Способ определения аденозинмонофосфата в ткани мозга Советский патент 1987 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к биохимии, а именно к биоэнергетике, и может использоваться для определения концентрации аденозинмонофосфата (АМФ) при комплексном изучении содержания аденозинтрифосфата (АТФ),

Цель изобретения упрощение способа за счет сокращения числа стадий при комплексном определении аденеи- ловых нуклеотидов.

Способ осуществляют следующим образом.

Проводят прижизненную фиксацию мозга мгновенным замораживанием, определяют содержание АТФ в ткани мозга любым известным методом, а затем рас считывают концентрацию AM) по математической формуле

Х + If- х + tfj- X +

% , (1) 20

где у - концентрация АМФ; к - концентрация АТФ;

U UJ о 1 i 1 ,

4j , постоянные величины,

В случае применения предлагаемого способа у интактных животных функции 0 % з принимают постоянные значения, указанные в табл,1.

Таблица I

Примечание, Атмосферное давление 270-290 мм рт.ст.

Пр одолже ние т абл.1

В случае применения предлагаемого спос:оба при гипоксическом воздействии требуется дополнительное действие - измерение времени пребывания животного в гипоксическом состоянии и расчет переменной функции Ч- (t) по эмпирическим коэффициентам А ,А „А , выбранным из соответствующих таблиц. При этом формула принимает вид:

у f,(t)x + 4(t)x + f(t)x +

+ 4, (t),(2)

где 4(t) A + A cos(-),, ,1, 2, 3);

у - концентрация М1Ф;

X - экспериментально полученное содержание АТФ; А,,А - эмпирические коэффициенты функции ч. (xt)s указанные в таблицах;

t - время пребывания в состоянии гипоксии.

Значения А , А , для функций If. (t) при гипобарической гипоксии представлены в табл,2 и 3, при ище- мии - в табл, 4,

Таблица 2

Пример I. Берут интактное животное (крысу весом 170 г) и целиком замораживают в жидком азоте. Замороженный мозг извлекают и растирают в порошок в ступке с жидким азотом. Навеску ткани берут в предварительно тарированный бюкс, содер- жащий слегка замороженный 10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты, приготовленньй на 0,5 М ЭДТА из расчета 10 мл/г ткани. Пробу экстрагируют в .течение 20 мин и фильтруют через бумажный фильтр, Трихлоруксус- ную кислоту удаляют трехкратным встряхиванием с двумя объемами серного эфира} насыщенного водой. Следы эфира удаляют аэрацией. Экстракт нейтрализуют до рН 7,0 - 7,4 0,1 н, раствором NaOH. Содержание АТФ определяют любым известным методом. В данном случае использован метод

колоночной хроматографии на эктеола- целлюлозе в СР-форме.С колонки АТФ элюируется 0,05 н, раствором НС1. Затем конечную концентрацию HCf доводят до 1,0 н. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при длине волн 260-290 нм. Содержание АТФ выражают в мкМ на 1 г сырой ткани мозга. Экспериментально установленное содержание АТФ в мозгу испытуемого животного равно 2,08 мкМ/г. Выбирают из табл,1 значения функций 4(t), ), 4,,(t), (t и подставляют в формулу (1),

Рассчитывают концентрацию АМФ: у 0,26137752. Аналитически рассчи- танное значение концентрации АМФ равно 0,26137752. Экспериментально установленная концентрация АМФ в мозгу крыс в данных условиях равна 0,27tO,02, Ошибка формулы составля ет 3,19%.

Пример 2, Берут интактное животное (кролик весом 2,6 кг). Про

Таблица 4

5

5

0

п

изводят прижизненную фиксацию мозга замор йживанием в жидком азоте. Готовят экстракт мозга (с охлаждением) и определяют содержание АТФ хромато- графическим методом на эктесла-цел- люлозе. Экспериментально установленное содержание АТФ в мозгу испытуемого животного равно 1,76 мкМ/г. Выбирают из табл,1 значения функций ),(t), Ч (г), (t) и подстав-. ляют в формулу, Рассчитывают концентрацию АМФ: у 0,2106-178. Аналитически рассчитанное значение концентрации АМФ равно 0,7.106178. Экспериментально установленная концентрация АМФ в мозгу равна 0,22 tO,019. Ошибка формулы составляет 4,26%.

4.(t) А -- А

cos(-).

(3)

где у - содержание АТФ;

X - концентрация АМФ;

t - время, мин; А.,А,. А - коэффициенты линии регрессии

i(t).

