Изобретение относится к биохимии, а именно к биоэнергетике, и может быть использовано в экспериментальной медицине для определения концентрации аденозинтрифосфата (АТФ) в ткани мозга при комплексном исследовании функциональной активности митохондрий и эффективности процессов окислительного фосфорилирования в мозге.
i
Цель изобретения - ускорение способа при одновременном повышении его функциональных возможностей.
Способ осуществляется следующим образом.
Из мозга экспериментальных животных методом дифференциального центрифугирования выделяют митохондрии и методом Лоури определяют содержание
общего белка. Скорость потребления кислорода в суспензии митохондрий измеряют полярографически в среде, содержащей 0,25 М сахарозы, 15 мМ КС1, 20 мМ , 10 мМ трис-HCl (рН 7,4) 10 мМ пирувата + 5 мМ сукцината, после добавления 300 мкМ аденозиндифос- фата (АДФ).
При нормоксии по полученному значению (АДФ/t) определяют концентрацию АТФ по формуле
,012471-х + 1,875228, (1) где х - скорость использования введенного АДФ (АДФ/t); у - концентрация АТФ,
Если требуется определить концентрацию АТФ в ткани мозга в условиях гипоксии, дополнительно измеряют высоту (или степень разрежения атмосферного давления) и время пребывания в условиях гипоксии (t). В этом случае концентрацию АТФ рассчитывают по формуле:
(t).x + if,(t),
(2)
a (t), Cf, (t), зависящие от t, рассчитывают по формуле
(t)A2+A.
At cos--,
(3)
где А ,А., А. - эмпирические коэффициенты, зависящие, от h.
При этом при м (31 0 мм рт. ст.) используют табл.2, а при м (270 мм рт.ст.) табл. 3.
Способ поясняется следующими примерами.
П р и м е р 1 (для интактных животных в условиях нормоксии).
1.Из ткани мозга интактного животного (кролик) выделяют митохондри методом дифференциального центрифугирования.
2.Определяют содержание общего белка методом Лоури.
3.Готовят среду инкубации следующего состава, моль: сахароза 0,25; КС1 0,015; КК2Р04 0,02; трис-HCl 0,01. В качестве субстратов окислени используют смесь сукцината (5 ммоль) и пирувата натрия О 0 ммоль).
4.Определяют скоростью фосфорили рования добавленного АДФ (АДФ/t) полярографическим методом.
В инкубационную среду добавляют митохондриальную фракцию в объеме 0,1 мл (в среднем содержание белка 3,0-3,5 мг). Затем проводят стандартную добавку АДФ в количестве
0
5
0
5
0
5
0
5
0
5
300 мкмоль, после чего немедленно регистрируют увеличение скорости потребления кислорода (переход в состояние 3). Утилизация в процессе дыхания добавленного АДФ вызывает состояние дефицита АДФ, что сопровождается последующим переходом в состояние 4.
5.На полярограмме измеряется время фосфорилирования добавленного АДФ и рассчитывается скорость утилизации АДФ в единицу времени (1 с). Скорость утилизации АДФ рассчитывается
в мкмоль АДФ/мг белка/с АДФ/t . Экспериментально полученная величина АДФ/t равна 3,0 мкмоль АДФ/мг белка/с.
6.В формулу ,012471-х +
+ 1,875228 подставляют 3,0 и рассчитывают концентрацию АТФ/у/, выраженную в мкмоль на 1 г ткани, соотнесенную к мкмоль АДФ/мг белка/с
,0124713 + 1,875228 1,912541.
Экспериментально установленная концентрация АТФ 1,92±0,072. Ошибка формулы составляет 0,42%.
II р и м е р 2 (для интактных животных в условиях нормоксии).
1.Из ткани мозга интактного животного (крысы) выделяют митохондрии методом дифференциального центрифугирования.
2.Определяют содержание общего белка методом Лоури.
3.Готовят среду инкубации следующего состава, моль: сахароза 0,25; КС1 0,015;
0,01.
В качестве субстратов окисления используют смесь сукцината (5 ммоль) и пирувата натрия (10 ммоль).
4.Определяют скорость фосфорилирования добавленного АДФ (АДФ/t) полярографическим методом.
В инкубационную среду добавляют митохондриальную фракцию в объеме 0,1 мл (в среднем содержание белка 3,0-3,5 мг). Затем проводят стандартную добавку АДФ в количестве 300 мкмоль, после чего сразу же регистрируют увеличение скорости потребления кислорода (переход в состояние 3). Утилизация в процессе дыхания добавленного АДФ вызывает состояние дефицита АДФ, что сопровождается последующим переходом в состояние 4.
