4.Определяют скоростью фосфорили рования добавленного АДФ (АДФ/t) полярографическим методом.

В инкубационную среду добавляют митохондриальную фракцию в объеме 0,1 мл (в среднем содержание белка 3,0-3,5 мг). Затем проводят стандартную добавку АДФ в количестве

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

300 мкмоль, после чего немедленно регистрируют увеличение скорости потребления кислорода (переход в состояние 3). Утилизация в процессе дыхания добавленного АДФ вызывает состояние дефицита АДФ, что сопровождается последующим переходом в состояние 4.

5.На полярограмме измеряется время фосфорилирования добавленного АДФ и рассчитывается скорость утилизации АДФ в единицу времени (1 с). Скорость утилизации АДФ рассчитывается

в мкмоль АДФ/мг белка/с АДФ/t . Экспериментально полученная величина АДФ/t равна 3,0 мкмоль АДФ/мг белка/с.

6.В формулу ,012471-х +

+ 1,875228 подставляют 3,0 и рассчитывают концентрацию АТФ/у/, выраженную в мкмоль на 1 г ткани, соотнесенную к мкмоль АДФ/мг белка/с

,0124713 + 1,875228 1,912541.

Экспериментально установленная концентрация АТФ 1,92±0,072. Ошибка формулы составляет 0,42%.

II р и м е р 2 (для интактных животных в условиях нормоксии).

1.Из ткани мозга интактного животного (крысы) выделяют митохондрии методом дифференциального центрифугирования.

2.Определяют содержание общего белка методом Лоури.

3.Готовят среду инкубации следующего состава, моль: сахароза 0,25; КС1 0,015;

0,01.

В качестве субстратов окисления используют смесь сукцината (5 ммоль) и пирувата натрия (10 ммоль).

4.Определяют скорость фосфорилирования добавленного АДФ (АДФ/t) полярографическим методом.

В инкубационную среду добавляют митохондриальную фракцию в объеме 0,1 мл (в среднем содержание белка 3,0-3,5 мг). Затем проводят стандартную добавку АДФ в количестве 300 мкмоль, после чего сразу же регистрируют увеличение скорости потребления кислорода (переход в состояние 3). Утилизация в процессе дыхания добавленного АДФ вызывает состояние дефицита АДФ, что сопровождается последующим переходом в состояние 4.

5.На полярограмме измеряется время фосфорилирования добавленного АДФ и рассчитывается скорость утилизации

0,02; трис-HCl

515499246

АДФ в единицу времени (1 с). Скорость7 0,1533123-3,56+1,1602122

утилизации АДФ рассчитывается ,7060039. мкмоль АДФ/мг белка/с/АДФ/t/.Экспериментально установленная

Экспериментально полученная вели-концентрация АТФ 1,71±0,056. Ошибка

чина АДФ/t равна 1,91 мкмоль АДФ/мгформулы составляет 0,23%. белка/с.П р и м е р 4 (гипоксия 8000 м,

6. В формулу ,01 ,875228атм.давл. 270 мм рт.ст.). подставляют 1,91 и рассчитывают кон-1. Берут экспериментальное животцентрацию АТФ/t/, выраженную (кролик), помещают в проточную

мкмоль/г ткани, соотнесенную к мкмольбарокамеру и поднимают на высоту

АДФ/мг белка/с.8000 м.

,124711,91 + 1,875228 2. Выдерживают на данной высоте

1,8990476.240 мин.

Экспериментально установленная153. Выделяют митохондрии и опредеконцентрация АТФ 2,0810,07. Ошибкаляют АДФ/t полярографическим методомформулы составляет 8,7%. см. в примере 1, п.1,2,3,4,5. ЭкспеII р и м е р 3 (гипоксия м,риментально полученная величина АДФ/t

что соответствует атмосферному давле-равна 3,75 мкмоль АДФ/мг белка/с. нию 310 мм рт.ст.). 20 4. Из табл. 2 выбирают значения

Берут экспериментальное животноекоэффициентов А0,А,Аг, соответствую (кролик), помещают в проточную баро-щие функциям ) и Ч Д -) камеру и поднимают на высоту 7000 м.5. Расчитывают значения функций

Выдерживают на данной высоте 30 мин.(с) и ) по ФоРмУле

Выделяют митохондрии и определяют 25,А ,. .

АДФ/t полярографическим методом - см.(t)-A2+A0 cos-- U-0,1),

в примере 1 п.1,2,3,4,5. Эксперимен-вместо t подставляют 240 мин.