Пример 3. Помещают животное, (кролик весом 2,7 кг) в проточную барокамеру, путем разрежения воздуха достигают атмосферного давления 270 мм рт.ст,, что соответствует высоте 8000 м. Измеряют время пребьша-- кия животного на высоте 8000 м - 15 мин. После извлечения животного из барокамеры производят прижизненную фиксацию мозга замораживанием в жидком азоте. Готовят экстракт мозга (с охлаждением) и определяют содержание АТФ хроматографическим методом . на эктеола-целлюлозе. Экспериментально установленное содержание АТФ в мозгу испытуемого животного равно 1,45 мкМ/г. Выбирают из табл.3 значения коэффициентов А,А,А для соответствующего расчета функций if,(t), , (t), (t), fз(t), Рассчи- тывают по формуле -(г) А. +

t- A .- cos(-- ) соответствующие значения 4.(t), i 0,1,2,3, ,

Рассчитьгоают Ч (t) при t 15 .

0

Значения коэффициентов A

-0,258331; A , -621,79449; A

-3,348475; M (t) 3,5598801,

Рассчитывают ((t) при t 15 .

Значения коэффициентов A -1,252948; A/ 621,79449; A ,, 15,955927; 4, (t) -14,930578.

Рассчитывают Ч (t) при t 15 „ Значения коэффициентов 1,760388; A, 621 79449; Aj 22,551407; 1р,{г) 21.,1107§ 4.

Рассчитывают ) при t 15. Значения коэффициентов A 0,815949 A 621,79449; A, 9,061891; M jCt) -9,7296228.

Экспериментальное значение АТФ и рассчитанные значения функций f(t)j , (t), ) t) подставляют в формулу (2) и вычисляют концентрацию АМФ, соответствующую данным услосоотве тствуюпие значения ,-(1), i 0,1 ,2,3, „(t) при t 60 ,

с Значения коэффициентов А

0,394186; А„ 139; А 0,263980 fo(t) -0,00351895, Ч, (t) при t 60.

Значения коэффициентов А,

0 13,548997; А 358,15; -12,8015555 Ч, (t) 0,084896. t) при t 60 ,

Значения коэффициентов А -22,472298; А, 353,58; Aj

f5 20,7481861 M j (t) -0,035071.

Ч-дСг) при t 60 .

I Значения коэффициентов А 8.956371; А 410,81; АЗ --7,567743; (t) 0,0031848,

20 Экспериментальное значение АТФ рассчитанные значения функций о ( Ц Дг), VjCt), 4 (t) подставляют в формулу (2) и вычисляют концентрацию АМФ, соответствующую данным

ВИЯМ опыта (степень разрежения атмо- 25 условиям опыта (степень разрежения

сферы в барокамере соответствует 8000 м, время пребывания животного в барокамере 15), у f(,(t)x + + ,(t)x + %(t)x -t- 4-(1); X 1,45 . (t) 3,559880 ; , (t) -14,930578; (t} 21,110794| 4,j(t) -9,7296228. у 0,342228,

- Аналитически рассчитанное значени концентрации АМФ равно 0,342228,

Экспериментально установленное количество АМФ в мозгу животного в данных условиях опыта равно 0,351 0,044. Ошибка формулы составляет 2,2%.

Пример 4. Помещают животное (кролик весом 2,8 кг) в проточную барокамеру, путем разрежения воздуха достигают атмосферного давления

Пример 5. Берут животное (крысу весом 180 г)} дают легкий эфирный наркоз, делают перевязку пра вой и левой сонных артерий. Измеряю время пребывания животного в услови310 мм рт.ст., что соответствует высоте 7000 м. Измеряют время пребыва- 45 ях ищемии - 240 мин,, Крысу целиком ния животного на высоте 7000 м (60 быстро замораживают в жидком азоте. мин). После извлечения животного из барокамеры производят прижизненную фиксацию мозга замораживанием в жидком азоте. Готовят экстракт мозга (с охлаждением) и определяют содержание АТФ хроматографич.еским методом на эктеола-целлюлозе. Экспериментально установленное содержание АТФ в

мозгу испытуемого животного равно 55 соответствующего расчета функций 1,85 мкМ/г. Выбирают из табл. 2 значе- ,(t). г(} - РассчиГотовят экстракт мозга (с охлаждением) и определяют содержание АТФ хроматографическим методом на экте- 50 ола-целлюлозе. Экспериментально установленное содержание АТФ в мозгу испытуемого животного равно 2513 мкМ/г , Е ыбирают из табл,4 значения коэффициентов А, А. А для

ния коэффициентов А,А jA для соответствующего расчета функций 4(t)p (t), (t), Рассчитывают

тывают по формуле 4,(t) А - А

л ;cos(--) соответствут-ошие значения

f6l

по формуле Ч, (с) А,,. + А„ со5(-)

соотве тствуюпие значения ,-(1), i 1 0,1 ,2,3, „(t) при t 60 ,

с Значения коэффициентов А

0,394186; А„ 139; А 0,263980; fo(t) -0,00351895, Ч, (t) при t 60.

Значения коэффициентов А,

0 13,548997; А 358,15; -12,8015555 Ч, (t) 0,084896. t) при t 60 ,

Значения коэффициентов А -22,472298; А, 353,58; Aj

f5 20,7481861 M j (t) -0,035071.