5.На полярограмме измеряется время фосфорилирования добавленного АДФ и рассчитывается скорость утилизации
0,02; трис-HCl
515499246
АДФ в единицу времени (1 с). Скорость7 0,1533123-3,56+1,1602122
утилизации АДФ рассчитывается ,7060039. мкмоль АДФ/мг белка/с/АДФ/t/.Экспериментально установленная
Экспериментально полученная вели-концентрация АТФ 1,71±0,056. Ошибка
чина АДФ/t равна 1,91 мкмоль АДФ/мгформулы составляет 0,23%. белка/с.П р и м е р 4 (гипоксия 8000 м,
6. В формулу ,01 ,875228атм.давл. 270 мм рт.ст.). подставляют 1,91 и рассчитывают кон-1. Берут экспериментальное животцентрацию АТФ/t/, выраженную (кролик), помещают в проточную
мкмоль/г ткани, соотнесенную к мкмольбарокамеру и поднимают на высоту
АДФ/мг белка/с.8000 м.
,124711,91 + 1,875228 2. Выдерживают на данной высоте
1,8990476.240 мин.
Экспериментально установленная153. Выделяют митохондрии и опредеконцентрация АТФ 2,0810,07. Ошибкаляют АДФ/t полярографическим методомформулы составляет 8,7%. см. в примере 1, п.1,2,3,4,5. ЭкспеII р и м е р 3 (гипоксия м,риментально полученная величина АДФ/t
что соответствует атмосферному давле-равна 3,75 мкмоль АДФ/мг белка/с. нию 310 мм рт.ст.). 20 4. Из табл. 2 выбирают значения
Берут экспериментальное животноекоэффициентов А0,А,Аг, соответствую (кролик), помещают в проточную баро-щие функциям ) и Ч Д -) камеру и поднимают на высоту 7000 м.5. Расчитывают значения функций
Выдерживают на данной высоте 30 мин.(с) и ) по ФоРмУле
Выделяют митохондрии и определяют 25,А ,. .
АДФ/t полярографическим методом - см.(t)-A2+A0 cos-- U-0,1),
в примере 1 п.1,2,3,4,5. Эксперимен-вместо t подставляют 240 мин.
тально полученная величина АДФ/t рав-Получаем
на 3,56 мкмоль АДФ/мг белка/с.для ((t) ,2224712; А Из табл. 1 выбирают значения коэф- ,408; ,2607522;
фициентов А0,А{,Аг, соответствующиеСр0(240 )0,2607522-0,222471 2 функциям (Pn(t) и 0,(t).Юа 408
Рассчитают значения функций xcos 0, 2607522-0,222471 2
(f0(t) и tJ,(O по формуле Cf ;(t) А2+А0 xQ, 906856 0,2607522-0, 201 7493
xcos- (,1), вместо t подставляют ,05900.9;
tдля q,(t) ,6105218;,А, 1Ю,121;
30 мин..9167529;
Для расчета функций Cf;(t) значение(240)0,9167529+0,6105218 t - время пребывания животного в сое-110 121
тоянии гипоксии- выражается в минутах.4Qxcos2 0 0,9167529+0,6105218
Для lf0(t),6640566; А,хО,89656Ь 1,4641272. 76,644; ,8825736. Cf0(30( )-1 ,«825736 + 1 ,664056b 6. Значения функций (2401 ),
176,644 . оопс-,0л . С.С.1ЫС.С.С1, (240), экспериментальное значе«со8- --1,3825736+1,бб40Ьббх Д (х) подставляют в формулу
0,922977 -1 ,3825736+1 ,5358859 И Расчитывают у - концентрацию
АТФ, выраженную в мкмоль на 1 г тка on moc А чел /ни соотнесенную к мкмоль АДФ/t/Mr
, lЈ Q ,8069735; ,4; 3-i™ i oo-UcQc / оплота 181i4 n ,0590029-(3,75) + 1,4641272 ,(30 )5,8333595-4,8069735-cos- g- 50 6353380
5,8333595-4,8069735-0,97216 Экспериментально установленная
5,8333595-4,6731473 1,1602122.концентрация АТФ 1,70±0,066. Ошибка
Значения функций (30 ), Ср,(30 ),формулы составляет 0,86%. экспериментальное значение АДФ/t(х)В табл. 3 отражено соответствие
подставляют в формулу (1) и рассчи-данных, полученных по известному
тывают у - концентрацию АТФ, выражен-способу и изобретению, ную в мгмоль на 1 г ткани, соотне-Изобретение позволяет сократить
сенную к мгмоль АДФ/мг белка/с.в 2 раза время определения и одновременно определить содержание АТФ и величину АДФ/t, характеризующую свойства митохондрий моря, т.е. расширить функциональные возможности способа.