тально полученная величина АДФ/t рав-Получаем

на 3,56 мкмоль АДФ/мг белка/с.для ((t) ,2224712; А Из табл. 1 выбирают значения коэф- ,408; ,2607522;

фициентов А0,А{,Аг, соответствующиеСр0(240 )0,2607522-0,222471 2 функциям (Pn(t) и 0,(t).Юа 408

Рассчитают значения функций xcos 0, 2607522-0,222471 2

(f0(t) и tJ,(O по формуле Cf ;(t) А2+А0 xQ, 906856 0,2607522-0, 201 7493

xcos- (,1), вместо t подставляют ,05900.9;

tдля q,(t) ,6105218;,А, 1Ю,121;

30 мин..9167529;

Для расчета функций Cf;(t) значение(240)0,9167529+0,6105218 t - время пребывания животного в сое-110 121

тоянии гипоксии- выражается в минутах.4Qxcos2 0 0,9167529+0,6105218

Для lf0(t),6640566; А,хО,89656Ь 1,4641272. 76,644; ,8825736. Cf0(30( )-1 ,«825736 + 1 ,664056b 6. Значения функций (2401 ),

176,644 . оопс-,0л . С.С.1ЫС.С.С1, (240), экспериментальное значе«со8- --1,3825736+1,бб40Ьббх Д (х) подставляют в формулу

0,922977 -1 ,3825736+1 ,5358859 И Расчитывают у - концентрацию

АТФ, выраженную в мкмоль на 1 г тка on moc А чел /ни соотнесенную к мкмоль АДФ/t/Mr

, lЈ Q ,8069735; ,4; 3-i™ i oo-UcQc / оплота 181i4 n ,0590029-(3,75) + 1,4641272 ,(30 )5,8333595-4,8069735-cos- g- 50 6353380

5,8333595-4,8069735-0,97216 Экспериментально установленная

5,8333595-4,6731473 1,1602122.концентрация АТФ 1,70±0,066. Ошибка

Значения функций (30 ), Ср,(30 ),формулы составляет 0,86%. экспериментальное значение АДФ/t(х)В табл. 3 отражено соответствие

подставляют в формулу (1) и рассчи-данных, полученных по известному

тывают у - концентрацию АТФ, выражен-способу и изобретению, ную в мгмоль на 1 г ткани, соотне-Изобретение позволяет сократить

сенную к мгмоль АДФ/мг белка/с.в 2 раза время определения и одновременно определить содержание АТФ и величину АДФ/t, характеризующую свойства митохондрий моря, т.е. расширить функциональные возможности способа.

Формула изобретения

1.Способ определения аденозин- трифосфата в мозге экспериментальных животных путем забоя животного, выделения и гомогенизации мозга с последующим биохимическим исследованием гомогената, отличающий- с я тем, что, с целью ускорения способа при одновременном повышении его информативности, из гомогената выделяют митохондрии, поляро- графически. определяют скорость потребления кислорода в присутствии аденозиндифосфата, а содержание аде- нозинтрифосфорной кислоты рассчитывают по скорости использования адено зинтрифосфата.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что, с целью определения аденозинтрифосфата при нормок- сии, расчет ведут но формуле

5

0

5

,012471«х+1,875228, где у - концентрация аденозинтрифосфата;

х - скорость использования аденозиндифосфата;

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что, с целью определения концентрации аденозинтрифосфата в условиях высотной гипоксии, дополнительно определяют высоту подъема и время пребывания животных в условиях гипоксии, а содержание аденозинтрифосфата рассчитывают по формуле

(t)x+(f,(t), г

где у - содержание аденозинтрифосфата; х - скорость использования аденозиндифосфата;t - время; Cf0(t),

(pt(t) - зависимые от времени функции, которые рассчитывают по формулам

1р;(О Аг+А0 cos (,1),

где А ,А{,АЈ- эмпирические коэффициенты, значения которых зависят от высоты. Таблица 1

Изобретение относится к биохимии, а именно к способам определения АТФ в ткани мозга. Цель изобретения - упрощение способа при одновременном расширении его функциональных возможностей. Цель достигается тем, что из ткани мозга выделяют митохондрии, определяют скорость использования введенного АДФ (аденозинтрифосфата) АДФ/T, а концентрацию АТФ рассчитывают по величине АДФ/T. В условиях нормоксии расчет ведут по формуле Y=0,012471^.X+1,875228, где X - скорость использования введенного АДФ (АДФ/T), а Y - концентрация АТФ. При определении концентрации АТФ в условиях высотной гипоксии дополнительно измеряют высоту подъема H, время T пребывания животных в условиях дефицита кислорода, а концентрацию АТФ рассчитывают по выражению Y=φ₀(T)X+φ_I(T), где X - скорость использования введенного АДФ (АДФ/T)

φ₁(T), φ₁(T) - рассчитанные по формуле (2) значения функций φ_I(T), зависящих от T

Y - концентрация АТФ. φ_I(T) = A₂+A₀^.COS A₁/T, где A₀, A₁, A₂ - эмпирические коэффициенты, значения которых зависят от H. Изобретение позволяет быстро определить содержание АТФ в мозге и одновременно характеристику митохондрий - значение АДФ/T в условиях нормоксии и гипоксии.

Интактные

Кролики 3,00+0,141,92+0,072 1,9126410,42

57

Крысы 1,91 + 0,,08+0,071,8990476 8,7

ТаблицаЗ