Ч-дСг) при t 60 .

Значения коэффициентов А 8.956371; А 410,81; АЗ --7,567743; (t) 0,0031848,

0 Экспериментальное значение АТФ рассчитанные значения функций о () Ц Дг), VjCt), 4 (t) подставляют в формулу (2) и вычисляют концентрацию АМФ, соответствующую данным

атмосферы в барокамере соответствует 7000 м, время пребывания животного в барокамере t 60 ): у f(t)x + + P,(t)x2 + fJt)x + ); X 1,85 f„(t) -0,003518у5; Ч Дг) 0,084896; .,(t) -0,35071; 4(t) 0,0031848; у 0,20605645.

Аналитически рассчитанное значение концентрации АМФ равно 0,20605645.

Экспериментально установленное количество А(Ф в мозгу животного в данных условиях опыта равно 0,191: ±0,027, Ошибка-формулы 8,45%.

Пример 5. Берут животное (крысу весом 180 г)} дают легкий эфирный наркоз, делают перевязку правой и левой сонных артерий. Измеряют время пребывания животного в условиях ищемии - 240 мин,, Крысу целиком быстро замораживают в жидком азоте.

ях ищемии - 240 мин,, Крысу целиком быстро замораживают в жидком азоте.

Готовят экстракт мозга (с охлаждением) и определяют содержание АТФ хроматографическим методом на экте- ола-целлюлозе. Экспериментально установленное содержание АТФ в мозгу испытуемого животного равно 2513 мкМ/г , Е ыбирают из табл,4 значения коэффициентов А, А. А для

соответствующего расчета функций ,(t). г(} - Рассчитывают по формуле 4,(t) А - А

л ;cos(--) соответствут-ошие значения

713

(t), i 0.1,2,3. -jt) при t 240 .

Значения коэффициентов A -0,5686278; A 2477,9; (t)

0,0759685. M,(t) при t 240 . Значения коэффициентов Ар -4,8439768; A 1266,69; A2 1,9613424; 4-, (t) -0,6341911 . 4,(t) при t 240. Значение коэф- фициентов АО 12,230367; A, 1274,47; A -4,7790863; 4(t) 2,1055218. з(г) при t. 240. Значения коэффициентов AC 3,9562274; A, 1119,78; A -1,8941859; ,М з(г) -2,078633Г. Экспериментальное значение АТФ и рассчитанные значения функций Ч д(г), Ч ,(t), (t), Jt) подставляют в формулу (2) и вычисляют концентрацию АМФ, соответствующую данным условиям опыта (перевязка правой и левой сонных артерий; время после операции t 240 ) у .0,2629956. .

Аналитически рассчитанное значе- ние концентрации АМФ равно 0,2629956

Экспериментально установленное количество АМФ в мозгу животного в данных условиях опыта равно 0,25 t tOj04. Ошибка формулы составляет 5,2%.

Редактор Н.Тупица 3aKa3f 1212/44

Составитель Н.Гуляева

Техред И.Пспович . Корректор с.Шекмар

Тираж 777Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная,4

988

Формула изобретения

1. Способ определения аденозин- монофосфата в ткани мозга путем исследования мгновенно замороженной ткани, о тличающийся тем, что, с целью упрощения способа за счет сокращения числа стадий при комплексном определении аденеиловых нуклеотидов, в ткани мозга измеряют содержание концентрации аденозинтри- фосфата, а концентрацию аденозинмоно- фосфата определяют по формуле:

У Ч-,

.

Ч . X +

3

о 1 2где у - концентрация аденозинмонофосфата;

X - концентрация аденозинтрифос- фата;

Ч - постоянные величины.

2. Способ поп.1,отличаю- .щ и и с я тем, что, с целью определения аденозинмонофосфата в мозге в условиях гипоксии, дополнительнр измеряют время пребывания животного в условиях гипоксии и по содержанию аденозинтрифосфата с учетом вреьвени пребывания в условиях гипоксии определяют концентрацию аденозинмонофосфата.

Изобретение относится к биохимии, а именно к биоэнергетике, предназначено для определения концентрации аденозинмонофосфата (АМФ) при компл ексном изучении аденозинтрифосфа- та (АТФ) .Цель изобретения - упрощение способа путем сокращения числа стадий при определении аденеиловых нуклеоти- дов.Для этого определяют АТФ в ткани мозга, рассчитывают концентрацию АМФ по математической формуле у Ч„ х + + X + 4, X + Ч з , где у - концентрация АМФ; X - концентрация АТФ; f , f , Ч , Ч з - постоянные величины. В случае применения способа при гипо- ксическом воздействии нужно дополнительное действие - измерение времени (t) пребывания животного в гипокси- ческом состоянии и по содержанию АТФ с учетом t пребывания в условиях гипоксии определяют концентрацию АМФ, 4 табл., 1 з.п.ф-лы. S сл со о ю со оо