Формула изобретения
1.Способ определения аденозин- трифосфата в мозге экспериментальных животных путем забоя животного, выделения и гомогенизации мозга с последующим биохимическим исследованием гомогената, отличающий- с я тем, что, с целью ускорения способа при одновременном повышении его информативности, из гомогената выделяют митохондрии, поляро- графически. определяют скорость потребления кислорода в присутствии аденозиндифосфата, а содержание аде- нозинтрифосфорной кислоты рассчитывают по скорости использования адено зинтрифосфата.
2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что, с целью определения аденозинтрифосфата при нормок- сии, расчет ведут но формуле
5
0
5
,012471«х+1,875228, где у - концентрация аденозинтрифосфата;
х - скорость использования аденозиндифосфата;
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что, с целью определения концентрации аденозинтрифосфата в условиях высотной гипоксии, дополнительно определяют высоту подъема и время пребывания животных в условиях гипоксии, а содержание аденозинтрифосфата рассчитывают по формуле
(t)x+(f,(t), г
где у - содержание аденозинтрифосфата; х - скорость использования аденозиндифосфата;t - время; Cf0(t),
(pt(t) - зависимые от времени функции, которые рассчитывают по формулам
1р;(О Аг+А0 cos (,1),
где А ,А{,АЈ- эмпирические коэффициенты, значения которых зависят от высоты. Таблица 1
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КРЕАТИНФОСФАТА В ТКАНИ МОЗГА (ВАРИАНТЫ) | 2006 |
|
RU2340903C2 |
Способ определения аденозинмонофосфата в ткани мозга | 1985 |
|
SU1302198A1 |
Способ определения управляющих коэффициентов подсистем окисления и фосфорилирования системы окислительного синтеза АТФ | 1989 |
|
SU1634718A1 |
Способ получения препарата митохондрий головного мозга | 1990 |
|
SU1745258A1 |
СПОСОБ КОРРЕКЦИИ МЕТАБОЛИЗМА В ТКАНЯХ ПРИ ГИПОКСИИ | 1995 |
|
RU2123850C1 |
СРЕДСТВО НОРМАЛИЗАЦИИ ЭНЕРГЕТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В ТКАНЯХ ОРГАНИЗМА В УСЛОВИЯХ ГИПОКСИИ | 2001 |
|
RU2190416C1 |
Способ индивидуального подбора фармакологических препаратов при терапии психических заболеваний | 1986 |
|
SU1406485A1 |
Способ оценки функционального состояния митохондрий | 1988 |
|
SU1668945A1 |
СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ ПРИРОДНЫХ ФОСФОЛИПИДОВ | 2008 |
|
RU2367443C1 |
Способ определения активности ферментов,синтезирующих или разлагающих аденозинтрифосфат | 1982 |
|
SU1070166A1 |
Изобретение относится к биохимии, а именно к способам определения АТФ в ткани мозга. Цель изобретения - упрощение способа при одновременном расширении его функциональных возможностей. Цель достигается тем, что из ткани мозга выделяют митохондрии, определяют скорость использования введенного АДФ (аденозинтрифосфата) АДФ/T, а концентрацию АТФ рассчитывают по величине АДФ/T. В условиях нормоксии расчет ведут по формуле Y=0,012471.X+1,875228, где X - скорость использования введенного АДФ (АДФ/T), а Y - концентрация АТФ. При определении концентрации АТФ в условиях высотной гипоксии дополнительно измеряют высоту подъема H, время T пребывания животных в условиях дефицита кислорода, а концентрацию АТФ рассчитывают по выражению Y=φ0(T)X+φI(T), где X - скорость использования введенного АДФ (АДФ/T)
φ1(T), φ1(T) - рассчитанные по формуле (2) значения функций φI(T), зависящих от T
Y - концентрация АТФ. φI(T) = A2+A0.COS A1/T, где A0, A1, A2 - эмпирические коэффициенты, значения которых зависят от H. Изобретение позволяет быстро определить содержание АТФ в мозге и одновременно характеристику митохондрий - значение АДФ/T в условиях нормоксии и гипоксии.
Интактные
Кролики 3,00+0,141,92+0,072 1,9126410,42
57
Крысы 1,91 + 0,,08+0,071,8990476 8,7
ТаблицаЗ
Ещенко Н.Д | |||
Методы биохимических исследований | |||
Л.: Наука, 1982, с | |||
Ножевой прибор к валичной кардочесальной машине | 1923 |
|
SU256A1 |
Авторы
Даты
1990-03-15—Публикация
1987-06-15—Подача